Diterpene Glycosides from the Aerial Parts of Inula britannica var. chinensis Regel

금불초 지상부의 Diterpene 배당체 성분

Abstract

Five ent-kaurane type diterpene glycosides were isolated from the aerial parts of Inula britannica var. chinensis Regel (Compositae) through repeated column chromatography. Their chemical structures were elucidated as 16β-H-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (1), 16β-hydroxy-17-acetoxy-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (2), 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (3), 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (4) and 17-O-β-D-glucopyranosyl-16β-H-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (5), respectively, by spectroscopic analysis. Among these compounds, 1-4 were isolated for the first time from this plant.

금불초(Inula britannica var. chinensis Regel)는 국화과 (Compositae)에 속하는 높이 20-60 cm까지 자라는 다년 초로 전국의 산기슭이나 습지에서 자란다. 줄기는 곧게 서고 털이 있다. 잎몸은 길이가 5-10cm이며, 너비는 1-3 cm로 자루가 없고 기부는 어느 정도 줄기를 감싼다. 꽃은 7-9월에지름 3-4 cm의 크기로 줄기 상부에 노란색 두상화로 핀다. 수과는 길이 1 mm로 털이 있고 관모는 길이 약 5 mm 정도의 연한 회갈색이다.1) Inula속 식물에 대한 연구로는 sesquiterpene, diterpene, triterpene, steroid, polysaccharide 및 flavonoid 화합물들이 보고되어 있다.2-5) 금불초를 비롯한 Inula속 식물의 두상화는 예로부터 선복화(旋覆花)라하여 기침, 천식, 가래 등을 치료하는데 사용되어 왔다.6) 금불초의 약리학적 연구는 금불초 물추출물의 과산화수소로 유도된산화적 스트레스와 미토콘드리아의 기능장애에 대한 신경치료 효과, 7) 본 식물에서 분리한 sesquiterpene lactone의 세포독성 및 암세포에 대한 apoptosis 효과, 8, 9) 등이 발표되어있다. 본 연구는 금불초의 고극성 부분의 식물화학적 성분연구의 일환으로 진행하였으며, methanol 추출물의 ethyl acetate 및 butanol 가용분획에서 몇 가지 반복적인 column chromatography를 실시하여 5종의 화합물을 단리하고, 이들 화합물의 spectral data로부터 그 구조를 확인·동정하였기에 이를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 − 본 실험에 사용한 금불초의 지상부는 2019년 9월에 전북 정읍군에서 채취하였으며, 연구자가 정확히 감정한 후에 음건한 후 세절하여 실험에 사용하였다(WSU-19- 010).

시약 및 기기 − 분리한 화합물의 구조분석을 위해 Jeol JMN-EX 400 spectrometer(Japan)를 이용하여 NMR 자료를 확보하였다. 추출 및 분획용 시약과 TLC 및 column용 시약은 1급 용매를 재증류하여 사용하거나 특급시약을 사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Art. 1.07734, 230-400 mesh, Merck)을, molecular sieve column chromatography용 packing material은 Sephadex LH-20(GE Healthcare, Sweden)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254(Art. 1.07752, Merck, USA), low pressure liquid chromatography(LPLC)용 column은 Lobar-A Lichroprep Si 60(Merck, USA) column을, prep-HPLC용 column은 JAI GS-310 column(Tokyo, Japan)을 사용하였다. 발색시약은 10% H2SO4(in EtOH) 시액을 사용하였으며, UV의 검색은 254와 365 nm를 병행하였다.

추출 및 분리 − 지상부를 채집하여 음건 세절한 금불초 약 500g을 methanol로 가끔 진탕하면서 5시간씩 50oC에서 3회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압 농축하여 methanol 엑스 약 95g을 얻었으며, 이 methanol 엑스에 증류수 500 ml를 가하여 현탁시키고 상법에 따라 동량의 n- hexane(11g), methylene chloride(6g), ethyl acetate(3.5g) 및 n-butanol(8g)의 순으로 용매 분획하였다. TLC를 이용한 각 분획의 양상을 254 nm의 UV와 10% H2SO4으로 발 색 시켜 관찰한 결과 뚜렷한 반점을 나타낸 ethyl acetate 및 butanol 가용분획을 대상으로, Sephadex LH-20을 사용한 molecular sieve column chromatography와 silica gel column chromatography 및 Lobar-A Lichroprep Si 60 column을 사용한 low pressure liquid column chromatography 등을 반복 실시하여 화합물을 정제하였다.

먼저 ethyl acetate 가용분획을 methanol을 이동상으로 Sephadex LH-20 column을 통과시켜 7개의 분 획(E1-E7)으로 나누었다. 그 중 E1분획을 CHCl3-MeOH-H2O(60:10:1)을 유출 용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 7개의 소 분획(E11-E17)을 얻었다. 소분획 E13을 n-hexane-EtOAc- MeOH(3:2:1)을 유출용매로 Lobar-A Lichroprep Si 60 column chromatography로 정제하여 화합물 1(15 mg)과 2(12 mg)를확보하였다. 또한, 소분획 E16을 n-hexane-EtOAc-MeOH(3:2:1) 을 유출용매로 Lobar-A Lichroprep Si 60 column chromatography 로 정제하여 화합물 3(7 mg)과 4(12 mg)를 각각 얻었다.

Butanol 가용분획은 methanol을 이동상으로 Sephadex LH-20 column을 통과시켜 6개의 분획(B1-B6)으로 나누었으며, 그 중 B1분획을 CHCl3-MeOH-H2O(40:10:1)을 유출 용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 7개의 소 분획(B11-B17)을 얻었다. 소분획 B15를 CHCl3-MeOH- H2O(30:20:1)을 유출용매로 Lobar-A Lichroprep Si 60 column chromatography와 JAI GS-310 column을 이용한 HPLC로 정제하여 화합물 5(25 mg)를 확보하였다.

화합물 1− A amorphous powder, 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 1.20 (3H, s, H-18), 0.89 (3H, s, H-20), 5.40 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1’), 3.83 (1H, dd, J=12.4 Hz, 1.6, H-6’a), 3.68 (1H, dd, J=12.4, 4.0 Hz, H-6’b), FAB-MS m/z 505 [M+Na]+, 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) see Table I.

Table I. 13C-NMR spectral data of compounds 1-5

Recorded at 100 MHz in CD3OD

화합물 2− A amorphous powder, 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 4.15 (1H, d, J=11.2 Hz, H-17a), 4.25 (1H, d, J=11.2 Hz, H-17b), 1.21 (3H, s, H-18), 0.83 (3H, s, H-20), 5.40 (1H, d, J=8.2 Hz, H-1’), 3.69 (1H, dd, J=12.0, 7.2 Hz, H-6’a), 3.82 (1H, dd, J=12.0, 2.5 Hz, H-6’b), 2.06 (3H, s, H-COMe). FAB-MS m/z 563 [M+Na]+, 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) see Table I.

화합물 3− needls, 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 1.20 (3H, s, H-18), 0.85 (3H, s, H-20), 5.40 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1’), 3.52 (1H, dd, J=12.4, 7.4 Hz, H-6’a), 3.82 (1H, dd, J=12.4, 2.5 Hz, H-6’b), FAB-MS m/z 521 [M+Na]+, 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) see Table I.

화합물 4− A amorphous powder, 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 1.15 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-20), 5.35 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1’), FAB-MS m/z 521 [M+Na]+, 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) see Table I.

화합물 5− needls, 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 1.20 (3H, s, H-18), 0.95 (3H, s, H-20), 5.40 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1’), 4.22 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1”), FAB-MS m/z 667 [M+Na]+, 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) see Table I.

결과 및 고찰

금불초로부터 얻은 methanol 엑스를 통상적인 방법으로 용매 분획하여 n-hexane, methylene chlororide, ethyl acetate 및 n-butanol엑스를 제조하였다. 이 중 ethyl acetate 가용분획과 butanol 가용분획을 Sephadex LH-20 column을 비롯한 silica gel column chromatography를 반복 실시하고 Lobar column chromatography로 정제하여 5종의 화합물을 단리하였다.

5종의 화합물은 비슷한 양상을 나타내었으며, 특히 화합물 5는 바늘모양의 분말로 얻어졌으며, FABMS에서 m/z 667 에서 [M+Na]+ ion peak가 관찰되었다. 1H-NMR spectrum에서 δ 1.20 (3H, s, H-18), 0.95 (3H, s, H-20)에서 methyl peak 가 관찰되었으며, δ 5.40 (1H, d, J=7.6, H-1’)와 4.22 (1H, d, J=8.0, H-1”)에서 당의 anomer proton으로 추정되는 2개의 peak가 관찰되었다. 화합물 5의 13C-NMR spectrum에서는 carbonyl carbon으로 보이는 signal이 δ 178.3에서 관찰되었으며, 당의 anomer carbon으로 추정되는 2개의 peak가 δ 104.6과 95.6에서 확인되었다. 그 외에 glucose의 signal로 귀착되는 10개의 signal(δ 75.6, 78.2, 71.7, 77.9, 62.8, 74.1, 78.7, 71.1, 78.7, 62.4)이 관찰되었으며, 전체적으로 총 32개의 carbon signal을 확인하였다. 이상의 자료를 바탕으로 기존의 금불초에서 보고된 물질의 자료와 본 화합물의 기기분석 값과 비교해 본 결과 화합물 5는 금불초에서 이미 보고된 17-O-β-D-glucopyranosyl-16β-H-ent-kauran-19-oic acid- 19-O-β-D-glucopyranoside로 구조를 확인·동정하였다.10)

화합물 1은 무정형 분말로 얻어졌으며, FABMS에서 m/z 505에서 [M+Na]+ ion peak가 관찰되었고, 1H-NMR spectrum 에서 δ 1.20 (3H, s, H-18)와, 0.89 (3H, s, H-20)에서 methyl peak가 관찰되었으며, δ 5.40 (1H, d, J=7.6, H-1’)에서 당의 anomer proton으로 추정되는 peak가 관찰되었다. 13C-NMR spectrum에서는 carbonyl carbon으로 보이는 signal이 δ 178.3에서 관찰되었으며, 당의 anomer carbon으로 추정되는 peak가 δ 95.6에서 확인되었다. 그 외에 glucose의 signal로 귀착되는 5개의 signal(δ 78.7, 78.6, 74.1, 71.1, 62.4)이 관찰되었으며, 전체적으로 1개의 glucosyl peak를 제외하고 화합물 5와 거의 비슷한 chemical shift값을 나타냈으며, 총 26 개의 carbon signal이 확인되었다. 화합물 1과 화합물 5의 가장 큰 차이점은 glucosyl 부분이 없어지면서 17번 carbon의 chemical shift값이 δ 75.1에서 67.7로 up field로 이동된 것으로 추정되는 signal이었다. 화합물 1과 기본골격은 같으나 19번에 glucosyl ester가 없고 17번에 glucosyl이 붙어 있는 기존의 화합물과 당의 anomer carbon의 값이 큰 차이를 나타내어 glucose가 19번에 ester로 붙어 있는 것을 알 수 있었다.10) 이상의 자료를 종합하여 화합물 1의 구조는 16β-H- ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside로 확정하였다.

화합물 2는 무정형 분말로 얻어졌으며, FABMS에서 m/z 563에서 [M+Na]+ ion peak가 관찰되었다. 1H-NMR spectrum 에서 δ 1.21 (3H, s, H-18), 0.85 (3H, s, H-20)에서 methyl peak가 관찰되었으며, δ 5.40 (1H, d, J=8.2, H-1’)에서 당의 anomer proton으로 추정되는 1개의 peak가 관찰되었다. 화합물 2의 13C-NMR spectrum에서는 carbonyl carbon으로 보이는 2개의 signal이 δ 178.2와 173.2에서 관찰되었으며, 당의 anomer carbon으로 추정되는 1개의 peak가 δ 95.6에서 확인되었다. 그 외에 glucose의 signal로 귀착되는 5개의 signal(δ 74.0, 78.7, 71.1, 78.7, 62.4)이 관찰되었으며, 전체적으로 화합물 1과 비슷한 양상의 chemical shift값을 나타냈으며 총 28개의 carbon signal을 확인하였다. 화합물 1과의 가장 큰 차이점은 16번 carbon의 chemical shift값이 δ 80.9로 down field로 이동된 것으로 추정되는 signal이었다. 따라서 화합물 2는 기본골격이 ent-kaurane 골격의 화합물로 추정되었으며, 기존에 발표된 ent-kaurane 화합물 중에 16번 carbon에 산소가 결합되어 있는 화합물로 추정하였다. 화합물 1보다 더 확인된 peak로 carbonyl 1개와 methyl기 1개는 acetyl기로 추정하였으며, 이상의 자료값을 바탕으로 화합물 2는 glucose 1개와 acetyl기 1개가 결합되어 있는 ent-kaurane diterpene 화합물로 추정하였으며 기존의 자료와 본 화합물의 기기분석 값을 비교해 본 결과 화합물 2는 Aster ageratoides 에서 이미 보고된 16β-hydroxy-17-acetoxy-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside로 구조를 확인·동정하였다.11)

화합물 3은 바늘모양으로 얻어졌으며, FABMS에서 m/z 521에서 [M+Na]+ ion peak가 관찰되었다. 1H-NMR spectrum 에서 δ 1.20 (3H, s, H-18), 0.85 (3H, s, H-20)에서 methyl peak가 관찰되었으며, δ 5.40 (1H, d, J=8.0, H-1’)에서 당의 anomer proton으로 추정되는 1개의 peak가 관찰되었다. 화합물 3의 13C-NMR spectrum에서는 carbonyl carbon으로 보이는 1개의 signal이 δ 178.3에서 관찰되었으며, 당의 anomer carbon으로 추정되는 1개의 peak가 δ 95.6에서 확인되었다. 그 외에 glucose의 signal로 귀착되는 5개의 signal(δ 74.1, 78.7, 71.1, 78.7, 62.4)이 관찰되었으며, 전체적으로 화합물 2와 매우 비슷한 양상의 chemical shift값을 나타냈으며 총 26개의 carbon signal을 확인하였다. 화합물 2과와의 가장 큰 차이점은 acetyl group의 signal이 관찰되지 않았다. 따라서 화합물 3은 화합물 2에서 acetyl group이 없는 화합물로 추정되었다. 이상의 자료값을 바탕으로 기존의 자료와 기기분석 값을 비교해 본 결과 화합물 3은 Aster ageratoides에서 분리 보고된 16β, 17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid-19-O- β-D-glucopyranoside로 구조를 확인·동정하였다.11)

화합물 4는 무정형의 물질로 얻어졌으며, FABMS에서 m/z 521에서 [M+Na]+ ion peak가 관찰되었다. 1H-NMR spectrum 에서 δ 1.15 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-20)에서 methyl peak가 관찰되었으며, δ 5.35 (1H, d, J=8.0, H-1’)에서 당의 anomer proton으로 추정되는 1개의 peak가 관찰되었다. 화합물 4의 13C-NMR spectrum에서는 carbonyl carbon으로 보이는 1개의 signal이 δ 178.2에서 관찰되었으며, 당의 anomer carbon으로 추정되는 1개의 peak가 δ 95.5에서 확인되었다. 그 외에 glucose의 signal로 귀착되는 5개의 signal(δ 73.9, 78.6, 71.0, 78.6, 62.3)이 관찰되었으며, 전체적으로 화합물 3과 매우 비슷한 양상의 chemical shift값을 나타내었고 총 26개의 carbon signal이 확인되었다. 화합물 3과와의 가장 큰 차이점은 16번과 17번의 chemical shift값이 각각 δ 80.6 에서 82.9로, δ 70.6에서 66.8로 이동되어 부분구조이성체로추정되었다. 따라서 화합물 4는 화합물 3과 같은 구조를 가지고 있으나 16번 위치 입체구조만 다른 부분구조이성체 화합물로 추정하였다. 이상의 자료값을 바탕으로 기존의 자료와 기기분석 값을 비교해 본 결과 화합물 4는 Cussonia bojeri 에서 분리 보고된 16α, 17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid- 19-O-β-D-glucopyranoside로 구조를 확인·동정하였다.12)

Fig. 1. Structures of compounds 1-5.

결론

금불초의 methanol 추출물 중 ethyl acetate와 butanol 가용분획에서 5종의 화합물을 단리하였으며, 이들의 spectral data로부터 구조를 확인한 결과 16β-H-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (1), 16β-hydroxy-17-acetoxy- ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (2), 16β, 17- dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (3), 16α, 17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (4) and 17-O-β-D-glucopyranosyl-16β-H-ent-kauran-19-oic acid-19-O-β-D-glucopyranoside (5)로 각각 확인·동정하였다. 화합물 1-4는 금불초로부터 처음 보고되는 화합물로 식물화학적 성분연구의 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 생각되며, 향후 동정된 화합물 및 본 식물에 대한 활성연구가 필요할 것으로 사료된다.