Bacillus subtilis FWC1, B. amyloliquefaciens NAAS1 및 Pichia farinosa NAAS2의 산업적 생산을 위한 배양 조건

Growth Media Conditions for Large-Scale Fermentation of Bacillus subtilis FWC1, B. amyloliquefaciens NAAS1, and Pichia farinosa NAAS2

Abstract

This study analyzed and compared growth characteristics under large-scale fermentation at 35℃ of three microorganisms with the ability to reduce odor-producing substances in livestock. The three microorganisms (Bacillus subtilis FWC1, Bacillus amyloliquefaciens NAAS1, and Pichia farinosa NAAS2) evaluated in this study have been proven effective in reducing odor-inducing substances. Bacillus subtilis FWC1 exhibited the highest viable cell count when using 2% maltodextrin as carbon source, 0.05% soy-peptone as nitrogen source, and 0.3% yeast extract. The optimum media composition for B. amyloliquefaciens NAAS1 was 1.2% modified-starch with 0.8% yeast extract. The spore formation rate in the mass production of the Bacillus strains was over 90%, indicating that optimal growth medium compositions have been identified. In the case of P. farinosa NAAS2, our optimized growth medium [2% (w/v) glucose and 1% (w/v) yeast extract] improved biomass production.

서론

최근 낙농 및 축산업에 사용되는 미생물은 가축생산의 질적 향상을 위한 중요한 소재로 취급되고 있으며, 악취 저감, 생산성 향상, 질병 예방 등 다양한 기능성 미생물에 대한 연구 및 산업화가 이루어지고 있다[1].

미생물을 산업적으로 이용하기 위해서는 미생물의 특성을 규명함과 동시에 대량생산을 위한 배지 조성 정립이 절대적으로 필요하다. 유용 미생물 생산을 위한 대량생산 배지 정립은 경제적인 측면과 생산성을 효과적으로 증진시킬 수 있다는 이유에서 다양한 방법으로 수행되어 왔다. 배양 배지는 여러 개의 성분의 혼합으로 이루어져 있으며, 이들 성분의 혼합량보다는 각 성분의 혼합비율이 중요하다.

실험계획법(experimental design)은 여러 성분의 혼합물에 관한 실험에서 어떠한 성분이 최종 반응변수에 유의한 영향을 미치며, 반응을 최대 또는 최소로 만드는 최적 혼합비율을 찾고자 하는 방법이다. 배지 최적화에 적용할 수 있는 방법에는 여러 성분들간의 실험 계획법에서 혼합물 설계 (mixture design)를 사용하는데, 이는 반응표면방법론의 범주에 속한다[2].

유산균과 같이 영양요구성이 높은 미생물은 여러 종류의 배지 성분들을 혼합한 배지를 사용하기 때문에 상대적으로 값이 비싼 것이 특징이다. 반응표면방법론을 활용한 배지 최적화는 Lactobacillus casei YIT9018, L. plantarum JNU2116, Bifidobacterium animalis subsp. lactis JNU306 등의 probiotics를 대량생산하기 위하여 연구되었으며, 상업적으로 판매되는 배지보다 경제적으로 probiotics를 생산할 수 있었다[3–5].

그러나 배지조성이 복잡하지 않은 경우에는 하나의 요인을 여러 수준으로 놓고 나머지 요인들을고정시켜 실험하는 change-one-factor-at-a-time 방법을 사용하여 최적배지 조건을 정립할 수 있는데, 비록 반응치(생균수)에 영향을 주는 요인(배지성분)의 특성을 살펴볼 수 없으나, 어떠한 실험처리조합에서 최대의 반응치를 얻을 수 있는가를 판단할 수 있다.

본 연구에 사용된 미생물인 Bacillus subtilis FWC1는 음식물 침출수에서 분리하였으며, B. amyloliqufaciens NAAS1과 Pichia farinosa NAAS2는 각각 토양과 된장에서 분리하였다. 선행연구에서 음식물 폐기물 및 축산 폐기물에 B. subtilis FWC1, B. amyloliqufaciens NAAS1 및 P. farinosa NAAS2 균주를 처리시 악취유발 원인물질인 암모니아, 황화수소 및 아민가스의 발생을 감소시키는 것을 확인하였다[6,7].

Bacillus subtilis FWC1은 tryptic soy(TS) broth(BD Difco, Fraklin Lakes, NJ, USA) 에서배양시 높은 생균수를 나타냈으며, B. amyloliqufaciens NAAS1과 P. farinosa NAAS2는 각각 Luria-Bertani(LB) broth(BD Difco)와 YM broth(BD Difco)에서 우수한 생육양상을 보였으나, 가격이 비싸 대량생산 배지로 사용하기에는 어려운 실정이다. 또한, 선행연구에서 이들 미생물의 생산을 위한 배지조성을 확립하였으나, 배양시간이 72–120시간으로 실제 생산에 적용하기 어려운 점이 있었다.

따라서 본 연구는 B. subtilis FWC1, B. amyloliqufaciens NAAS1 및 P. farinosa NAAS2 균체 생산 시 효과적인 산업적 생산을 위한 대량생산배지를 개발하고자 수행하였다.

재료 및 방법

1. 스타터 배양액 제조

본 실험에 사용된 악취저감 미생물 3종, B. subtilis FWC1, B. amyloliqufaciens NAAS1 및 P. farinosa NAAS2는 농업기술실용화재단에서 분양받아 사용하였다. Bacillus subtilis FWC1과 B. amyloliqufaciens NAAS1은 각각 TS broth와 LB broth에서 35℃, 24시간 진탕배양 후 스타터로 사용하였으며, P. farinosa NAAS2는 YM broth에서 30℃, 48시간 진탕배양하여 스타터로 사용하였다.

2. 대량배양 조건 탐색

생균수가 높은 배지 조성 탐색을 위하여 선행연구에서 얻어진 결과를 바탕으로 탄소원, 질소원, 미량원소 등 각각의 원료를 첨가하여 생육에 도움을 주는 배지성분들을 토대로 새로운 조성의 배지 탐색하였다. B. subtilis FWC1의 경우에는 maltodextrin 또는 soy-peptone을 첨가하여 생균 수를 비교하였으며, Bacillus amyloliqufaciens NAAS1은 glucose, fructose, maltodextrin을 각각 혼합한 배지로 최종 생균수를 비교하였다. 또한, Pichia farinosa NAAS2는 무기염류 대신에 yeast extract를 혼합한 배지를 제조하여 각각 최종 생균수를 비교하였다. Table 1은 선행연구[6,7] 에서확립된 생산배지 조성을 나타낸 것으로 본 연구에서는 대조구로 사용하였다.

Table 1. Composition of control medium for tested strains

3. 생균수 측정

Bacillus subtilis FWC1, B. amyloliqufaciens NAAS1 및 P. farinosa NAAS2의 생균수 측정은 동일한 방법으로 시행하였으며, 액상배양액 1 mL를 멸균 생리식염수로 희석 후, 희석된 시료를 TS agar, LB agar 및 YM agar에 도말하여 30℃(P. farinosa NAAS2)와 35℃(B. subtilis FWC1 및 B. amyloliqufaciens NAAS1)에서 각각 48시간 동안 배양하여 집락을 계수하였다.

4. 통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며, 결과 값에 대한 통계분석은 SAS 프로그램(SAS 9.4, SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후 유의한 차이가 있는 경우, 사후검증으로 Duncan’s multiple range test를 실시하여 유의적인 차이를 p<0.05 수준에서 검정하였다.

결과 및 고찰

1. Bacillus subtilis FWC1의 대량생산 배양 조건

선행연구에 보고된[6], Bacillus subtilis FWC1의 배지인 glucose-yeast extract medium과 비교하여 생육속도와 포자 형성 완료 후의 생균수 비교를 통해 산업용 최적배지를 탐색하였다. 탄소 원으로 glucose, maltodextrin, fructose, sucrose 및 modified starch를 1%–5% 수준으로 각각 설정하였으며, 질소원으로 soy peptone과 yeast extract를 각각 0.01%–0.05%와 0.3%–1% 수준으로 설정하여 배지를 제조하였다. 대량생산 배지 조성별 최종 생균수는 Table 2에 제시하였다. 실험 결과, Bacillus subtilis FWC1은 탄소원 2% 이하, 질소원 약 0.3%의 조성으로 35℃에서 24시간 배양하면 산업적 생산이 가능한 것으로 나타났다.

Table 2. Viable cells of B. subtilis FWC1 with different culture media

^a,b Means with different superscripts indicate significant difference within a column (p<0.05).

Kwon et al.(2007)은 B. subtilis S37-2는 TS 배지에서 양호한 생육상태를 나타냈으며, 30℃보다 37℃에서 배양시 4배 이상의 균체 생성량을 보였으며, peptone과 tryptone을 첨가한 배지보다 yeast extract를 첨가한 배지에서 균체 생성량이 양호하다고 보고하였다[8]. 본 실험결과, B. subtilis FWC1의 경우 탄소원의 함량을 2% 높였을 때 오히려 세포분열이 감소하였으며, yeast extract 함량이 증가함에 따라 세포분열이 증가하는 것을 보였다(data were not shown). 또한, 배양온도에서도 30℃보다 35℃ 배양시 생육속도가 증가함을 확인하여 기존의 연구와 유사한 배양 특성을 나타냈다. 그러나 yeast extract의 함량이 0.3% 이상부터는 세포분열 및 균체 생성량이 큰 차이를 보이지 않았다(data were not shown).

2. B. amyloliquefaciens NAAS1의 대량생산 배양 조건

Bacillus amyloliquefaciens NAAS1 대량생산을 위한 배지성분은 탄소원으로 glucose, maltodextrin, soluble-starch, modified-starch를 각각 1%–5% 수준으로 설정하였으며, 질소원으로 soy peptone, yeast extract 및 soybean flour를 각각 0.01%–0.05%, 0.3%–1% 및 0.1%– 1% 수준으로 첨가하여 평가하였다.

Table 3은 산업용 대량배양 배지조성을 정립하기 위하여 여러 배지성분 조합으로 35℃에서 24시간 배양하여 최종 생균수를 나타낸 것이다. 배지조성을 maltodextrin 1%, soluble-starch 1%, soy peptone 0.5% 및 yeast extract 0.6%로 하였을 때 9.4에 이르는 높은 생균수를 보였다.

Table 3. Viable cells of Bacillus amyloliqufaciens NAAS-1 with different culture media

^a–c Means with different superscripts indicate significant difference within a coulmn (p<0.05).

Bacillus amyloliqufaciens NAAS1는 72시간 배양 후, 현미경상 2%보다 높은 함량의 탄 소원 첨가 시 세포분열이 감소하여, 균체 향상을 저해하는 것으로 나타났으며, 질소원 함량이 증가함에 따라 세포분열이 증가하였다. 경제성 대비 생균수가 비교적 우수한 modified starch 1%–1.5%, yeast extract 0.5%–1% 수준의 조성이 산업용 배지로 가장 적합한 것으로 보여, B. amyloliqufaciens SKU-78보다 낮은 함량의 영양원으로 배양이 가능함을 확인하였다.

Kim and Cho(2014)는 B. amyloliqufaciens SKU-78은 48시간 배양에서 탄소원으로써 옥수수전분과 유당에서 높은 생장을 보였으며[9], 질소원으로 미강과 soybean flour를 사용하였을 때 균체 성장이 가장 높다고 보고하였다. 또한, soybean flour의 농도에 따라 균체 밀도는 증가하였으나 5% 이상에서는 큰 차이를 보이지 않았는데, 5% soybean flour에 탄소원으로 옥수수전분, 포도당, soluble starch 3%를 각각 첨가하여 배양 시 5% soybean flour에 탄소원으로 옥수수 전분을 첨가한 처리구만 탄소원을 첨가하지 않은 5% soybean flour 단일 배양 시보다 균체 향상을 보였다고 하였다[9].

3. Pichia farinosa NAAS2의 대량생산 배양 조건

예비실험에서 P. farinosa NAAS2를 YM 배지와 Potato-dextrose 배지(BD)에서 생육특성을 비교한 결과 30℃에서 YM 배지에서 배양시 더 높은 생균수를 보였다(data were not shown). 기존에 보고된 P. farionsa NAAS2 생산배지인 glucose-soybean medium과 비교하여 생육속도와 생균 수 비교를 통해 산업용 최적배지를 탐색하였다(Table 4). Pichia farinosa NAAS2는 2% glucose와 1% yeast extract로 구성된 배지에서 배양 24시간에 생균수가 가장 높았다. Kwon and Kim(2016) 은 P. farinosa MBY/L1569 균주는 초기 pH 7.0, 포도당 5%, 배양온도 37℃에서 가장 빠른 성장 속도를 보였다고 보고하였으나[10], 본 실험결과 P. farinosa NAAS2 균주의 경우 성장속도에 있어서는 35℃가 조금 더 빠르게 나타났으나, 균체 생산에 있어서는 30℃에서 가장 우수하였다.

Table 4. Effect of glucose and yeast extract concentrations on the growth of P. farinosa NAAS2

^a,b Means with different superscripts indicate significant difference within a column (p<0.05).

결론

가축 사료첨가제 및 가축분뇨의 부숙 촉진 역할이 가능한 B. subtilis FWC1, B. amyloliquefaciens NAAS1 및 P. farinosa NAAS2균주의 산업적 대량생산 조건을 탐색한 결과, B. subtilis FWC1과 B. amyloliquefaciens NAAS1은 신규 정립된 대량생산배지에서 각각 9.28과 9.4의 생균 수(log CFU/mL)를 보여 기존 배지보다 우수한 것으로 나타났다(Table 5). P. farinosa NAAS 2는 신규 대량 생산배지로 배양한 결과, 배양 24시간에 생균수가 8.63(log CFU/mL)으로 나타났으나, 기존 배양배지의 경우 배양 120시간에 생균수가 8.73(log CFU/mL)으로 배양시간을 1/5로 단축시킬 수 있었다(Table 5). 산업적 생산을 위한 경제성 있는 배지로 확인되었지만, 이는 500 L 용량의 배양탱크에서 실험한 결과로 이보다 용량이 큰 배양탱크에서의 생균수 평가가 추가적으로 필요한 것으로 생각된다.

Table 5. Comparison of viable cells with optimum media

결론적으로 B. subtilis FWC1은 maltodextrin, soy peptone, yeast extract가 첨가된 배지에서 우수한 결과를 보였으며, Bacillus amyloliquefaciens NAAS1은 modified-starch와 yeast extract가 첨가된 배지에서 높은 생균수를 나타내었다. Pichia farinosa NAAS2는 glucose와 yeast extract가 첨가된 배지에서 배양시 우수한 균체생성을 보여, 본 연구에서 확립된 배지 조성이 효율적인 대량생산에 적합한 배지임을 확인할 수 있었다.

Conflict of Interest

The authors declare no potential conflict of interest.