Korean Journal of Pharmacognosy (생약학회지)

The Korean Society of Pharmacognosy (한국생약학회)
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Effect of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix Mixture in Chronic Acid Reflux Esophagitis Rats

만성 역류성 식도염에서 황련과 오수유 혼합물이 식도 점막에 미치는 영향

  • Lee, Jin A (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Oh, Min Hyuck (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Shin, Mi-Rae (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Roh, Seong-Soo (Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Park, Hae-Jin (DHU Bio Convergence Testing Center)
  • 이진아 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) ;
  • 오민혁 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) ;
  • 신미래 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) ;
  • 노성수 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) ;
  • 박해진 (DHU 바이오융복합시험센터)
  • Received : 2021.07.08
  • Accepted : 2021.08.20
  • Published : 2021.09.30
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Abstract

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a gastrointestinal disorder in which stomach contents reflux into the esophagus, causing complications such as mucosal damage. The purpose of this study was to determine the effect of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix mixture (RS) in chronic acid reflux esophagitis (CARE), one of the GERD. After inducing reflux esophagitis through surgery, the group was separated and the drug was administered for 2 weeks; Normal rats (Normal, n=8), chronic acid reflux esophagitis rats (Control, n=8), tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats (Toco, n=8), Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix mixture 100 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats (RSL, n=8), Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix mixture 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats (RSH, n=8). Gross lesion of esophageal mucosa after RS treatment showed a superior enhancement compared with that of Control group. Additionally, RS significantly decreased the levels of MPO and MDA, effectively inhibited NADPH oxidase, and regulated the expression of the AMPK/LKB1/NF-κB pathway. Moreover, it significantly increased the expression of tight junction proteins. Taken together, RS not only alleviates inflammation of the esophageal mucosa via the AMPK/LKB1/NF-κB pathway by reducing oxidative stress, but also improves esophageal function by modulating tight junction proteins.

Keywords

위식도 역류질환(Gastroesophageal reflux disease; GERD) 은 위 속 내용물이 식도로 역류하여 속쓰림 등과 같은 증상을 유발하거나 점막 손상 및 합병증을 발생시키는 위장관 질환을 말하며, 그 원인으로는 하부식도 괄약근의 기능 저하, 위의 연동저하 및 위산분비의 항진 등이 있다.1,2) GERD는 위장병학에서 가장 흔한 질병 중 하나로서 유병률은 서양 8~30%, 아시아 10%로 높게 나타나고 있으며, 서구에 비해 아시아에서는 유병률이 낮게 나타나고 있지만 치료를 위한 비용과 시간이 많이 필요할 뿐 아니라 완치가 힘들어 GERD의 관리와 치료에 관심이 깊어지고 있다.1,3)

현재 역류성 식도염 치료를 위해 사용되고 있는 약물로는 위산 분비를 억제하는 histamine-2 receptor antagonists (H2RAs) 및 proton pump inhibitor(PPI)와 위산을 중화시켜주는 제산제 등이 알려져 있다. 하지만 H2RAs와 PPI의 경우 골다공증, 장관 내 감염의 위험도 증가, 괴사성 장염 및 폐렴 등과 같은 부작용이 나타난다고 알려져 있으며, 제산제의 경우에도 단기적인 증상에만 효과를 나타낸다는 한계점이 있다.4) 이에 장기간 복용에도 부작용이 적으면서 역류성 식도염을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 소재의 치료제가 필요한 실정이다.

대황(大黃)은 마디풀과(Polygonaceae) 중 Rheum속의 다년생 초목인 장엽대황(Rheum palmatum), 약용대황(Rheum officinalis) 및 당고특대황(Rheum tanguticum)의 뿌리줄기로서 한방에서는 瀉熱通腸, 凉血解毒, 逐瘀通經 효능이 있어 사하약, 해열소염진통제, 고혈압용약 등으로 처방되었다.5,6)

또한, 항균 및 항염증 효과가 잘 알려져 있어 염증 치료에 다양하게 응용되어왔다.7)

황금(黃芩)은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 다년생 초복 식물인 황금(Scutellaria baicalensis Georgi)의 주피를 벗긴 뿌리로서 한방에서는 열을 내리거나 해독의 목적으로 염증 치료에 주로 사용되어 왔다.8,9) 또한, 황금의 주요 성분으로 flavonoid계 화합물 등 약 30종의 성분이 밝혀졌으며, 이러한 성분들은 항염증 작용을 나타낸다고 보고되어 있다.10,11)

선행 연구에서 염증에 효과가 있다고 알려진 대황과 황금을 혼합하여 급성 역류성 식도염 동물 모델에 대한 효과를 확인한 결과 대황-황금 혼합물이 급성 역류성 식도염에서 식도 점막을 보호하는 것을 확인하였으며,12) 이러한 결과를 토대로 본 실험에서는 만성으로 진행된 역류성 식도염에서대황-황금 혼합물이 나타내는 효과와 그 기전에 대하여 확인하고자 한다.

재료 및 방법

시료 − 본 실험에서 사용한 대황과 황금은 옹기 한약국(대구, 한국)에서 구입한 것을 대구한의대학교 한의과대학 노성수 교수가 생약규격집에 맞추어 관능검사 후, 약전 규격에 적합한 것만을 정산하여 사용하였다. 대황과 황금을 각각 200g 분쇄하여 증류수 2L를 첨가한 후 열탕추출기에서 2 시간 추출하였다. 얻어진 추출물은 감압농축기로 농축 후, 동결건조기를 이용해 완전히 건조시켜 파우더를 얻어(수율; 대황 16%, 황금 29%) 실험 전까지 -80°C에서 보관하였으며, 실험 당일 대황과 황금을 1:1 비율로 혼합(RS)하여 사용하였다.

시약 − 본 실험에 사용된 thiobarbituric acid와 1, 1, 3, 3- tetramethoxypropane는 Sigma-Aldrich(St, Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, Phosphoric acid는 Duksan company (Ansan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare(Chicago, IL, USA)에서 구입하였고, NADPH oxidase 2(NOX2), p47phox, liver kinase B1(LKB1), phospho-liver kinase B1(p-LKB1), inhibitor of nuclear factor kappa B alpha(IκBα), phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa B alpha(p-IκBα), phosphorylation of nuclear factor-kappa B p65(NF-κBp65), cyclooxygenase- 1(COX-1), cyclooxygenase-2(COX-2), tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-6(IL-6), claudin-1, claudin-3, β-actin, histone은 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, CA, USA) 로부터 구입하여 사용하였고, AMP-activated protein kinase(AMPK)와 phospho-AMP-activated protein kinase(p-AMPK)는 Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 2차항체는 GeneTex, Inc.(Irvine, LA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka. Japan)에서 구입하였다. 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)와 dihydrorhodamine 123(DHR123)는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)에서 구입하였고, ECL western blotting detection reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다.

실험동물 − 5주령 SD 흰쥐 수컷을 대한바이오(음성, 한국) 에서 구입하여 1주일간 사육실 환경에 적응시킨 후 실험을 진행하였다. 동물 사육실 조건은 conventional system으로 온도 22±2°C, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(조단백질 18% 이상, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 인 0.85% 이상, 칼륨 0.55% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 마그네슘 0.15% 이상, NIH-41, Zeigler Bros, Inc., USA)와 물은 충분히 공급하였다. 본 실험은 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee : IACUC)의 승인(승인번호:2021-050)을 받아 진행하였다.

만성 역류성 식도염 유발 및 동물 처치 − 정상군 8마리를 제외한 32마리의 동물을 18시간 절식 후 Zoletil(Vibrac, France)을 복강주사 통해 마취하여 수술을 진행하였다. 제모기로 복부털을 제거하여 복간 정중부를 2 cm 정도 개복하여 위저부(Fundus)와 위체부(Body) 사이를 블랙 실크(2-0)실로 묶고, 유문부(Pylorus)에는 latex ring(18-Fr Nelaton catheter, 2 mm in thickness)을 끼워 나일론(5-0)실로 묶은 후 복막과 피부를 봉합하였다.13-15) 감염을 줄이기 위해 3일간 항생제(Gentamicin sulfate)와 항염증제(Dexamethasone)를 희석하여 피하주사 하였으며, 수술 24시간 후 물을 공급해주었고, 수술 48시간 후부터 사료를 공급해 주었다. 1주일간 회복기를 거친 후, 아무런 처치를 하지 않은 정상군 (Normal), 만성 역류성 식도염 유발 후 증류수를 투여한 대조군(Control), 만성 역류성 식도염 유발 후 tocopherol 30 mg/kg를 투여한 군(Toco), 만성 역류성 식도염 유발 후 대황-황금 혼합물 100 mg/kg를 투여한 군(RSL), 만성 역류성 식도염 유발 후 대황-황금 혼합물 200 mg/kg를 투여한 군 (RSH) 총 5그룹으로 분류하였으며, 모든 그룹은 매일 일정한 시간에 몸무게 및 사료 섭취량을 측정하였고, 14일간 1일 1회씩 경구투여하였다.

식도 점막 손상 확인 − 적출한 식도를 수술용 가위를 이용하여 세로로 절단하였다. 절단된 식도 내부를 saline으로 세척한 후 고정하여 정하여 광학 디지털 카메라(DSCHX50V, Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 식도 점막 측정은 I-Solution lite(Innerview Co., 성남, 한국) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정한 후, 아래 식을 이용하여 손상 면적을 나타내었다.

\(​\text { 식도 손상 비율 }=\frac{\text { 식도 손상 면적 }}{\text { 식도 전체 면적 }} \times 100\)

MPO 측정 − Myeloperoxidase(MPO)는 BioVision(Milpitas, CA, USA)에서 assay kit(Cat. K744)를 구입하여 측정하였다.

MDA 측정 − 1,1,3,3,-tetramethoxypropane(MDA)는 Mihara 와 Uchiyama의 방법16)에 따라 측정되었다. 샘플과 1% phosphoric acid, 0.67% thiobarbituric acid를 혼합하여 95°C에서 45분간 끓여주었다. 그 후, buthanol과 혼합하여 원심분리(3, 000 rpm, 10 min)하였으며, 상층액을 분주하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

식도 조직 western blotting − 식도 조직에 100mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 조직 분쇄기(tissue grinder) (Biospec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 30분간 정치시킨 후 12, 000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 그 후, 10% NP-40가더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 μL의 buffer C(50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol)를 첨가해 재부유시킨 후 10분마다 vortex를 3번 하였다. 4°C에서 12, 000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 -80°C에서 각각 냉동 보관하였다. 식도 조직 세포질에서의 NOX2, p47phox, AMPK, p-AMPK, LKB1, p-LKB1, IκBα, p-IκBα, COX-1, COX-2, TNF-α, IL-6, claudin-1, claudin-3, β-actin 단백질과 핵에서의 NF-κBp65, histone 단백질 발현을 측정하기 위하여 10-12 μg의 단백질을 10-12% SDS polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4°C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체(PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS- T로 6분마다 5회 세척하였다. Membrane을 enhanced chemiluminescence(ECL) 용액에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc(Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광 시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software(ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다(represented as 1).

통계분석 − In vivo의 수치는 mean±SD로 표시하였으며, SPSS(Version 25.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences(LSD) test로 사후검증을 실시하여각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001에서 검증하였다.

결과

식도 점막 손상 확인 − 식도 점막의 손상 정도를 육안으로관찰한 결과, 아무런 처치를 하지 않은 Normal군의 식도 점막에서는 손상 및 궤양이 발견되지 않았으나 Control군에서는 중간 또는 하부식도에서 궤양이 발견되었다. 반면, RSL군에서는 Control군 대비 중간 또는 하부식도의 궤양이 감소한 것을 확인하였고, RSH군에서는 하부식도 부위에서만 궤양이 발견되어 Control군 대비 56%(p<0.01)유의하게 궤양이 감소한 것을 확인하였으며, Control군 대비 50% 감소한 Toco군보다 뛰어난 식도 점막 보호효과를 나타냈다(Fig. 1).

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Fig. 1. Surgical induction of chronic acid reflux esophagitis. A representative gross image; (A), esophageal ulcer ratio; (B). Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; Toco, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ###p<0.001 vs. Normal group, *p<0.05, **p<0.01 vs. Control group.

MPO 및 MDA 수치 분석 − 혈청 및 식도 조직에서 산화적 스트레스 관련 마커인 MPO 및 MDA를 측정하였다. 혈청 내 MPO 측정 결과, Normal군 대비 Control군에서 53%(p<0.001) 유의하게 증가하였다. 반면, Control군 대비 Toco군에서 11%(p<0.05), RSH군에서 13%(p<0.05) 유의하게 감소하였다. 혈청 내 MDA 측정 결과, Normal군 대비 Control군에서 약 3배(p<0.01) 유의하게 증가한 반면 Control군 대비 RSH군에서 52%(p<0.05) 유의하게 감소하였으며, 식도 조직 내 MDA 측정 결과, Normal군 대비 Control군에서 79%(p<0.001) 유의하게 증가한 반면 RSL군과 RSH군에서 36%(p<0.01) 유의하게 감소하였다(Table I).

Table I. Levels of MPO and MDA

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Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ##p<0.01, ###p<0.001 vs. Normal group, *p<0.05, **p<0.001 vs. Control group.

식도 조직 내 NADPH oxidase 발현량 분석 − 식도 조직에서 NOX2와 p47phox의 발현을 확인하였다. NOX2의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 40% 유의하게 증가한 반면 Control군 대비 RSL군 32%, RSH군 33% 감소하여 NOX2의 발현이 Normal군의 수준까지 유의하게 감소하였다. 또한, p47phox의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 36% 유의하게 증가하였고, Control군 대비 RSL군 21%, RSH군 19% 유의하게 감소하였다(Fig. 1).

식도 조직 내 AMPK/LKB1 발현량 분석 − 식도 조직에서 p-AMPK와 p-LKB1의 발현을 확인하였다. p-AMPK의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 37% 감소한 반면 Control군 대비 RSL군 46%, RSH군 49% 유의하게 증가하였으며, p-LKB1의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 38% 유의하게 감소하였고, Control군 대비 RSL군 46%, RSH군 51% 유의하게 증가하였다. p-AMPK와 p-LKB1의발현이 대황-황금 혼합물을 투여한 군에서 Normal군의 수준까지 유의하게 증가한 것을 확인하였다(Fig. 2).

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Fig. 2. Expression of NADPH oxidase in esophagus. Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; Toco, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ##p<0.01, ###p<0.001 vs. Normal group, *p<0.05, ***p<0.001 vs. Control group.

식도 조직 내 inflammatory transcription factors 발현량 분석 − 식도 조직에서 p-IκBα와 NF-κBp65의 발현을 확인하였다. IκBα의 인산화는 Normal군 대비 Control군에서 56% 유의하게 증가하였으며, Control군 대비 RSL군 20%, RSH군 26% 유의하게 감소하였다. NF-κBp65의 핵 내 이동 및 활성화는 Normal군 대비 Control군에서 49% 유의하게 증가하였으며, Control군 대비 RSL군 29%, RSH 37% 유의하게 감소하였다(Fig. 3).

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Fig. 3. Expression of AMPK/LKB1 in esophagus. Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; Toco, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ##p<0.01, ###p<0.001 vs. Normal group, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control group.

식도 조직 내 arachidonic acid proteins 발현량 분석 − 식도 조직에서 COX-1 및 COX-2의 발현을 확인하였다. COX-1의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 47% 감소한 반면 Control군 대비 RSL군 25%, RSH군 32% 유의하게 증가하였다. 또한, COX-2의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 33% 증가하였으며, Control군 대비 RSL군 26%, RSH 25% 유의하게 감소하여 Normal군과 비슷한 수준의 발현량을 나타냈다(Fig. 4).

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Fig. 4. Expression of inflammatory transcription factors in esophagus. Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; Toco, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ###p<0.001 vs. Normal group, ***p<0.001 vs. Control group.

식도 조직 내 inflammatory cytokines 발현량 분석 − 식도조직에서 TNF-α와 IL-6의 발현을 확인하였다. TNF-α의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 31% 유의하게 증가하였으며, Control군 대비 RSL군 17%, RSH군 18% 유의하게 감소하였다. IL-6의 발현 또한 Normal군 대비 Control 군에서 29% 유의하게 증가하였으며, Control군 대비 RSL 군 17%, RSH군 11% 유의하게 감소하였다(Fig. 5).

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Fig. 5. Expression of arachidonic acid proteins in esophagus. Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; Toco, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg- treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ###p<0.001 vs. Normal group, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control group.

식도 조직 내 tight junction protein 발현량 분석 − 식도조직에서 tight junction 단백질인 claudin-1 및 claudin-3의발현을 확인하였다. claudin-1의 발현은 Normal군 대비 Control군에서 47% 감소한 반면 Control군 대비 RSL군 30%, RSH군 72% 유의하게 증가하였다. 또한, claudin-3의발현은 Normal군 대비 Control군에서 44% 유의하게 감소하였으며, Control군 대비 RSH군 45% 유의하게 증가하였다(Fig. 6).

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Fig. 6. Expression of inflammatory cytokines in esophagus. Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; Toco, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg- treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ###p<0.001 vs. Normal group, *p<0.05, **p<0.01 vs. Control group.

고찰

염증은 손상된 세포, 병원체 및 독성 화합물 등 다양한 요인에 의해 유발되는 면역계의 생물학적 반응을 말한다.17) 염증 반응의 급성기에서는 사이토카인 및 케모카인의 발현이 촉진되어 손상부위에 대한 치료를 시작하며, 이러한 염증 자극에 장기간 노출될 경우 조직 손상이 지속되어 심할 경우 조직 섬유화로 진행될 수 있다.18) 인체에서 유발될 수 있는 염증 중 하나인 역류성 식도염(Reflux esophagitis; RE) 은 위식도 역류질환 중 하나로서 식도 점막에 손상, 미란 및 궤양 등의 형태학적 병변이 나타나며, 흉부 작열감, 위산의 역류, 연하곤란, 쉰 목소리, 인후 이물감 등의 증상을 나타낸다.19, 20) RE는 식습관의 변화 및 고령화 등으로 인해 점차 증가하고 있는 추세이며, 치료 시기를 놓쳐 만성질환으로 이어지는 경우가 많이 발생하고 있다.21, 22) 현재 역류성 식도염 치료를 위하여 사용되고 있는 약물로는 histamine- 2 receptor antagonists(H2RAs), proton pump inhibitor (PPI) 및 제산제 등이 있으나 이러한 약물들은 골다공증, 장관 내 감염의 위험도 증가, 괴사성 장염 및 폐렴 등과 같은 부작용이 나타난다고 알려져 있어 새로운 치료제 개발을 위한 다양한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.4)

본 실험에서는 급성 역류성 식도염에서 식도점막 효과가 있다고 알려진 대황-황금 혼합물(RS)이 만성으로 진행된 역류성 식도염에서 어떠한 효과를 나타내는지 확인하였다. 역류성 식도염 유발을 위하여 동물에게 외과적 수술을 진행하였으며, 일주일간 유발 기간을 거친 후 RS를 2주간 경구투여하여 그 효과를 확인하였다. 식도 조직의 손상 정도를육안으로 관찰한 결과, 정상군에 비하여 대조군의 식도에서는 식도 중간부위와 하부식도에서 궤양을 관찰할 수 있었으며, 식도가 붓고 두꺼워진 것을 확인할 수 있었다. 반면, RS를 투여한 군에서는 대조군에 비하여 식도 점막의 궤양이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(Fig. 1).

다양한 염증의 원인 중 한 가지는 산화적 스트레스 (Oxidative stress)로 인식되고 있다. 산화적 스트레스는 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)에 의해 발생하며, 체내의 단백질 손상 및 DNA 손상을 유도한다.23) NADPH oxidase는 이러한 ROS를 생산시키며, 체내 염증 및 비만 등 여러 질환의 원인이 된다고 알려져 있다. ROS로 인해 세포 및 조직의 산화적 손상이 발생하였을 때 이를 측정하는 방법으로 MDA 측정, MPO 측정 등이 이용되고 있으며, 특히 MPO는 점막 손상 내 활성화된 중성백혈구의 침윤 및 염증 반응의 결과를 반영해 준다고 알려져 있다.24) 본 실험에서 RS는 식도 염증으로 인해 증가한 NOX2와 p47phox의 발현을 유의하게 감소시켰으며, 혈청 MPO 및 MDA 수치와 조직 내 MDA 수치 또한 유의하게 감소한 것을 확인하였고, 특히 MPO 수치는 RSL군과 RSH군 모두에서 양성대조군인 Toco군보다 뛰어나게 감소하였다(Fig. 2, Table 1). 선행 연구인 급성 역류성 식도염에서 RS는 NAPDH oxidase 의 발현을 감소시켰으며, 본 실험 결과에서 또한 RS는 역류성 식도염에서 산화적 스트레스의 발생을 감소시켰다. 이러한 결과는 RS가 만성 역류성 식도염에서 산화적 스트레스를 감소를 통해 염증 반응을 억제할 것이라 판단된다.

AMPK(AMP-activated protein kinase)는 생체의 에너지 및 항상성 조절을 담당하며, 염증반응에서는 nuclear factor kappa B(NF-κB)의 활성을 억제한다고 밝혀졌다. 많은 연구들을 통해 GERD를 앓고 있는 환자의 상피세포에서 NF-B 가 활성화된다고 밝혀졌으며, AMPK는 GERD에 의해 증가한 NF-κB의 발현을 억제하여 항염증 작용을 한다.25-27) NF- κB는 전사 조절 인자 중 하나로 염증성 질환에서 COX-2 와 같은 전염증성 단백질 및 염증성 사이토카인의 발현을 유도하여 급성 및 만성 염증을 매개하는 것으로 알려져 있다.28) COX(Cyclooxygenase)는 아라키돈산(Arachidonic acid)를 프로스타글란딘(Prostaglandin)으로 변환시키는 역할을 하며, NF-κB에 의해 발현되는 COX-2는 정상세포에 비해 많은 프로스타글란딘을 생성하여 세포 증식을 도울 뿐 아니라 암세포의 성장에도 관여한다. 반면, COX-1은 COX-2 억제제로 알려져 있으며, 소화기계에서 위산을 조절할 뿐 아니라 위 식도 점막을 보호하여 정상적인 기능을 하도록 돕는 중요한 역할을 한다.28-30) 이전에 발표된 연구에 따르면 대황 추출물이 급성 역류성 식도염에서 NF-κB 경로를 조절함으로써 식도 점막의 염증을 완화시켰으며, 선행 연구에서 RS 또한 급성 역류성 식도염에서 NF-κB 경로를 조절하여 식도 점막의 염증을 완화시켰다.12, 31) 이러한 연구 결과와 마찬가지로 본 실험에서도 RS는 만성 역류성 식도염에서 IκBα의 인산화를 조절하여 NF-κB의 전사를 유의하게 감소시켰다(Fig. 3, 4). 게다가, COX-1와 COX-2의 발현을 조절하여 위 식도 점막을 보호 및 염증을 유의하게 완화시켰으며, TNF-α와 IL-6의 발현 또한 유의하게 감소시켰다(Fig. 5, 6). 이러한 결과를 토대로 RS는 산화적 스트레스 감소를 통해 AMPK/LKB1와 NF-κB 경로를 조절함으로써 식도 점막의 염증을 완화시키는 것으로 사료된다.

GERD를 앓고 있는 환자의 상피세포에서 NF-κB는 tight junction(TJ) 단백질의 발현을 조절하는 것으로 알려졌다.32) TJ는 세포와 세포 사이의 연결시켜주는 중요한 역할을 가지며, TJ 중 하나인 claudin은 수분의 이동 조절 및 세포 내 신호 전달에 관여하는 등 다양한 생물학적 기능을 가진다. 역류성 식도염에서 식도 점막이 손상될 경우 이러한 TJ 단백질의 발현이 감소하는 것으로 알려져 있다.33) 본 실험에서 RS는 claudin-1과 claudin-3의 발현을 증가시켰으며, 특히 RSH군에서 TJ 단백질의 발현이 유의하게 증가한 것을 확인하였다(Fig. 7). 이전 연구의 대황 단일 추출물과 달리 RS는 NF-κB 경로를 조절할 뿐 아니라 식도 점막 세포의 결합 조직에서 중요한 역할을 가지는 TJ 단백질의 발현을 조절함으로써 역류성 식도염으로 인한 식도의 염증을 개선하였으며, 이러한 효과는 급성 역류성 식도염에서 그치는 것이 아니라 만성으로 진행된 역류성 식도염에서 또한 유의적인 효과를 나타냈다. 급성 역류성 식도염에서 RS는 현재 연구와 마찬가지로 산화적 스트레스를 억제 함으로써 NF-κB 경로를 통해 식도 점막의 염증을 완화시켰다. 게다가, NF-κB 경로뿐만 아니라 MAPK 경로를 경유하였으며, 추가적으로 MMPs/TIMPs의 발현을 조절하였다. 이러한 결과를 토대로 만성 역류성 식도염에서 또한 MAPK 및 MMPs/TIMPs 발현 등 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

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Fig. 7. Expression of tight junction proteins in esophagus. Normal rats; Normal, chronic acid reflux esophagitis rats; Control, tocopherol 30 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; Toco, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 100 mg/kg- treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSL, mixture of Rhei Rhizoma and Scutellariae Radix 200 mg/kg-treated chronic acid reflux esophagitis rats; RSH. All data are expressed mean±SD (n=8). Significance: ###p<0.001 vs. Normal group, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control group.

결론

본 연구는 대황-황금 혼합물이 만성 역류성 식도염에서 미치는 식도 점막 보호 효과에 대해 평가하였다. 대황-황금 혼합물은 만성 역류성 식도염에서 식도 점막의 손상을 완화하였으며, 이러한 식도 점막 보호 효과는 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 AMPK/LKB1와 NF-κB 경로를 억제를 통해 COX-1, COX-2 및 염증성 사이토카인의 발현을 감소시켜 염증을 완화하는 것으로 확인되었으며, tight junction 단백질의 발현을 조절함으로써 식도의 결합조직 내 손상 및 식도의 기능적인 부분까지 효과를 미치는 것으로 판단된다.

사사

본 연구는 한국연구재단(No. 2017R1A2B206858 and No. 2019R1I1A1A01064068)의 지원을 받아 수행되었습니다.

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