Genetic Diversity of Polydora haswelli (Polychaeta, Spionidae) in Korean Shellfish using cox1 Marker

cox1 분자마커를 이용한 한국산 패류 천공성 다모류 Polydora haswelli (Polychaeta, Spionidae) 유전자 다양성 발굴

Abstract

Harmful shell-boring species of the genus Polydora (Polychaeta: Spionidae) were frequently reported from commercially important mollusk species in Korea, Japan and China. The traditional approach based on the morphological characteristics showed limitations for species discrimination among shell-boring species. Therefore, DNA barcoding was adopted to identify Polydora species using molecular markers. Two Polydora species (P. haswelli and P. hoplura) in abalone shells were reported from our previous molecular phylogenetic study. In this study, we additionally reported the presence of shell-boring Polydora haswelli in commercially sold shellfish. The taxon-specific cox1 marker used in this study successfully allowed the isolation of P. haswelli from cockle Scapharca subcrenata, mussel Mytilus galloprovincialis, oyster Crassostrea gigas and scallop Argopecten irradians. Polydora hoplura was not found in these shellfish species. The genetic variations were found on the intraspecific level of P. haswelli and the same genotype was also detected in different shellfish species. This result can provide information on a new host and accurate parasitic Polydora species. Moreover, this report can be used as the biodiversity data of Polydora species on the invasion and transition of harmful Polydora species in mollusk aquaculture farms.

서론

Polydora속(긴얼굴갯지렁이속- Polychaeta 다모강: Spionida 얼굴갯지렁이목: Spionidae 얼굴갯지렁이과) 다모류는 패류의 껍데기에 기생하여 숙주(host)의 생육에 영향을 끼치는 유해 생물 종으로, 한국, 일본, 중국 및 아메리카 대륙 등에서 보고된 바 있다(Sato-Okoshi and Abe, 2012; Sato-Okoshi et al., 2012; Won et al., 2013; National Institute of Biological Resources, 2015; Radashevsky and Migotto, 2017; Ye et al., 2017). 국내에는 지금까지 Polydora aura (광택긴얼굴갯지렁이), P. brevipalpa (긴얼굴갯지렁이), P. haswelli (두이빨긴얼굴갯지렁이), P. limicola (한이빨긴얼굴갯지렁이), P. hoplura (= P. uncinata) (갈 고리긴얼굴갯지렁이) 등 5종의 서식이 알려져 있다[Nation- al Institute of Biological Resources, 2015; 분류군의 한글 명칭은 국립생물자원관의 한반도의 생물다양성 데이터베이스(Na- tional Institute of Biological Resources, 2021)에 근거하였다].

이러한 패류 천공성 다모류는 국내 전복 양식장에서 전복의 생장을 저해하고 폐사율을 증가시키며, 상품가치 저하 등의 문제를 일으키는 것으로 알려져 있다(Won et al., 2013). 또한 양식 등을 통한 전 세계로의 인위적인 확산 가능성이 알려져 있어, Polydora속에 대한 정확한 종 동정과 분포에 대한 연구 필요성이 제기되었다(Simon and Sato-Okoshi, 2015; Williams et al., 2016; Lee et al., 2020a).

그럼에도 불구하고 지금까지 한국산 Polydora속 종에 대한분류학적 연구는 매우 드물었으며, 기존의 연구는 대부분 형태 동정에 의한 생물상의 분포 기재를 중심으로 이루어져 왔다 (National Institute of Biological Resources, 2015). Lee (1998) 는 거제도 연안에서 P. ciliata [긴얼굴갯지렁이; P. brevipalpa 의 이명(synonym), National Institute of Biological Resources (2015) 기재 종 정보]를 보고한 바 있으나, 이 종은 패류 껍질에 천공하는 종이 아니라 10 m 수심에서 free-living하는 개체를 채집하여 보고하였다. Sato-Okoshi et al. (2012)은 한국의 양식 및 자연산 패류에서 P. aura, P. haswelli 및 P. hoplura (as P. uncinata) 등 Polydora속 천공성 다모류 3종을 보고하였으며, Won et al. (2013)은 완도 전복 양식장에서 천공성 다모류 P. uncinata의 발생을 보고한 바 있다. 이러한 선행 연구들은 형태 형질에 의하여 종 판별이 이루어졌으나 생활사에 따른 형태변이 등으로 정확한 종 실체(species boundary)의 파악에 어려움이 따르므로, 형태학적 형질보다는 유전자 정보에 기반한 새로운 검증방법이 요구된다(Teramoto et al., 2013; Simon and Sato-Okoshi, 2015).

따라서 최근 Polydora속의 분포에 관한 연구에서는 유전자 정보를 이용하여 정확한 종 판별을 수행하고 있다(Sato-Okoshi and Abe, 2012; Teramoto et al., 2013; Williams et al., 2017; Ye et al., 2017; Lee et al., 2020a). 본 연구진은 선행 연구로 전복 패각에서 Polydora속 종을 특이적으로 검출할 수 있는 미토콘드리아 cox1 유전자 기반 분자마커를 개발하였다. 이를 이용하여 완도 전복 양식장에서 확보한 다모류 감염의심 전복 패각에서 P. haswelli와 P. hoplura를 최초로 확인하였다(Lee et al., 2020a). 그 후, Lee et al. (2020b)도 유전자 서열을 이용하여 전복 패각에 존재하는 P. hoplura를 포함한 다모류의 종 동정을 보고한 바 있으나, 전복 패각에서 P. haswelli 감염은 확인하지 못하였다.

본 연구는 전복 이외의 패류 패각에서 발견되는 천공성 다모류에 대한 유전자 분석을 수행하였으며, 가리비, 굴, 지중해담치 및 새꼬막 등의 국내 양식산 패류에 감염된 Polydora종의 유전자 다양성을 발굴하였다. 이를 통하여, Polydora속 종에 대한 정확한 종 동정과 함께 숙주의 다양성을 조사하고자 하였다.

재료 및 방법

시판 중인 새꼬막(cockle Scapharca subcrenata; 부산 Sep 18, 2016), 가리비(scallop Argopecten irradians; 통영 Mar 15, 2016), 지중해담치(mussel Mytilus galloprovincialis; 여수 Sep 22, 2016) 및 굴(oyster Crassostrea gigas; 통영 Jan 22, 2016) 시료를 확보하여 패각 내 다모류 감염 흔적을 조사하였다(Fig. 1; 새꼬막 3개체, 지중해담치 3개체, 굴 2개체, 가리비 2개체). 분석법은 전복 패각 감염 다모류 분석에서 사용된 방법과 동일하게 하였으며(Lee et al., 2020a), 패각 안쪽 표면의 감염 흔적 (trace of infestation)을 핀셋으로 분해하고 시료를 채취하였다 (Lee et al., 2020a). 대부분의 시료는 숙주의 패각 조직과 함께 섞여 있었으며, 독립된 개체로 확인하기 어려웠다. 따라서 숙주의 패각 조직을 포함한 감염 부위를 함께 채취하여 유전자 분석을 실시하였다(Fig. 1E).

Fig. 1. Korean shellfish infected by Polydora species. Arrows indicated the infected regions by Polydora species A) cockles, B) mus- sel, C) oyster, D) scallop and E) Polydora haswelli was scraped out from the infected scallop shell and samples were mixed with scallop shell debris.

채취된 시료의 total genomic DNAs 추출은 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 진행하였다. 종 동정에 필요한 유전자 마커는 국제 DNA barcoding의 표준마커인 cox1 유전자 부위를 이용하였고(Hebert et al., 2003), cox1 증폭을 위한 프라이머 조합은 Polydora속에 대한 특이성이 검증된 cox1-Polyd-F1/cox1-Polyd-R2 (Lee et al., 2020a) 조합을 채택하였다.

Polymerase chain reaction (PCR) 조건은 95°C에서 2분 1회 처리하고, 94°C 30초, 50°C 30초, 72°C 1분 과정을 40회 반복하였으며, 최종 72°C에서 7분간 final extension 과정을 수행하였다. PCR 조성은 amfiXpand (GenDEPOT, Barker, TX, USA) 를 이용하여 20 μL volume으로 Thermal Cycler 9700 (Ap- plied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 이용하여 cox1 부위 증폭을 수행하였다. 염기서열은 상업 시컨싱서비스(Mac- rogen, Seoul, Korea)를 통하여 염기서열의 chromatogram 을 확보하였다. Chromatogram은 Sequencher 5.4.6 프로그램 (Gene Codes; Ann Arbor, MI, USA)을 이용하여 분석하였고, 확보된 cox1 염기서열에 대한 유사도 분석은 GenBank (Na- tional Center for Biotechnology Information, NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)을 이용하였다. 분자계통분석은 MEGA 6 program으로 neighbor-joining method [Kimura 2-parameter option, bootstrap analysis (2000 replicates)]를 채용하여 분자계통수를 확보하였다(Tamura et al., 2013).

결과

숙주로 이용된 패류의 종류에 따라 다양한 형태의 패각 내 다모류 감염 양상이 나타났다(Fig. 1). 패각 내 천공성 다모류 감염의 흔적으로 추정되는 부위에 대하여 cox1 분자마커를 이용하여 유전자 분석을 실시한 결과 10개의 P. haswelli 유전자서열을 발굴하였다. 가리비(scallop 2개; GenBank accession numbers MZ532488, MZ532489), 굴(oyster 2개; MZ532496, MZ532497), 새꼬막(cockle 3개; MZ532490, MZ532491, MZ532492) 및 지중해담치(mussel 3개; MZ532493, MZ532494, MZ532495)에서 P. haswelli 감염을 확인하였다 (Primers 서열 제외 424 bp의 cox1 염기서열이 결정됨; Fig. 2). 선행 연구인 전복의 경우 P. haswelli와 P. hoplura 2종이 검출되었으나(Lee et al., 2020a), 본 연구에서 조사된 패류 시료에서는 모두 P. haswelli만 검출되었다.

발견된 한국산 P. haswelli 종내 변이는 0-3.7%를 보였으며, 기존 전복에서 발견된 P. haswelli와는 0-3.4%의 염기변이를 나타내었다. GenBank에 수록되어 있는 중국의 pearl oyster에서 발견된 P. haswelli는 국내 종과 0.24-3.7%를 염기변이를 보였다. 계통분석결과 P. haswelli는 크게 두 개의 group으로 나누어졌다[Fig. 2; group A (가리비, 굴, 새꼬막, 지중해담치, 전복, pearl oyster (진주조개, 중국), group B (가리비, 지중해담치)] Group A와 B간에는 3.2-3.7%로 뚜렷한 차이를 보였으며, group A내 한국산 개체들 간에는 0-0.24%의 염기변이(1개 차이)를 나타내었다. Group B의 개체 간에는 0.7%의 염기변이(3 개 차이)를 나타내었다. 반면에 P. hoplura의 경우 종내 유연관계에서 남아프리카 공화국의 1개 시료(KY677865)를 제외하고는 한국과 남아프리카 공화국 시료 간에 0-1.4%의 염기변이를 보였다. 이러한 한국산 Polydora속 종에서 존재하는 높은 종내 변이에 대해서는 차후 후속 연구를 통하여 종 이하의 분류학적 검토의 필요성이 제시된다.

고찰

Sato-Okoshi et al. (2012)은 한국산 시료의 분석에서 양식산과 자연산 전복(Haliotis discus discus) 모두에서 P. haswelli 가 존재하는 것으로 보고하였으나, 국내 연구진인 Won et al. (2013)은 양식 전복에서 P. hoplura의 존재를 확인하였다. 이후 Lee et al. (2020a)은 Polydora 특이적 분자마커를 이용하여 동일 양식장의 다른 전복 개체에서 P. haswelli와 P. hoplura 의 감염을 확인하였다(Fig. 2). 반면에 Lee et al. (2020b)은 유전자 분석을 통하여 전복 패각에서 P. hoplura의 검출만 성공한 바 있다.

Fig. 2. Molecular phylogenetic relationship of the Korean Polydora species using cox1 region. Boccardiella hamata (GenBank accession no. KP231328) was adopted as an outgroup. The numbers on each branch represent bootstrap values (>50).

Sato-Okoshi et al. (2012)이 한국의 양식산 및 자연산 전복에서 P. hoplura (as P. uncinata)의 존재를 확인하지 못한 것은 형태 동정에 기반한 연구의 한계 혹은 관찰 시료의 특성으로 판단된다. 본 연구에서는 굴에서 P. haswelli의 감염을 보고한 Sato-Okoshi et al. (2012)의 결과를 유전자 수준에서 재확인하였다(Fig. 2).

Sato-Okoshi et al. (2012)은 형태분류를 통하여 키조개(Atri- na pectinata, 자연산), 굴(Crassostrea gigas, 양식산), 비단 가리비(Chlamys farreri, 자연산), 전복(Haliotis discus discus, 양식산 및 자연산), 보말고둥(Omphalius rusticus, 자연산), 진주조개(Pinctada fucata, 양식산) 및 피뿔고둥(Rapana venosa, 자연산)에서 P. haswelli의 존재를 보고하였다. 본 연구에서는 P. haswelli의 새로운 숙주로 지중해담치(mussel)와 새꼬막(cock- le)을 새로이 보고하였다. 지중해담치는 기존 형태분석 연구에서 Dipolydora giardi가 기생하는 것으로 보고된 바 있다(Sato- Okoshi et al., 2012). 따라서 차후의 연구에서는 지중해담치를대상으로 전복과 같은 다모류 여러 종의 동시 감염 여부를 확인할 필요가 있다.

cox1 유전자 부위는 생물종 동정을 위한 DNA bar coding의 표준 분자마커로서 세계적으로 널리 이용되고 있다(Hebert et al., 2003). 따라서 국내외의 선행연구에서 Polydora속의 지역간 변이의 비교분석과 외래종 유입 모니터링에 필수적인 분자마커로 사용되고 있다(Williams et al., 2017; Rice et al., 2018; Lee et al., 2020a). 그러나 종 동정을 위한 높은 분류학적 해상력에도 불구하고, 기존의 cox1 증폭을 위한 범용 프라이머 (universal primers)는 PCR과정에서 많은 문제점을 보였다(유전자 부위 미증폭; Ye et al., 2017; Lee et al., 2020a). 그러나 본연구에서는 Polydora속 종 동정을 위한 특이적인 cox1 분자 마커 적용으로 다양한 패류에서 감염이 발견된 Polydora의 종 판별에 매우 높은 효율성을 나타내었다.

유전자 정보에 따른 본 연구결과는 지금까지 보고된 형태적 종 동정에 근거한 자료와는 달리, 정확한 종 동정과 함께 새로운 숙주생물의 발견 등 다양한 Polydora 종 감염 패류 양상을 보여주고 있다. 또한 같은 패류 종 내에도 Polydora의 종내 유전자 다양성이 존재함도 밝히고 있다(Fig. 2; 가리비, 지중해담치 in group A/B). 특히 동일한 유전자형을 가지거나(가리비, 굴, 새꼬막, 지중해담치), 결정된 cox1 염기서열 424 bp 중에서 1 개의 차이를 나타내었다. 전복 감염 P. haswelli와 다른 개체들과는 4번째 염기서열에서 차이가 나타나서, 전복은 염기서열 C 를 가지고 있었고 다른 개체들은 염기서열 T를 나타내었다. 특히 새꼬막 감염 P. haswelli 1개 시료(MZ532490)의 경우 cox1 4번째 염기서열에서 C/T가 모두 존재하는 Y peak을 나타내어서 두 가지 유전자형을 가지는 개체에 의한 동시 감염의 가능성을 보여주고 있다.

이렇게 동일한 형태나 유사한 유전자 변이를 가지는 P. has- welli가 다양한 숙주 생물에서 발견되는 것은 패류 종간의 교차 감염 가능성을 제시할 수 있다. 뿐만 아니라 한국산 패류와 중국 pearl oyster에서 발견된 유사한 cox1 유전자형의 존재는 지역 간 및 국가간의 기생 다모류의 이동 가능성도 내포하고 있다 (Fig. 2). 남아프리카 굴 양식장에서 발견된 굴 천공성 다모류의 존재는 양식산업을 통한 지역간 및 국가간 이동가능성을 제시한다(Williams et al., 2016).

그러므로, 이러한 다양한 감염 패턴을 분석하기 위해서는 유전자 정보에 기반한 DNA barcoding 기법의 도입이 필수적이다(Williams et al., 2017). 특히 굴, 가리비 및 홍합 등 여러 종류의 패류를 함께 양식하는 복합양식(integrated multi-trophic aquaculture, IMTA)의 경우 이종 패류 간의 천공성 다모류의 교차 감염 가능성이 심각한 문제점으로 대두될 수 있다. 최근의 연구에서 이러한 IMTA와 양식생물-기생 유해 생물종 사이의 이종간 교차감염과 그에 따른 피해를 예상한 바 있다(Bouw- meester et al., 2021).

한국 양식산업에서 품종별 패류 생산은 전복류(2만톤, 6, 103 억원), 굴류(30만톤, 2, 634억원), 홍합류(6.1만톤, 275억원), 바지락(1.8만 톤, 500억원), 꼬막류(6.7천톤, 213억원)에 이르고 있다(Statistics Korea, 2021). 이런 양식 산업에서 다모류의 감염은 양식 패류의 생육과 생산 품질 저하를 가져와 양식산업에 큰 영향을 끼칠 수 있다. 그러므로 패류 감염 다모류에 대한 체계적인 모니터링 기법 마련이 절실히 요구되는데, 본 연구에서 적용된 분자마커는 천공성 다모류 Polydora종의 완전한 개체뿐만 아니라 패각 시료가 혼입된 상태에서도 패각의 유전자 정보와는 구별되는 Polydora만의 유전자 정보를 발굴할 수 있음을 보여주었다. 차후 다양한 패류의 다모류 감염 의심 시료에 대한 폭넓은 적용이 가능할 것으로 보이며, 감염 초기 상태에서도 정확하게 천공성 Polydora의 감염 여부를 판단할 수 있을 것으로 예상한다. 따라서 패류 양식장내 천공성 다모류 감염에 대한 효과적인 모니터링 기법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.