Antioxidant and Anticancer Activities of Euonymus porphyreus Extract in Human Lung Cancer Cells A549

인체 폐암 세포주 A549에서 Euonymus porphyreus 추출물의 항산화 및 항암활성 분석

Abstract

Euonymus porphyreus, a species of plant in the Celastraceae family, is widely distributed in East Asia, especially in Southern China. The botanical characteristics of E. porphyreus have been reported, but its antioxidative and anticancer activities remain unclear. In this study, we evaluated the antioxidative and anticancer effects of ethanol extracts of E. porphyreus (EEEP) and the molecular mechanism of its anticancer activity in human lung adenocarcinoma A549 cells. The total polyphenol and flavonoid compound contents from EEEP were 115.42 mg/g and 23.07 mg/g, respectively. EEEP showed significant antioxidative effects with a concentration at 50% of the inhibition (IC50) value of 11.09 ㎍/ml, as measured by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay. EEEP showed cytotoxic activity by increasing the SubG1 cell population of A549 cells in a dose-dependent manner. Apoptosis in A549 cells treated with EEEP was evident due to increased apoptotic cells and apoptotic bodies, as detected by Annexin V and 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining, respectively. EEEP-induced apoptosis resulted in increased expression of the First apoptosis signal (Fas), p53, and Bax, with decreased expression of Bcl-2 and subsequent activation of caspase-8, -9, and caspase-3, leading to cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Collectively, these results suggest that EEEP may exert an anticancer effect by inducing apoptosis in A549 cells through both intrinsic and extrinsic pathways.

Euonymus porphyreus는 노박덩굴과에 속하는 식물로 동아시아 지역에 널리 분포하며, 식물학상의 특징에 대한 보고는 있으나 항산화능과 항암활성 등에 관한 연구는 아직까지 밝혀진 바가 없다. 이에 본 연구에서는 인체 폐암세포인 A549를 사용하여 E. porphyreus 에탄올 추출물(EEEP)의 항산화 및 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 연구하였다. 먼저 EEEP의 총 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 각각 115.42 mg/g, 23.07 mg/g이었다. EEEP의 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과, IC50가 11.09 ㎍/ml로 뛰어난 항산화능을 보유한 것을 확인하였다. 또한 EEEP는 농도의존적으로 인체폐암세포주인 A549의 세포 성장을 저해하였으며, 세포 주기 변화를 분석한 결과 A549 세포의 SubG1기 세포비율이 증가하는 것을 확인하였다. Annexin V 염색과 DAPI 염색으로 EEEP 처리에 의해 apoptotic 세포와 apoptotic body가 증가하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 EEEP에 의해 A549 세포의 apoptosis가 유도되는 것을 시사한다. 또한 관련 단백질들의 발현변화를 분석한 결과, EEEP에 의해 Fas, p53, Bax의 발현이 증가하고 Bcl-2의 발현은 감소하였으며, caspase-8, -9와 caspase-3의 활성화를 통해 PARP가 분해되어 apoptosis가 유도되었음을 확인하였다. 이러한 결과들로부터 EEEP는 내인성 및 외인성 경로를 통한 apoptosis 유도에 의하여 A549 세포의 증식을 억제하는 항암활성을 보유하였음을 확인하였다.

서론

세계적으로 주요한 사망 원인 중 하나인 암은 사망률이 지속적으로 증가하고 있어, 2018년 한해 동안 전세계에서 9.6백만 명이 암으로 사망하였으며, 우리나라에서는 2017년 한해 동안 7만 8천여명이 암으로 사망하였다[15]. 또한 전 세계적으로 폐암에 의한 사망이 전체 암 사망률의 18.4%로 암 사망률의 주요 원인이었으며[15], 통계청 자료에 따르면 국내 암사망률 1위 또한 폐암(전체 암 사망률의 22.8%)으로 조사되었다. 암발병률과 암으로 인한 사망률은 세계적으로 지속적인 증가추세에 있으며, 국내에서도 식생활의 서구화, 급격한 노령화 등으로 인하여 꾸준히 증가하고 있다. 특히 초기 자각 증상이 거의 없는 폐암의 경우, 주로 외과적인 수술 또는 방사선 요법과 화학요법으로 치료되나, 표준 화학요법의 경우 암 조직에 대한 낮은 선택성 때문에 정상조직에 여러 부작용을 유발하는 한계가 있다. 따라서 뛰어난 항암활성을 보유하고 부작용이 적은 천연물 유래 소재 개발의 중요성이 지속적으로 대두되고 있으며, 암세포의 성장 억제, 사멸 유도 및 암세포 조직 혈관신생 억제 등 다양한 분자 기전에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다[10,32].

인체의 노화 현상이나 암발생은 다양한 생리기능에 산화적 스트레스를 유발하는 활성산소종(Reactive oxygen species) 에 기인하는 것으로 보고되고 있다[8,18]. 이러한 superoxide (¹O^2-), hydroxy radical (·OH), 과산화수소수(H₂O₂) 등과 같은 활성산소종은 생체내의 대사 과정 중에서 끊임없이 발생하며, 화학적으로 높은 반응성을 지녀 모든 세포 구성 성분과 강하게 반응하려는 경향으로 여러 세포와 조직에 손상을 일으키는 강력한 산화적 스트레스를 유발한다[9]. 이 때 생체 내 항산화 방어체계의 균형이 깨어져 활성산소종이 제거되지 못할 경우, 세포 구성 성분인 DNA, 단백질 등을 파괴하여 암, 노화, 심장질환 등 다양한 질병을 일으킨다[7,16]. 따라서 활성산소를 제거할 수 있는 항산화능을 보유하는 소재를 개발하고 후보 소재의 항산화능 보유 유무를 확인하는 것은 다양한 생리 활성 소재 개발에 매우 중요하다.

Apoptosis는 세포자멸사라고도 불리며 살아있는 세포의 생존과 사멸의 균형을 조절하여 항상성을 유지할 수 있도록 하는 현상으로, 위해 요인들에 노출되어 손상된 세포를 제거하기 위하여 사용되는 과정이다[11, 19, 38]. 이러한 apoptosis 과정에 이상이 발생하여 제대로 작동하지 못할 경우, 세포가 지속적으로 성장하게 되어 암화가 유도되며, apoptosis가 촉진될 경우 퇴행성 질환이 야기될 수 있다[6]. 따라서 암세포의 치료를 위하여 암세포의 apoptosis를 유도하여 암세포를 제거하는 방법이 중요한 전략으로 사용되고 있으며, 이를 위하여 암세포의 apoptosis를 유도하는 활성을 보유한 천연 소재를 발굴하고 그 기전 연구가 활발히 진행되고 있다[10,28]. 세포는 apoptosis가 일어나면 다양한 형태학적 및 생화학적 변화를 일으키며, 세포의 수축, DNA의 분절, 염색질 응축에 따른 apoptotic body (사멸체)를 형성하고, 외인성 경로(extrinsic pathway)와 내인성 경로(intrinsic pathway)를 통하여 단백질분해효소인 caspase의 활성화을 일으켜 세포의 사멸을 야기한다[3,39]. 외인성 경로를 통한 apoptosis는 세포 외부의 다양한 신호들이 세포 표면에 발현되는 사멸수용체(death receptor) 인 Fas, tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing li- gand (TRAIL) receptor 등에 결합하여 death inducing signal- ing complex (DISC)를 형성하고, 이후 신호전달 시스템을 통하여 개시 caspase인 caspase-8이 활성화되면서 일어난다[14,36]. 또한 내인성 경로를 통한 apoptosis는 세포 내 pro-apop- totic 단백질인 Bcl-2 family 단백질과 anti-apoptotic 단백질의 발현 정도에 의해 조절되며, 이들 단백질들의 발현 조절에 따른 미토콘드리아의 막전위가 변화되어 cytochrome c가 세포질로 방출되고, 이후 개시 caspase인 caspase-9가 활성화되어 유발된다[1, 29, 36]. 외인성 경로와 내인성 경로를 통해 활성화된 caspase-8과 caspase-9는 실행 caspase인 caspase-3, -6, -7을 활성화시키고, 활성화된 실행 caspase는 DNA 수복에 관여하는 효소인 poly ADP-ribose polymerase (PARP)와 같은 기질 단백질을 분해하여 정상적인 기능을 하지 못하게 하여 apop- tosis를 유도한다[24].

Euonymus porphyreus는 노박덩굴과(Celastraceae)에 속하는 상록 관목으로 동아시아 지역에 위치하고 있으며, 특히 중국의 남쪽 지역에서 주로 발견된다. 현재까지 E. porphyreus 의 생육 특성 및 계통학적 연구가 진행되어 왔으나, 생리활성에 관해서는 전혀 밝혀진 바가 없다[30]. 따라서, 본 연구에서는 인체 폐암세포 A549를 사용하여 E. porphyreus 에탄올 추출물 (Ethanol extract of E. porphyreus 이하 EEEP)의 항산화 활성 및 A549 세포의 apoptosis 유도에 의한 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 연구하였다.

재료 및 방법

시료준비

본 실험에서 사용한 E. porphyreus 에탄올 추출물은 해외 생물 소재 허브센터(한국생명공학연구원; 분양번호 FBM123-020) 에서 구입하였다. E. porphyreus은 95% 에탄올 용매를 가하여 45℃에서 초음파로 분쇄하여 15분씩 1일 10회, 총 3일간 반복하여 추출하고 여과, 농축, 건조과정을 거친 추출물로써 100 mg/ml의 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma, USA) 에용해시켜 -20℃에 보관하고 세포에 처리하기 전 배지에 희석하여 사용하였다.

총 폴리페놀 화합물 및 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin-Denis법에 따라 측정하였다[23]. 시료용액 0.1 ml에 10% Folin-ciocalteu’s phenol re- agent 0.1 ml를 첨가하고 Na₂CO₃ 포화용액 0.7 ml를 가하여 혼합하여 차광하고 실온에서 30분간 반응하였다. 반응 후 mi- croplate reader (Paradigm, Beckman, USA)를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하였으며, tannic acid (Sigma, USA) 의검량선에 의하여 함량을 산출하였다. 실험은 3회 반복 측정하여 평균값을 사용하였다.

총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno et al. [33] 방법을 변형하여 측정하였다. 시료용액 0.1 ml에 10% aluminum ni- trate 0.1 ml와 1M potassium acetate 0.1 ml를 가하고, 80% 에탄올 4.7 ml를 혼합하여 차광하여 실온에서 30분간 반응시킨 다음, microplate reader를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정하였으며, quercetin (Sigma, USA)을 이용하여 표준 곡선으로부터 플라보노이드 함량을 구하였다. 실험은 3회 반복 측정하여 평균값을 사용하였다.

DPPH radical 소거 활성 측정

EEEP의 항산화능을 확인하기 위하여 2, 2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) radical 소거법을 사용하여 전자공여능을 측정하였다[25]. EEEP를 농도별(2.56-320 μg/ml)로 메탄올에 녹여 준비한 다음, 96-well plate에 메탄올에 용해된 1.5×10^-4 M DPPH 40 μl와 각 시료 160 μl를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시키고, microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 자유라디칼 소거 정도를 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(Inhibitory Concentration, IC₅₀)를 계산하였다. 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였으며, 측정값은 3회 반복 실험하여 평균값으로 나타내었다. 억제능의 백분율 공식은 다음과 같다.

DPPH radical scavenging activity (%)={1-(A-B)/C}×100

A: sample absorbance 520 nm

B: color control absorbance 520 nm

C: control absorbance 520 nm

세포배양

본 연구에 사용한 정상세포주는 인체에서 유래한 폐섬유 모세포인 IMR-90 (CCL-186^™)을 사용하였고, 암세포주는 인체폐암 세포주 A549 (CCL-185^™), 인체 대장암세포주 HT29 (HTB-38^™), 인체 간암세포주 HepG2 (HB-8065^™)를 사용하였다. 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC^®, USA)으로부터 구입하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 과 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modi- fied Eagle’s medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO₂를 유지하면서 배양하였다.

암세포의 생존율 분석

EEEP가 정상세포와 암세포의 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 water soluble tetrazolium salt (WST) assay를 수행하였다. 정상세포 IMR-90과 암세포주인 A549, HT29, HepG2를 24-well plate에 3-5×10⁴ cell/well로 분주한 후 24시간 뒤 EEEP를 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 세포의 배지를 제거하고 WST 시약(Daeillab, Korea) 이 포함된 배지를 분주한 다음, 30분간 37℃ 배양기에서 반응시키고 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험을 하여 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.

세포의 형태 변화 관찰

EEEP 처리에 의한 A549의 형태학적 분석을 위하여 6-well plate에 1-2×10⁵ cell을 분주하고 24시간 후 EEEP를 적정 농도 (0-400 μg/ml)로 처리하였다. 48시간 동안 배양 후 도립현미경 (Axiovert 40C; Carl ZEISS, Germany)을 사용하여 100-200배의 배율로 관찰하였으며, Axio Vision program을 사용하여 촬영을 하였다.

세포주기 분석

EEEP의 A549 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위하여, EEEP를 농도별로 A549에 처리한 후 Muse^™ Cell Cycle Kit (Merck Millipore, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포는 6- well plate에 1-2×10⁵ cell로 분주하고 EEEP를 0-400 μ g/ml의농도로 48시간 처리 후 회수하였다. 1X PBS로 세척한 후 70% 에탄올로 고정시킨 다음, Muse^™ Cell Cycle Reagent를 처리하여 30분간 염색하였다. 염색된 세포는 Muse^™ Cell Analyzer (Merck Millipore, USA)로 측정하였으며 전용 분석 프로그램을 사용하여 분석하였다.

Annexin Ⅴ 염색에 의한 apoptosis 관찰

EEEP 처리에 따른 A549의 apoptosis 유도를 관찰하기 위하여, A549에 농도별로 추출물을 처리한 다음 Muse^™ Annexin Ⅴ & Dead Cell Kit (Merck Millipore, USA)를 사용하여 염색하였다. 먼저 6-well plate에 A549를 2×10⁵ cell의 농도로 분주하여 부착시키고 EEEP를 처리하였다. 48시간 배양 후 세포를 회수하고 Muse^™ Annexin V & Dead Cell Reagent 100 μl를 첨가하여 실온에서 20분간 반응한 다음, Muse^™ Cell Analyzer 로 분석하였다.

DAPI 염색에 의한 핵의 형태변화 관찰

EEEP를 처리한 A549를 회수하여 cytospin (Thermo scien- tific, USA)을 사용하여 슬라이드 위에 부착시키고 4% form- aldehyde 용액으로 상온에서 10분간 고정한 다음, PBS로 세척 후 0.5% triton X-100으로 상온에서 10분간 permeabilization 시켰다. PBS로 3회 세척한 다음 1 μg/ml의 4’, 6-diamidino-2- phenylindole (DAPI; Sigma, USA) 용액을 이용하여 염색하였다. 차광한 상태로 상온에서 20분간 염색한 다음, PBS로 세척 후 Anti-fade mounting 용액을 사용하여 mounting하고, 형광현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 핵의 형태변화를 관찰하고 Axio Vision Program을 이용하여 촬영하였다.

단백질 발현 분석

EEEP를 처리한 A549의 apoptosis에 관련된 단백질의 발현양상을 확인하기 위하여 Western blot을 수행하였다. A549에 농도별(0-400 μg/ml)로 EEEP를 처리하고 48시간 배양한 후, 1X PBS로 세척하고 lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF]를 첨가하여 4℃에서 15분간 반응시킨 다음 sonication 한 후 14, 000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 또한 cytosolic 단백질 추출을 위해서는 sonication 단계를 제외하고 진행하였다[34]. Brad- ford assay로 정량한 30~50 μg의 단백질은 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하고 Nitrocellulose Transfer Membrane (Protran^®, Sig- ma, USA)에 transfer한 후 5% skim milk가 함유된 PBS-T를 사용하여 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. 그 후 apop- tosis와 관련된 단백질을 인지하는 일차항체를 4℃에서 over- night 처리하였으며, horse radish peroxidase (HRP)가 부착된 이차 항체는 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) Solution (Amersham Life Science, USA)를 membrane에 도포하고 Chemilumines- cence Detection System (FluoChem^® FC₂, AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다. 일차항체인 p53, Fas, Bax, cas- pase-9, PARP, actin과 이차항체 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse는 Santa Cruz Biotechnology (USA) 에서 구입하였으며, 일차항체 Bcl-2, caspase-3, caspase-8은 Cell Signaling Technology (USA)에서 구입하여 사용하였다.

통계 분석

실험의 측정결과는 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, 각 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 student’s t test를 통해 p값이 0.05 미만(p-value<0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

결과 및 고찰

EEEP의 총 폴리페놀 화합물 및 플라보노이드 함량 분석

폴리페놀 화합물은 식물의 과실과 잎 부분에 널리 분포되어있는 2차 대사산물 중 하나로 항산화, 항균, 항암 등 다양한 생리활성을 보이며, 플라보노이드는 다양한 식물의 줄기, 뿌리, 씨앗, 꽃 등에 광범위하게 존재하는 천연 항산화제로 알려져 있다[2,5]. 따라서 일반적으로 항산화 활성을 가지는 원인 물질로 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물로 알려져 있으므로, EEEP의 항산화능 분석에 앞서 총 폴리페놀 화합물 및 플라보노이드 함량을 측정하였다. 그 결과, Table 1에서와 같이 EEEP 의 총 폴리페놀 함량은 115.42 mg/g으로 나타났으며, 플라보노이드 함량은 23.07 mg/g으로 나타났다. 이러한 결과로부터 EEEP가 뛰어난 항산화능을 보유하고 있을 것으로 판단되며, 이에 EEEP의 항산화능 분석을 수행하였다.

Table 1. Contents of total polyphenol and flavonoid compounds, and DPPH activity of ethanol extract of Euonymus por-phyreus

^aTAE: Tannic acid equivalent, ^bQE: Quercetin equivalent, ^cDPPH: 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl

EEEP의 항산화능 분석

활성산소종이 제거되지 못해 축적되는 경우 암을 포함한 각종 질병의 원인이 되므로 EEEP의 항암활성을 확인하기에 앞서 항산화능의 보유 유무를 확인하였다[7]. 본 연구에서는 EEEP의 항산화능을 분석하기 위하여 DPPH radical scaveng- ing activity를 측정하였다. 그 결과, Table 1에 제시된 바와 같이 EEEP의 농도가 2.56, 12.8, 64, 320 μg/ml로 증가할수록 30.9, 53.86, 95.93, 97.4%의 강한 DPPH radical 소거능을 보였다. 억제능 50%일 때의 EEEP 농도(IC₅₀) 값은 11.09 μ g/ml로양성 대조군인 ascorbic acid (1.53 μg/ml) 보다는 낮은 항산화 능을 보였으나 EEEP가 추출물인 점을 고려하면 뛰어난 항산화 활성을 지니는 것을 알 수 있었다.

EEEP에 의한 암세포 사멸 효과

암세포 성장에 미치는 EEEP의 영향을 알아보기 위하여 인체 폐암세포 A549, 인체 대장암세포 HT29, 인체 간암세포 HepG2 등 다양한 암세포주와 정상 폐섬유모세포인 IMR90에적정농도의 EEEP를 처리하고 48시간 배양 후 WST assay를 실시하였다. 그 결과, Fig. 1A에서와 같이 정상 세포(IMR90)에서는 EEEP에 의한 세포독성이 관찰되지 않았으나, 인체 폐암 세포인 A549의 경우, EEEP 농도의존적으로 세포 생존율이 감소되는 것을 확인하였으며, 200 μg/ml EEEP의 처리에 의해 약 51.5%의 A549 세포의 사멸 효과가 관찰되었다. 반면에 HT29와 HepG2에서는 유의미한 세포 성장 억제 효과는 확인되지 않았다. 또한, EEEP의 처리에 따른 A549 세포의 형태 변화를 도립현미경으로 관찰하였으며, 그 결과, EEEP의 농도가 증가할수록 A549 세포의 수가 감소하고 세포의 형태가 불규칙적으로 변하여 세포의 밀도가 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). 이러한 결과로부터 EEEP는 폐암 세포주에 더 효과적으로 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다. 따라서 이후 실험은 A549 세포를 사용하여 수행하였다.

Fig. 1. Effects of EEEP on cell growth and morphology in human lung carcinoma A549 cells. (A) Human fetal lung IMR90 cell line as a normal cell control and human lung adenocarcinoma A549 cells, human colon adenocarcinoma HT29 cells and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were treated with indicated concentration of EEEP for 48 hr. Cytotoxic effect of EEEP was determined by WST assay. Results are expressed as percentage of the vehicle treated control±SD of three independent experiments. *p<0.01 and **p<0.005 compared with dissolved in dimethyl sulfoxide treated cells. (B) Morphological changes by EEEP in A549 cells. The cells were treated with indicated concentration of EEEP for 48 hr, and then visualized by light microscopy. Magnification, ×100 and ×200.

EEEP에 의한 A549 세포의 SubG1기 세포 비율 증가 유도

일반적으로 암세포는 정상세포와는 달리 세포주기 조절에서 벗어나 지속적으로 무한 증식이 일어나서 발생된다고 알려져 있다[20,21]. 따라서 효과적인 항암 활성 소재 개발을 위하여 암세포의 세포주기를 제어하거나 apoptosis를 유도하여 세포의 증식을 억제하는 기능을 가지는 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다[4,26]. 따라서 EEEP가 A549의 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위하여 EEEP를 A549 세포에 처리한 다음, Flow cytometry를 사용하여 세포주기 변화를 측정하였다. 그 결과, Fig. 2의 histogram에서와 같이 EEEP 처리 농도 의존적으로 SubG1기(region M1)의 세포 분포가 점차 증가하는 것을 알 수 있었다. 각 주기별 실제 세포 분포수를 확인한 결과, Table 2에서 보여지듯이 SubG1기 세포 비율의 경우 용매 대조군에서는 6.84%였으며 EEEP 농도의존적으로 점차 증가하여 최고 농도인 400 μg/ml에서는 15.63%로 나타났다. 반면, G1기(region M2)의 세포는 용매 대조군에서 59.4%였으나 최고 농도의 EEEP 처리 시 56.47%로 감소하였으며, S기 (region M3)의 세포 또한 용매 대조군에서 19.01%였으나 최고농도 EEEP 처리 시 11.47%로 감소하는 것을 확인하였다(Table 2). 일반적으로 apoptosis가 일어난 세포에서는 DNA 단편화에 의해 DNA content가 감소하여 SubG1 세포 비율이 증가되는 것으로 알려져 있다[35]. 따라서 이러한 결과는 EEEP에 의해 A549 세포의 apoptosis가 유도된다는 것을 시사한다.

Table 2. Cell cycle distribution of ethanol extract of Euonymus porphyreus

Fig. 2. Induction of SubG1 accumulation in EEEP-treated A549 cells. A549 Cells were cultured and treated with EEEP for 48 hr. Cells were harvested, and then stained with propidium iodide for 30 min and analyzed by flow cytometry. DNA-flourescence histogram is shown. M1, SubG1 phase; M2, G1 phase; M3, S phase; M4, G2/M phase.

EEEP에 의한 A549 세포의 apoptosis 유도

EEEP에 의한 A549 세포의 apoptosis 유도를 확인하기 위하여 Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 염색을 한 후 flow cytometry로 분석하였다. Apoptosis가 유발된 세포에서는 세포막의 유동성이 증가되고 점도가 감소하여, 막 인지질의 비대칭성 소실로 인해 지질 이중막의 내부에 존재하던 포스파티딜세린(phosphatidyl serine)이 세포표면으로 노출된다[12,31]. 이러한 특징을 이용하여 apoptosis가 일어난 세포의 분석을 위한 조기 표식자로 포스파티딜세린과 결합하는 Annexin V가 널리 사용되고 있다. 또한 7-AAD는 사멸하여 손상된 세포막을 투과하여 염색되므로, Annexin V와 7-AAD 염색을 통해 apoptosis 유발 여부를 확인할 수 있다[27]. Fig. 3에서 보여지듯이, 대조군에서 Annexin V positive 세포는 2.84%였으나, EEEP 처리에 의해 농도의존적으로 증가하여 최고 농도인 400 μg/ml에서는 45.34%까지 증가하였다. 특히 ear- ly apoptotic 세포(Annexin V⁺/7-AAD^-)의 비율은 100 μg/ml EEEP 처리 시 10.17%로 가장 증가하였으며, 이후 200 μg/ml 와 400 μg/ml EEEP에서는 감소하였으며, 반면 late apoptotic 세포(Annexin V⁺/7-AAD⁺)의 비율은 EEEP 농도의존적으로 증가하였다. 또한 사멸된 세포(Annexin V^-/7-AAD⁺)의 비율은 100 μg/ml EEEP 처리 시 0.73%였으나, 200 μg/ml와 400 μg/ml EEEP 처리에 의해 각각 25.9%, 42.33%로 농도 의존적으로 증가하였다. 이는 EEEP 처리에 의해 농도의존적으로 A549 세포가 early apoptosis에서 late apoptosis를 거쳐 점차적으로 세포사멸이 유도되는 것을 의미한다. 따라서 이러한 결과로부터 EEEP에 의한 A549 세포의 사멸효과는 apoptosis 유도에 의한 것임을 확인하였다.

Fig. 3. Apoptosis induction by EEEP in A549 cells. A549 cells were cultured and treated with indicated concentrations of EEEP for 48 hr. Cells were harvested and stained with Muse^™ Annexin V & Dead Cell Kit for 20 min, followed by analysis using Muse^™ Cell Analyzer. The X axis shows the intensity of Annexin V fluorescence and the Y axis shows that of 7-AAD fluorescence. Dot plots represented four independent sections (UL: dead cells, UR: late apoptotic/dead cells, LL: live cells, LR: early apoptotic cells).

EEEP에 의한 세포핵의 형태변화 분석

Apoptosis가 유도된 세포는 세포막이 파괴되고 세포의 수축, nucleosome의 linker DNA의 절단에 의한 염색체의 단편화, 염색질의 응축 등이 일어나게 되며, 이에 따라 apoptotic body와 같은 전형적인 형태변화가 나타나게 된다[11]. 따라서 EEEP 처리에 의한 A549 세포의 핵의 형태변화를 관찰하기 위하여 DAPI 염색을 실시하여 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, Fig. 4에서와 같이 DMSO 대조군과 비교하여 EEEP를처리한 경우, 염색질이 응축되어 apoptotic body가 형성되는 것을 알 수 있었다. 또한 EEEP 처리 농도가 증가할수록 apop- totic body 형성도 증가하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 EEEP가 처리된 A549 세포에서 apoptosis가 일어난 세포의 전형적인 특징을 관찰할 수 있었다.

Fig. 4. Apoptotic morphological changes of A549 cells by EEEP. Cells were treated with indicated concentrations of EEEP for 48 hr. The cells were fixed and stained with DAPI for 20 min. The stained cells were observed by fluorescence microscopic analysis and imaged using Axio Vision Program. Arrows indicate the apoptotic bodies. Scale bars, 50 μm.

EEEP의 apoptosis 관련 단백질 발현에 미치는 영향

다음으로 EEEP에 의한 A549 세포의 apoptosis 유도의 분자기전을 분석하기 위하여 apoptosis 관련 인자들의 단백질 발현 정도를 Western blot analysis를 통해 확인하였다. 그 결과, Fig. 5A와 Fig. 5C에서와 같이 EEEP 처리에 의해 사멸 수용체인 Fas의 발현이 증가되고, 종양억제단백질 p53의 발현이 증가되었다. 또한 Fig. 5B와 Fig. 5D에서 보여지듯이 EEEP 농도 의존적으로 caspase-8과 caspase-3이 활성화되어 cleaved 형태의 caspase-8과 caspase-3이 증가되는 것을 확인하였다. 사멸 수용체인 Fas는 apoptosis의 외인성 경로에 관여하는 단백질로 p53에 의해 발현이 유도되며, 개시 caspase인 caspase-8과 실행 caspase인 caspase-3의 활성화를 일으키는 것으로 알려져 있다[22]. 또한 p53은 Bcl-2 family 단백질의 발현 조절에 의한 apoptosis의 내인성 경로에도 관여하는 것으로 보고되고 있다 [17]. Bcl-2 family 단백질의 경우, 정상세포에서는 proapop-totic 단백질(Bax, Bak, Bid 등)과 anti-apoptotic 단백질(Bcl-2,Bcl-xL 등)이 균형을 유지하고 있으나, 증가된 p53에 의해 pro-apoptotic 단백질의 발현이 증가되고 이러한 불균형이 cytochrome c를 방출시킨다[3]. 방출된 cytochrome c는 Apaf-1과 caspase-9를 포함하는 apoptosome 복합체를 형성하고 caspase-3을 활성화시켜 PARP와 같은 여러 가지 기질을 분해하여 apoptosis를 유도한다[13]. 이에 EEEP 처리에 따른 Bcl-2 family 단백질의 발현변화를 확인한 결과, pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현이 증가되었으며, anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현은 EEEP 농도의존적으로 감소되었다(Fig. 5A, Fig. 5C). 또한 Fig. 5B와 Fig. 5D에서는 내인성 경로를 통한 apoptosis의 개시 caspase인 caspase-9가 EEEP 농도 의존적으로 활성화되고 최종적으로 DNA 수선에 관여하는 PARP의분해가 일어나는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 EEEP 에 의해 p53의 발현이 증가되고, 외인성 경로 및 내인성 경로를 자극하여 A549 세포의 apoptosis가 유발되는 것이라 사료된다.

Fig. 5. Modulation of apoptosis-related protein expression in A549 cells by EEEP. EEEP-treated A549 cells were lysed and proteins were then separated by SDS-PAGE, followed by Western blotting using antibodies against (A) p53, Fas, Bax and Bcl-2, (B) caspase-3, -8, -9 and PARP. Actin was used as an internal control. (C, D) Relative band intensity of apoptosis-related proteins was normalized against the signal intensity of actin internal control for each sample. *p<0.05 and **p<0.01 compared with dissolved in dimethyl sulfoxide treated cells.

전세계적으로 사망원인 중 암이 높은 순위를 차지하고 있으며, 현대 의학의 발전에도 불구하고 암 발병률과 사망률은 점차 증가하고 있어, 기존의 항암제보다 암세포에 대한 특이성이 높은 새로운 작용기전의 항암제의 개발이 요구되고 있다. 또한 많은 기전연구와 다양한 치료제 개발에도 불구하고 암의 발병기전의 다양화 및 독성과 내성 등 부작용으로 인해 새로운 천연물 의약품의 수요가 증가하고 있으며, 이를 위한 연구가 활발히 진행되고 있다[37]. 본 연구에서는 천연물 의약품개발의 후보물질을 선별하기 위해 자생식물 중 E. porphyreus 에탄올 추출물(EEEP)의 항산화능 및 폐암세포주에 대한 항암 기전에 대하여 분석하였다. 그 결과, EEEP는 식물에서 항산화 능과 항암 활성에 관여하는 것으로 알려져 있는 총 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 화합물을 지니고 있는 것으로 확인되었으며, 높은 항산화능을 보유하는 것을 알 수 있었다. 특히, EEEP는 정상 폐세포주인 IMR-90에서는 독성이 거의 없으며 암세포 주인 A549에는 강력한 독성을 지니는 것을 확인하였으며, 이는 폐암세포주에서 더욱 효과적이었다. 또한 EEEP의 A549 세포의 증식억제 기전은 p53 발현 증가와 Bcl-2 family 단백질의 발현 조절에 따른 외인성과 내인성의 두 경로를 통한 apoptosis 유도에 의한 것으로 판단된다. 따라서 본 연구 결과는 Euonymus porphyreus 추출물의 항산화 및 항암 활성을 확인하고 그 기전을 해석하였으며, 폐암세포 특이적인 항암 활성 보유 소재 개발을 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다.

감사의 글

본 연구는 2020년도 교육부의 재원으로 한국기초과학지원연구원 국가연구시설장비진흥센터의 지원(2020R1A6C101A 201)과 한국연구재단 연구과제 지원(NRF-2017R1D1A1B0403 4994)을 받아 수행된 연구임.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.