Inhibitory Effects of Esculetin Through the Down-Regulation of PI3K/MAPK Pathway on Collagen-Induced Platelets Aggregation

Esculetin이 PI3K/MAPK 경로 하향 조절을 통해 collagen 유도의 혈소판 응집 억제에 미치는 효과

Abstract

Platelet activation plays a major role in cardiovascular disorders (CVDs). Thus, disrupting platelet activation represents an attractive therapeutic target on CVDs. Esculetin, a bioactive 6,7-dihydroxy derivative of coumarin, possesses pharmacological activities against obesity, diabetes, renal failure, and CVDs. In other report, the effect of esculetin has been examined in human platelet activation and experimental mouse models, and esculetin inhibited collagen- and arachidonic acid-induced platelet aggregation in washed human platelets. However, it had no effects on other agonists such as thrombin and U46619, and its mechanism is not also clearly known. This study investigated the effect of esculetin on collagen-induced human platelet aggregation, and we clarified the mechanism. Esuletin has effects on the down regulation of PI3K/Akt and MAPK, phosphoproteins that act in the signaling process in platelet aggregation. The effects of esculetin reduced of TXA₂ production and phospholipase A₂ activation, and intracellular granule secretion including ATP and serotonin, leading to inhibit platelet aggregation. These results clearly clarified the effect of esculetin in inhibiting platelet activity and thrombus formation in humans.

혈소판은 손상된 혈관의 지혈에 관여하는 세포로 혈전, 심근경색, 동맥경화 등의 순환기 장애를 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 혈소판 응집은 심혈관 질환에 직접적인 영향을 줄 수 있는 요인이기에, 이를 억제하기 위한 많은 약물이 개발되었으며 지속적인 연구가 활발히 진행되고 있지만¹⁾ 심혈관 질환으로 인한 사망률은 감소하지 않고 있다. 따라서, 효과적이고 안정적인 항혈소판 성분의 규명 및 개발이 시급하다.

혈소판이 활성화되면 세포질막의 인지질이 가수분해되는데 이 때 방출된 arachidonic acid가 TXA₂로 전환되어 분비된다.^2,3) TXA₂가 방출될 때 다른 혈소판에서 막의 수용체에 결합하여 혈소판 응집이 지속적으로 증폭되어 간다.⁴⁾ 그 증거로서 U46619(9, 11-dideoxy 9a, 11a-methanoepoxy prostaglandinF2a)로 알려진 TXA₂ 유사체가 세포질 내 Ca²⁺ 수준을 높이고 추가적으로 pleckstrin 및 myosin light chain과 같은 세포골격 단백질의 인산화를 유발함으로써 혈소판 응집을 유도한다고 보고되었다.^5,6)

Mitogen activated protein kinase(MAPK)는 혈소판 응집 시 세포 내 신호 전달 과정에 관여하는 것으로 지속적으로연구되고 있는 중요한 단백질 그룹으로서, p38, N-terminal kinase(JNK), 및 extracellular signal-regulated kinase(ERK)가 알려져 있다.⁷⁾ JNK, ERK 및 p38 MAPK는 사람 혈소판에서 발견되며 혈소판의 응집이 유도되면 다양한 단백질의 인산화를 통해 활성화되는 것으로 보고되고 있다.^8-10) 특히, 혈소판에서 MAPK의 인산화가 혈소판 과립의 분비를 유발하는데 결정적으로 관여한다고 보고된 바 있다.^11,12) 또한, MAPK는 세포막 내의 세포질 phospholipase A₂(PLA₂)를강력하게 인산화하여 혈소판막의 인지질로부터 arachidonic acid를 생성 및 분비하고, TXA₂로 전환됨으로써 말초 혈소판의 활성화 및 응집을 증폭시킨다고도 알려져 있다.^13,14) 또한, 혈소판의 phosphoinositide 3-kinase(PI3K)와 Akt 경로가 혈소판 내 과립 분비 및 혈소판 응집을 포함한 혈소판 기능을 조절하는 데 함께 관여한다고 보고되었다.¹⁵⁾

Esculetin은 Artemisia 또는 Scopolia 속 식물의 뿌리에서 일반적으로 발견되는 성분으로서 항암, 항염증 및 항당뇨병과 같은 여러 약리학적 특성이 입증되었다.¹⁶⁾ 또한, esculetin이심혈관계 질환에 보호 효과를 가진다고 보고한 연구결과들이 있다.^17,18) Liang 등의 연구에 따르면, isoproterenol로 유도된 심근경색증의 쥐에게 esculetin을 경구투여 했을 때, anti-lipoperoxidation 효과를 가진다고 보고되었다.¹⁷⁾ 또 다른 연구를 통해 esculetin이 마우스 모델 및 사람의 혈소판에서 collagen 및 arachidonic acid로 유도한 혈소판 응집을 억제하였음이 보고되었다.¹⁸⁾ 그러나, U46619 또는 thrombin으로 유도한 결과에서는 esculetin에 대한 효과가 없다고 보고되었다.¹⁸⁾ 우리는 PI3K/MAPK 경로에 미치는 esculetin의 영향을 확인함으로써 esculetin의 효과기전을 명확히 하고자 하였다.

재료 및 방법

시료 - Avention Corporation(Seoul, Korea)은 esculetin (6, 7-Dihydroxy-2H-1-benzopyran-2-one)을 제공하였다(Fig. 1). Chrono-Log Corporation(Havertown, PA, USA)에서 collagen을 제공하였다. Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)은 assay kit(LDH 및 ATP)들과, EIA kit(serotonin 및 TXB₂)들을 제공하였다. Cell Signaling(Beverly, MA, USA)은 wstern blotting을 위한 용해 완충액 및 항체를 제공하였다. General Electric Healthcare(Chalfont St. Giles, Buckinghamshire, UK)는 PVDF(Polyvinylidene difluoride) membrane과 ECL(Enhanced chemiluminescence) 시약을 제공하였다. 그 밖의 다른 시약들은 Sigma Aldrich(Saint Louis, MO, USA)에서 구입해 사용하였다.

Fig. 1. The structure of esculetin and its mechanism. PIN: 6, 7- Dihydroxy-2H-1-benzopyran-2-one, Chemical formula: C₉H₆O₄, Molar mass: 178.14g/mole.

사람 세척 혈소판 부유액 준비 - 본 연구는 대한적십자경기혈액원(Suwon, Korea)에서 항응고처리된 사람 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 제공받아 수행하였다. PRP는 원심분리를 10분 동안 수행하여(1, 300×g) 미량의 적혈구를 제거한 다음 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 10⁸ cells/mL의 최종 농도이 되도록 현탁액 완충액으로 혈소판을 재구성하였다. 저온으로 인한 혈소판 응집을 피하기 위하여 모든 과정을 25℃의 온도에서 수행하였고, 남서울대학교 생명윤리 심의위원회(IRB)에서 이 실험과 모든 절차에 대해 승인(1041479-HR-201803-003)하였다.

사람 혈소판 응집반응 측정 - 세척된 혈소판(10⁸ cells/mL) 에다양한 농도의 esculetin을 첨가하여 37℃에서 3분간 전처리한 후, 2.5 µg/mL의 collagen으로 응집을 유도하여 5분간 측정하였다. 응집도는 Aggregometer(Chrono-Log, Havertown, PA, USA)를 이용하여 측정하였고, 응집력은 증가된 광 투과율로 계산하였다. 0% 투과도의 기준값으로 현탁 완충액을 사용하였다. Esculetin은 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 사용하여 최종 0.1% 농도(w/w)가 되도록 재구성하였고, 모든 실험에서 동일한 용량의 DMSO를 첨가한 것을 대조군으로 실험을 수행하였다.

세포 독성 측정 - 세척된 혈소판(10⁸ cells/mL)을 다양한 농도의 esculetin을 첨가하여 전처리(37℃, 5분)한 다음, 원심분리(12,000×g, 2분)하여 세포 debris를 제거하였다. 상층액을 LDH(lactate dehydrogenase) assay kit를 사용하여 ELISA-reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA) 로 측정하였다. 0.1% Triton X 100으로 완전히 용해된 혈소판의 값을 양성 대조군 100%로 설정하고, esculetin 첨가에 대한영향을 백분율로 표시하였다.

TXA₂ 생성량 측정 - 세척된 혈소판(10⁸ cells/mL)을 37℃ 에서 3분 동안 다양한 농도의 esculetin으로 전처리한 후, 2.5µg/mL의 collagen으로 5분 동안 자극하였다. 400 µL의 ice-cold 5 mM EDTA 및 0.2 mM indomethacin으로 처리하여 TXA₂ 합성을 정지한 후, TXB₂ ELISA kit(Cayman Chemical)를 이용하여 ELISA-reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)로 TXA₂의 안정한 대사산물인 TXB₂의 생성량을 분석하였다.

ATP 및 serotonin 방출량 측정 - 세척된 혈소판(10⁸ cells/mL)을 다양한 농도의 esculetin(37℃, 3분)으로 전처리한 후, 2.5 µg/mL의 collagen으로 5분 동안 자극하였다. 2 mM의 EDTA를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 원심분리에 의해 상층에서 방출되는(ATP 또는 serotonin)을 ATP 또는 serotonin assay kit를 이용하여 ELISA-reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)로 측정하였다.

Western blot법으로 phosphoprotein 인산화 측정 - 세척된 혈소판(10⁸ cells/mL)을 다양한 농도의 esculetin(37℃, 3분)으로 전처리한 후, 2.5 µg/mL의 collagen으로 5분 동안 자극하였다. 동일한 양의 용해 완충액을 첨가하여 반응을 중단시킨 후, 혈소판 용해물은 BCA protein 측정 kit(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용하여 단백질 정량하였고, 단백질(20 µg)을 8% SDS-PAGE에서 분리한 후 PVDF 막으로 옮겼다. 희석 계수 1:1, 000의 1차 항체로 처리하고, 희석 계수 1:2, 000으로 2차 항체로 처리한 후, ECL 시약(General Electric Healthcare, Buckinghamshire, UK)으로 반응을 유도하여 시각화하였다.

통계 분석 - 측정된 모든 실험 결과를 평균 ± SD로 처리하고 ANOVA(분산 분석)로 분석하였다. 그룹간 평균값에 유의한 차이가 있는 경우에는 Newman-Keuls 방법으로 비교하여 그룹별로 표시하였다. 결과가 p<0.05일 때 유의미한 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰

Collagen 유도의 혈소판 응집 및 세포독성에 미치는 esculetin의 효과 - 이 연구에서는 collagen으로 유도된 사람 혈소판에 대한 esculetin의 효과와 그 억제 기전을 확인하였다. 이 실험에서 2.5 µg/mL의 collagen을 응집 유도제로 사용하였고, collagen으로 유도된 사람 혈소판에 여러 농도의 esculetin(50, 100, 200, 300 µM)을 처리했을 때, 농도 의존적으로 혈소판 응집을 억제하는 것이 확인되었다(Fig. 2A). Esculetin의 half-maximal inhibitory concentration(IC₅₀)는 135.85µM로 확인되었으며(Fig. 2B), 혈소판에 대한 esculetin의 세포독성을 평가하기 위해 분비되어 나온 LDH(lactate dehydrogenase)를 확인하였다. 그 결과, 사람 혈소판에 esculetin(50, 100, 200, 300µM)의 처리에 의한 유의한 변화가 나타나지 않았다(Fig. 2C). 이 결과는 esculetin이 세포독성을 가지지 않고, collagen으로 유도된 혈소판에 억제 효과가 있음을 나타낸다.

Fig. 2. Effects of esculetin platelet aggregation and cytotoxicity. (A) Effect of esculetin on the aggregation collagen-induced human platelets. (B) Half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) value of esculetin in collagen-induced human platelet aggregation. (C) Effect of esculetin on cytotoxicity. The aggregation of platelets and cytotoxicity were performed as stated in the “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.001 versus collagen-stimulated human platelets. NS, not significant.

Esculetin이 PI3K/Akt 및 MAPK 경로에 미치는 효과 - PI3K/Akt는 혈소판 과립의 방출에 관여하는 인단백질로서, esculetin이 PI3K/Akt가 인산화에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, Fig. 3에 나타난 바와 같이, collagen은 PI 3k/Akt의 인산화를 크게 증가시켰지만, esculetin에 의해 PI 3k/Akt의인산화가 농도의존적으로 감소되었다. 이는 esculetin이 collagen-유도의 혈소판에서 PI3k/Akt의 인산화를 유의하게 억제하는 물질임을 명확히 한 것이다. 또한, esculetin이 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로의 단백질들의 인산화와 그로 인해 유도되는 혈소판 과립 방출 및 TXA₂ 생성에 미치는 효과를 확인하였다. Fig. 4에 나타난 바와 같이, collagen은 intact 혈소판과 비교하였을 때 인산화된 JNK/ p38의 인산화를 양을 강력하게 증가시켰지만, ERK의 인산화에는 유의한 영향을 나타내지 않았다. 또한, collagen에 의해 증가된 JNK/p38의 인산화가 esculetin를 처리함으로써 유의하게 억제되었는데(Fig. 4), 이는 esculetin가 JNK/p38의 인산화를 억제함으로써 혈소판 응집의 신호 전달 과정을 조절한다는 것을 보여준다. 흥미롭게도 혈소판 응집을 억제하는 물질에서 ERK 인산화의 억제는 JNK/p38보다 약하게 나타난다는 보고가 있으며, 또한 유도제에 의한 사람 혈소판응집에서 ERK의 억제에는 영향을 미치지 않는다는 연구도 있다.^{19, 20)} 이와 관련하여 ERK, JNK 및 p38의 MAPK 단백질들의 인산화와 이들이 사람 혈소판과 관련하여 응집 억제에 어떻게 관여하는지를 밝히는 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.

Fig. 3. Effects of esculetin on PI3K and Akt phosphorylation. Western blot was carried out as stated in the “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). p<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the collagen-stimulated human platelets.

Fig. 4. Effects of esculetin on MAPK phosphorylation. Western blot was carried out as stated in the “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the collagen-stimulated human platelets.

PI3K/Akt 경로는 혈소판이 활성화되어 세포 내 신호 전달이 일어나날 때 작용하며, 이들의 인산화는 혈소판 응집 및 dense 과립 분비를 포함한 혈소판 조절 및 기능에서 주요한 역할을 한다고 알려져 있다.¹⁵⁾ 또한, ERK, JNK 및 p38 을 포함한 MAPK도 혈소판의 활성화와 응집에 관여하는 것으로 보고되어 있다.⁷⁾ 앞선 연구들에 따르면 사람 혈소판에는 다량의 MAPK가 포함되어 있으며, 혈소판이 여러 작용제에 의해 활성화될 때 인산화를 통해 기능하는 것으로 알려져 있다.^8-10) 본 연구의 결과를 통해 esculetin이 PI3K/ Akt 및 MAPK 경로의 인단백질가 인산화되는 것을 하향조절함으로써 과립분비 및 혈소판 응집의 억제에 기여한다고 보여진다.

Esculetin이 PLA₂ 활성화 및 TXA₂ 생성에 미치는 효과 - Mei-Chi 등의 연구에 따르면, 인산화된 p38는 혈소판 응집에 관여하며 arachidonic acid 방출(TXA₂ 전구체) 및 TXA₂ 생성에 중요하다고 보고되었다.²¹⁾ TXA₂가 다른 혈소판을 활성화하고 응집시키는 강력한 자가유도제의 역할을 하기때문에, 혈소판 억제 활성을 가지는 물질을 평가할 때 TXA₂ 생성이 중요한 지표로 간주된다.²¹⁾ Aspitin 또는 ozagrel 등 TXA₂ 생성을 억제하는 물질들이 효과적인 항혈소판제로 이용되고 있는 것이 잘 알려져 있다.^22,23) MAPK가 세포질의 phospholipase A₂(PLA₂)를 강력하게 인산화하여 혈소판 막 의인 지질로부터 arachidonic acid를 생성 및 분비하고 TXA₂로 전환되어 혈소판의 활성화 및 응집을 증폭하기에 함께 확인해야할 필요가 있다.^13,14)

Fig. 5A에 나타낸 바와 같이, collagen에 의해 증가된 PLA₂의 인산화가 esculetin에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 혈소판 응집을 증폭시키는 자가 유도제(autacoid)인 TXA₂의 생성에 대한 에스큘레틴의 효과를 확인한 결과, collagen에 의해 85.4±10.2 ng/10⁸ cells 까지 증가되었던 TXA₂의 생성량이 esculetin(50, 100, 200 및 300µM)에 의해 각각 57.1±7.0, 53.9±1.9, 26.2±8.9 및 17.3±1.7ng/10⁸ cells로 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 5B). 이는 esculetin에 의해 활성이 억제된 MAPK가 PLA₂의 인산화를 감소시킨 결과일 것으로 예상된다.

Fig. 5. Effects of esculetin on PLA₂ phosphorylation and TXA₂ generation. (A) Effect of esuletin on collagen-induced PLA₂ phosphorylation. (B) Effect of esculetin on collagen-induced TXA₂ generation. TXA₂ generation measurement and Western blot was performed as stated in the “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). p<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the collagen-stimulated human platelets.

Esculetin이 혈소판 과립 분비에 미치는 효과 - 혈소판 과립 분비의 지표로서 esculetin이 혈소판 응집에서 ATP 및 serotonin 방출에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, collagen에 의해 ATP 방출이 0.36±0.03 µM(intact cell)에서 7.93±0.21 µM까지 증가되었다(Fig. 6A). 그러나, collagen에 의해 증가된 ATP 방출량이 esculetin(50, 100, 200 및 300 µM)에 의해 의해 각각 6.52±0.20, 5.52±0.12, 3.59±0.13 및 1.34±0.07µM로 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(Fig.6A). 또한, collagen에 의해 7.4±2.0 ng/10⁸ cells(intact cell)에서 173.9±10.8 ng/10⁸ cells까지 증가된 serotonin 방출량을 esculetin(50, 100, 200 및 300 µM)이 165.1±8.9, 81.0±12.4, 41.3±1.5 및 34.7±4.7 ng/10⁸ cells로 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 esculetin이 과립분비를 유의하게 억제한다는 것을 명확하게 보여준다.

Fig. 6. Effects of esculetin on granule secretion. (A) Effects of esculetin on ATP release. (B) Effects of esculetin on serotonin release. Measurement of granule secretion was carried out as stated in the “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). ^ap<0.05 versus non-stimulated platelets, *p<0.05, **p<0.001 versus the collagen-stimulated human platelets.

과립 분비는 혈소판 활성화를 촉진하고 순환하는 혈소판을 손상된 혈관으로 모집되게 함으로써 혈전 형성에 중요한 역할을 한다는 것이 보고되어 있다.²⁴⁾ 본 연구를 통해, esculetin이 collagen에 의해 혈소판의 dense 과립으로부터 유도된 ATP 방출 및 serototnin 방출을 유의하게 감소함으로써 혈소판 활성화 및 혈전 형성 억제에 기여함을 명확히 하였다.

결론

혈소판 활성화는 심혈관 질환(CVD)에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 혈소판 활성화를 방해하는 것은 CVD에 대한 매력적인 치료 표적으로 여겨진다. Coumarin의 생리활성 6, 7-dhydroxy 유도체인 esculetin은 비만, 당뇨병, 신부전 및 CVD에 대한 약리학적 활성을 보유한다고 보고되었지만, 사람 혈소판 활성화 및 응집을 억제하는 기전이 명확하게 알려져 있지 않다. 본 연구는 collagen 유도의 사람 혈소판 응집에 대한 esculetin의 효과를 조사하였고, esculetin의 작용기전을 명확히하였다. Esuletin은 혈소판 응집에서 신호 전달 과정에 작용하는 인산화단백질인 PI3K/Akt 및 MAPK의하향 조절을 유발하였다. 또한, esculetin는 TXA₂ 생성 및 phospholipas A₂ 활성화를 억제하였고, ATP 및 serotonin을 포함한 세포내 과립 분비를 감소시킴으로써 결과적으로 혈소판 응집을 억제하였다. 이러한 결과는 사람의 혈소판 활성 및 혈전 형성을 억제하는 데 있어서 esculetin이 유효한 물질임을 시사한다.