A Study on the Antioxidant and MMPs Protein Expression Inhibitive Effect of Punica granatum L. Extract and Its Stabilization with Liquid Crystal Emulsion

석류추출물의 항산화와 MMPs 단백질 발현 억제 및 액정 유화물에서의 안정화에 관한 연구

Abstract

This study confirmed the potential of Punica granatum L. extract for functional activity verification and cosmetic development. The electron-donating ability of Punica granatum L. extract was shown 60.6% at a 1,000 ㎍/ml concentration. Its ABTS+ radical scavenging ability was shown 93.9% at a 1,000 ㎍/ml concentration. Additionally, the inhibitive effects of elastase and collagenase inhibition effects were measured as 30% and 47.2%, respectively, at a 1,000 ㎍/ml concentration. To determine the effect of Punica granatum L. extract on the proliferation of fibroblasts (CCD-986sk), cell viability was measured using a 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT) assay. As a result, survival rates of 130% or higher at a 500 ㎍/ml concentration or less were confirmed. According to the results of Western blot with Punica granatum L. extract, the expression inhibition rates of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), and matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) were decreased by 23.2%, 81.9%, and 69.2%, respectively, at a 100 ㎍/ml concentration. Based on the results above, O/W liquid crystal cream with 0.1% Punica granatum L. extract was prepared. The stabilities were tested at 4, 25, 45, and 50℃. By checking the pH, change over time, and stability by temperature, it was confirmed that all were stable for one month. Thus, Punica granatum L. extract shows potential as a natural material for cosmetics.

본 연구에서는 석류추출물의 기능성 활성 검증 및 화장품 개발을 위한 이용 가능성을 확인하였다. 전자공여능을 측정한 결과, 1,000 ㎍/ml의 농도에서 60.6%의 효과를 나타내었고, ABTS 소거능을 측정한 결과, 1,000 ug/ml의 농도에서 93.9%의 소거능을 보였다. 또한 elastase 억제 활성과 collagenase 억제 활성은 1,000 ㎍/ml의 농도에서 각각 30%와 47.2%의 억제 활성을 보였다. 석류추출물이 섬유아세포(CCD-986sk)의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 MTT법으로 세포 생존성을 측정한 결과, 500 ㎍/ml 이하의 농도에서 130% 이상의 생존율이 확인됐다. 석류추출물을 처리한 섬유아세포에서 MMP-1, MMP-2, MMP-3의 단백질 발현은 100 ㎍/ml의 농도에서 각각 23.2%, 81.9%, 69.2%의 저해율을 나타내었다. 위 결과를 바탕으로 석류추출물이 0.1% (w/v)의 농도로 함유된 O/W 액정크림을 제조하여 4, 25, 45, 50℃에서 pH, 시간에 따른 변화, 온도별 안정성 등의 안정성을 조사한 결과, 모두 1개월간 안정성이 있는 것으로 확인되었으며 석류추출물의 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.

서론

피부는 우리 몸의 대략 20% 이상을 차지할 정도로 우리 몸의 중요한 기관이며 크게 표피, 진피, 피하지방으로 구분된다. 특히 진피는 피부의 90% 이상을 차지하며 섬유아세포, 비만세포, 대식세포 등이 존재한다. 섬유아세포에서 유연한 결합 조직의 주요 세포 성분인 콜라겐(collagen)과 조직의 탄력섬유 성분인 엘라스틴(elastin)이 합성된다. 엘라스틴은 피부의 탄력을 유지하는 데 중요하다. 피부가 노화되면서 주름이 생기고 나이가 들어가면서 그 수나 깊이가 증가한다. 노화의 원인은 크게 내인성 요인과 외인성 요인으로 구분된다[13]. 내인성 요인에 의한 노화는 자연 노화를 말하며, 나이가 들면서 자연스럽게 피부의 구조와 생리적 기능이 계속해서 감퇴하여 진행되는 것이다. 외인성 요인에 의한 노화는 자외선 같은 외부 환경에 장기간 노출되어 진행되는 것이고 스트레스 및 음식에 의한 체내 활성산소 생성도 외인성 노화의 원인이다[1]. 섬유아세포에서 생성되는 elastase는 혈관 벽의 구성성분 중 하나이며 엘라스틴을 분해하는 효소이다. Elastase의 활성이 높아지면 피부의 엘라스틴과 콜라겐을 감소 시켜 피부에 주름이 생기는데 기여한다. 자외선 조사 후에 elastase 활성이 높아지는 것으로 보아 elastase 활성이 높아지면 자외선으로 인한 피부의 탄력 감소와 주름 생성의 주요 원인이라고 볼 수 있다 [38]. 따라서 활성산소를 방어할 수 있는 항산화제와 항노화에 기여하는 엘라스틴을 분해하는 elastase 및 콜라겐을 분해하는 collagenase의 활성을 억제할 수 있는 소재를 개발하면 주름 개선에 도움이 될 것이다.

에멀젼(emulsion)은 서로 섞이지 않는 두 액체를 섞었을 때 미세한 입자로 된 한쪽의 액체가 다른 액체 속에 분산되어있는 것을 말한다[29]. 여기서 분산이란 분산상의 입자들이 연속 상에 흩어져 있는 것을 말한다. 이때 두 상 사이에는 계면이 형성되며 막을 형성하거나 용액 중에서 미셀(micelle)을 형성하여 표면장력을 저하시킨다. 제형은 일반적으로 분산 상이 오일이고 연속상이물인 oil in water (O/W) 제형, 분산 상이 물이고 연속상이 일반 오일인 water in oil (W/O) 제형, 분산 상이 물이고 연속 상이 실리콘 오일인 water in silicon oil (W/S) 제형으로 나눈다. 최근에는 액정유화를 이용한 약물의 침투에 관한 연구들이 보고되고 있다 [23,36]. 액정(Liquid crystal)이란 고체와 액체의 중간 상태라고 정의할 수 있다[16]. 즉, 고체와 같이 분자 배열이 규칙적이지는 않지만 액체보다는 분자 배열이 비교적 규칙적 것을 액정 또는 메조 페이스 (meso-phase)라고 말한다[17,24]. 액정은 thermotropic 액정과 lyotropic 액정의 2종류로 나눌 수 있으며 thermotropic 액정은 분자의 병렬방식에 따라 smectic, nematic, cholesteric으로 분류할 수 있고 lyotropic 액정은 분자의 모양에 따라 cubic, lamellar, hexagonal로 분류할 수 있다 [18]. 액정유화의 장점은 여러 가지가 있다. 첫 번째로 인간의 세포 표면이나 세포 내 소기관은 수십 개의 얇은 막으로 덮여 있어 그 막이 액정상태의 분자층과 비슷한 구조(lamellar)를 형성하여 유효 성분의 흡수가 빠르다. 두 번째로 액정유화 타입은 점도가 높기 때문에 열에 민감하지 않은 폴리머를 함께 사용하면 각기 다른 온도에서도 제형의 안정성이 뛰어나게 된다. 세 번째로 보습력이 일반 O/W 제형에 비해 월등히 좋다. 흔히 O/W 제형은 피부도 포시에 외상 인물이 빠르게 증발하여 emulsion의 균형이 깨져 보습 효과가 상당히 감소한다[28].

석류(Punica granatum L.)는 석류나무의 열매이며 이란, 아프가니스탄, 히말라야가 원산지이다. 현재는 열대 및 아열대 지역에 광범위하게 퍼져 있는 식물로서이란, 미국 캘리포니아, 중국, 인도 등지에서 대량으로 재배되고 있다. 석류나무는 높이가 10 m에 달하며 줄기는 뒤틀리는 모양을 하고 있고 석류 열매는 둥근 모양으로 지름이 6∼8 cm이며 껍질의 두께는 0.15∼0.3 cm이다[14]. 석류는 주로 과즙이나 착즙으로 이용되며 먹을 수 있는 부분이 많지 않아 버리는 부분이 많은 과일이다. 석류 종자에는 갱년기에 좋은 에스트로겐이 들어있고 석류 과즙은 강장제로 알려져 있으며 설사할 때나 부인들의 냉병 및 피부 부스럼에 흔히 사용한다. 석류 열매/껍질에는 탄닌성분이 다량 함유되어 있어 수렴제나 설사, 이질, 대하 증의 치료에 쓰이며 휘발성 알칼로이드가 들어있어 각종 기생충을 없애는 효능이 있다 [10].

본 연구는 다양한 생리활성을 가진 석류추출물에 대한 화장품 제조를 위한 기능성 소재로의 활용 가능성을 검증하였고, 석류 추출물의 유효성분을 효율적으로 피부 깊숙이 전달할 수 있도록 O/W 액정유화 emulsion 에 첨가하여 제형의 안정성을 확인함으로써 기능성을 가진 천연 소재로서의 가능성을 검토하였다.

재료 및 방법

재료 및 시료 추출

본 실험에서 사용된 석류 추출물은 K 한약재에서 동결 건조된 켈리포니아산 석류 열매를 구매하여 70% (v/v) 에탄올로 추출하여 제조하였다. 석류 열매를 파쇄시킨 후 70% (v/v) 에탄올을 시료의 10배의 양으로 첨가하여 상온에서 24 hr 동안 침지하였다. 그런 다음 침전물을 제거한 상등액을 여과지 (Whatman No.2)를 사용하여 여과하였다. EYELA evaporator 로 상등액의 감압 농축을 실시하여 에탄올을 제거한 후 동결건조하여 수분을 완전히 제거한 후 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

세포주

본 실험에 이용한 섬유아세포인 CCD-986sk는 ATCC (Amer- ican Type Culture Collection, USA)에서 분양받았다.

시약 및 기기

전자공여능 측정 실험에 사용한 시약은 2, 2-diphenyl-1- picryl-hydrazyl (DPPH)이며 라디칼 양이온 탈색 분석인 ABTS⁺ radical 측정 실험에 사용한 2, 2-azino-bis (3-ethylbenzothiazo- line-6-sulfonic acid)는 Wako Pure Chemical Industries. Ltd. (Japan)에서 구입하였다.

주름 개선 활성 측정에 사용된 시약인 N-succinyl-L-ala-ala- ala-p-nitroanilide, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu- Gly-Pro-D-Arg, elastase, collagenase 등은 Sigma-Aldrich Corporation (USA)에서 구입하였다. 주름과 관련된 단백질 발현 정도를 조사하기 위한 실험에 사용된 β-actin, MMP-1, MMP-2, MMP-3 primary antibody와 anti-mouse, anti-rabbit 등의 secondary antibody는 Santa Cruz (USA)에서 구입하여 사용하였다.

세포 배양에 사용한 dulbecco`s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), penicillin/streptomycin, trypsin은 Thermo Scientific Hyclone (USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포독성 측정 실험에 사용된 시약인 3-[4, 5-dimethylthiazol]-2-yl]-2, 5-di- phenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Corpo- ration (USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 BioShop (Canada)에서 구입하였다.

실험에 사용된 기기는 freeze drier (ILShin BioBase Co. Korea), rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), vortex (Scientific Industries, Inc., USA), microplate reader (Tecan, Austria), CO₂ incubator (Vision Scientific, Korea), UV/VIS spectrophotometer (Hitachi, Japan), centrifuge (Hanil Science Industrial Co., Korea), microscope (Olympus, Japan), pH meter (Mettler-Toledo AG, Switzerland), autoclave (JS Research Inc., Korea), Mini-PROTEAN^® tetra cell (Bio-Rad, USA), micro centrifuge (Gyrozen, Korea), digital shaker (Daihan Scientific, Korea), Davinch-Chemi^™ Imager CAS-400 SM System (Davinch-K Co., Korea), disper mixer (T.K Homo Disper, PRIMIX, Japan), homo mixer (T.K Homo Mixer Mark Ⅱ, PRIMIX, Japan), rheo meter (SUN Scientific Co., Japan), water base C-WBE (Chang Shin Scientific Co., Korea)를 사용하였다.

실험 방법

전자공여능 측정

전자공여능 측정은 Blois의 방법[2]을 변형하여 실험하였다. DPPH 용액 60 μl와 70% 에탄올 용매에 녹인 각 농도별 석류 추출물을 120 μl씩 넣고 혼합하여 암실 조건에서 실온기준 15 min 동안 방치하였다. 그런 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm 흡광도로 설정한 후 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

\(\text { 전자공여능 }(\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 } \text { 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

ABTS⁺ 라디칼 탈색 분석

ABTS⁺ 라디칼 탈색 분석은 Pellegrini 등의 방법[32]을 이용하여 항산화 활성을 알아보는 방법으로 2.45 mM potassium persulfate와 7 mM 2, 2-azino-bis (3-ethyl-benthiazoline-6- sulfonic acid)를 섞어준 후 실온에서 24 hr 동안 반응시켜 라디칼의 생성을 유도한 후 ABTS⁺를 형성시킨다. 이후 에탄올로 희석한 후 시료 100 μl와 ABTS⁺ 100 μl을 혼합하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 소거능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

\(\mathrm{ABTS} \text { 소거 능 }(\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨 가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

Elastase 저해활성 측정

Elastase의 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법[3]에 따라 실시하였다. 시험용액을 일정 농도가 되도록 희석한 후 40 μl 씩 96 well plate에 분취하고, 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5 U/ml) 40 μl을 첨가하였다. 기질로 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-L(ala)3-p-nitroanilide (0.5 mg/ml)을 80 μl를 첨가하여 30 min 동안 반응시킨 후p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

\(\text { 저해율 }(\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

Collagenase 저해활성 측정

Collagenase의 저해활성 측정은 Wünsch E와 Heindrich HG 의 방법[37]에 따라 측정하였다. 즉, 반응구는 0.1 M tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하고, 4-phenylazo- benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3 mg/ml)를 녹인 기질액 125 μl와 시료 용액 50 μl의 혼합액에 collagenase (0.2 mg/ml) 75 μl를 첨가하여 실온에서 20 min 동안 방치하였다. 6% citric acid 250 μl를 넣어 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate 1.5 μl을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

\(\text { 저해율 }(\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

세포 배양

CCD-986sk 세포는 10% (v/v) FBS와 1% (v/v) penicillin/ streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다 [9].

MTT assay에 의한 세포 독성 측정

CCD-986sk 세포를 96 well plate에 1×10⁶ cells/well이 되도록 180 μl씩 분주하였고, 시료를 농도별로 조제하여 20 μl를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24 hr 동안 배양하였다. 여기에 2.5 mg/ml의 농도로 제조한 MTT 용액 40 μl를 첨가하여 3 hr 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well 당 DMSO 100 μl를 첨가하여 실온에서 10 min 동안 반응시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

\(\text { 세포 생존율 }(\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

Western blot을 통한 단백질의 발현 측정

주름 형성 원인과 관련된 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), matrix met- alloproteinase-3 (MMP-3)의 단백질 발현 정도를 알아보기 위해 세포주 CCD-986sk을 조직배양 dish (100 mm)에서 24 hr 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 1x PBS로 2번 세척한 후 배지를 첨가하고 추출물을 농도별로 처리한 후 24~48 hr 동안 배양한 후 다시 배지를 제거하고 1x PBS로 2번 세척하였다. Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer 10 ml에 complete mini 1 tab을 첨가한 용액 100 μl로 세포를 용해하고 4℃, 13, 200 rpm에서 20 min 간 원심분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하여 동일 농도의 단백질 용액 20 μl를 10% SDS-PAGE 상에서 전기영동 하여 분리하였다. 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮긴 다음 실온에서 1 hr 동안 blocking buffer (5% skim milk in TBST)를 이용하여 실온에서 blocking을 실시하였다. Primary antibody를 1:1, 000로 희석하여 첨가한 후 실온에서 150 min 동안 반응시킨 뒤, 다시 10 min 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3회 세척한 후 secondary antibody를 1:2, 000로 희석하여 첨가한 후 실온에서 90 min 동안 반응시켰다. 10 min 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3회 세척한 후 Davinch-Chemi^TM imager CAS-400SM system를 이용하여 밴드를 확인하고 정량하였다.

석류추출물을 첨가한 액정 emulsion 처방 및 방법

석류추출물을 첨가한 O/W liquid crystal emulsion은 Table 1의 처방에 맞춰 Fig. 1과 같은 공정으로 제조하였다. 먼저 A 상의 점증제인 carbomer를 칭량하여 disper mixer (T.K Homo Disper, PRIMIX, Japan)로 교반 하여 완벽히 풀어준 후 나머지 A상을 칭량하여 녹였다. 이후에 A 상 전체를 메인 가마에 투입하여 homo mixer (T.K Homo Mixer Mark Ⅱ, PRIMIX, Japan) 는 1, 200 rpm, paddle mixer는 18 rpm의 속도로 교반하면서 80℃까지 가온하였다. 유상가마에 B 상을 homo mixer는 1, 000 rpm, paddle mixer는 18 rpm의 속도로 교반하면서 80℃까지 가온하여 녹인 후 A 상에 천천히 넣으면서 homo mixer는 2, 000 rpm, paddle mixer는 22 rpm의 속도로 15 min 동안 유화하였다. 유화 직후 60℃로 냉각하여 C 상을 넣고 10 min 동안 중화하면 점도가 높아지므로 homo mixer의 rpm은 중화가 끝날 때까지 2, 500 rpm을 유지하였다. 45℃에서 석류추출물인 D상을 투입하여 10 min 동안 homo mixer는 2, 000 rpm, paddle mixer는 18 rpm의 속도로 교반 하였다. 그 이후에 탈포하면서 30℃까지 서서히 냉각시킨 후 150 mesh의 필터로 여과하였다.

Table 1. The experimental formulation of the liquid crystal O/W emulsion containing Punica granatum L. extract

Fig. 1. Manufacturing method of O/W liquid crystal emulsion containing Punica granatum L. extract.

액정 구조 형성 원리 및 확인 방법

액정상은 편광 현미경으로만 관찰이 가능하며 일반 광학현미경으로는 관찰할 수 없고 일반 유화 입자만 관찰이 가능하다. 액정구조는 계면활성제의 농도와 지방알코올의 종류 및 함량 비율이 굉장히 중요하며 보통 인지질 이중층과 같은 원형의 라멜라 액정 구조를 형성한다. -OH기를 3개가진 천연보습제인 글리세린은 세라마이드와 같은 지질 성분을 팽윤 시켜 액정상을 만드는 데 도움을 주며 이러한 지질 성분들은 액정 구조를 좀 더 견고하고 두껍게 만드는 데 도움을 준다 [11,20]. 액정 확인을 위해 72 hr 동안 냉장조건에서 숙성시키고 슬라이드 글라스(slide glass)에 미량의 시료를 올린 후 커버 글라스(cover glass)로 가볍게 덮고 고르게 펼친 다음에 편광 현미경으로 액정을 관찰하였다. 제대로 된 액정을 관찰하기 위해 대물렌즈를 최대한 시료에 접근시키고 굴절각이 직각이 되도록 90°로 맞춰준 후 빛 세기를 조절하여 액정이잘 보일 수 있도록 하였다. 또한 유화 상태를 확인하기 위해 광학 현미경으로 유화 입자를 관찰하였다.

pH 측정

pH meter를 이용하여 화장품 제형의 pH를 측정하였다. 4℃, 25℃, 45℃, 50℃에 보관한 석류 추출물이 함유된 O/W liquid crystal emulsion의 pH와 대조군으로 석류추출물이 함유되지 않은 샘플의 pH를 측정하였다. 정확한 측정을 위해 calibration을 진행한 후 측정하였고 pH 측정은 모두 25℃에서 진행하였다.

온도에 따른 제형 안정성 시험법

인큐베이터의 온도 조건을 각각 4℃, 25℃, 45℃, 50℃로 설정하여 25 ml 용량의 샘플 병에 O/W liquid crystal emulsion 을 각각 반 정도 채운 후 Table 2와 같은 조건으로 경시적인 변화를 보았으며 모든 측정은 25℃에서 진행하였다.

Table 2. Check points in stability test of the O/W liquid crystal emulsion containing Punica granatum L. extract in con- stant temperature condition (4, 25, 45, 50℃)

결과 및 고찰

전자공여능 측정 결과

전자공여능 활성 측정에 사용한 2, 2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH)는 비교적 안정한 free radical로 시약 자체로는 보랏빛으로 되어 있으며 방향족 화합물이나 방향족 아민류에 의해 환원되면서 색깔이 변하는 원리를 이용한다[7]. 517 nm 에서 흡광도 측정 시 환원이 되면 황색으로 변한다. Free radical은 활성산소종의 하나이며 대부분 호흡하는 생물에서 필수적으로 생성되는 부산물 또는 외부물질을 해독하는 과정에서 페놀계 물질이나 그 외의 고리형 물질들을 만드는 과정에서 생겨날 수 있다 [31]. 이러한 free radical은 살균 작용 외에 세포 밖으로 유출되어 주변 세포 및 조직을 파괴하며 이러한 과정에서 단백질이 손상되어 노화를 촉진시킨다[15]. 항산화 물질 및 페놀 화합물은 free radical에 전자를 넘겨 소거 또는 중화 시켜 노화를 방지하는 데 도움을 준다. 석류추출물의 전자공여능 측정 결과를 Fig. 2에 나타내었으며, 농도가 증가함에 따라 전자공여능이 증가하는 것을 확인할 수 있었고 500 μg/ ml의 농도에서 32.5%의 효과를 보였으며, 1, 000 μg/ml에서는 60.6%의 높은 활성을 보였다. Lee 등[22]의 연구에 따르면 3, 000 μg/ml의 농도에서 하수오 추출물의 활성이 56.75%로 보고되었으며 Cha 등[4]의 두릅 순 수용성 추출물은 1, 000 μg/ ml 농도에서 28.69%의 활성이 있다고 보고되었다. 이러한 연구 결과와 비교했을 때 석류 추출물의 전자공여능이 높은 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 2. Electron donating ability of Punica granatum L. extract. Each value represents mean ± SD of three individual experiments. Significant as compared to control (*p<0.05, **p<0.01).

ABTS⁺ 라디칼 탈색 분석 결과

ABTS⁺ 라디칼 탈색 분석은 2, 2-azino-bis (3-ethyl-benthia- zoline-6-sulfonic acid)와 potassium persulfate를 혼합하여 청록색을 띠는 ABTS⁺을 생성한 후 석류 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 청록색에서 연한 녹색으로 탈색되는 원리이다.

석류추출물의 ABTS⁺ 라디칼 탈색 분석을 측정한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 추출물의 농도가 증가함에 따라 소거능이 증가하였으며 500 μg/ml의 농도에서 58.6%, 1, 000 μg/ml 의 농도에서 93.9%의 높은 효과를 나타내어 ABTS 소거능이 우수함을 확인할 수 있었다. Joo [12] 의 연구에 따르면 약용식물 추출물의 항산화 효과 비교 실험에서 ABTS⁺ 라디칼 소거 능의 결과, 약용식물인 감국, 참빗살나무, 합환 피, 쇠비름의 70% (v/v) 에탄올 추출물의 경우, 500 μg/ml의 농도에서 각각 52.47%, 52.58%, 43.43%, 30.31%의 활성이 보고되었으며 Park [30]의 씀바귀의 에탄올 추출물이 1, 000 μg/ml의 농도에서 8.09%의 항산화 활성이 있다고 보고하였다. 이러한 연구 결과와 비교했을 때 석류추출물의 ABTS⁺ 소거 능이 높은 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. ABTS⁺ radical scavenging ability of Punica granatum L. extract. Each value represents mean ± SD of three in- dividual experiments. Significant as compared to control (*p<0.05, **p<0.01).

Elastase 저해활성 측정 결과

Elastase는 구조 단백질인 fibronectin, collagen, elastin을 포함한 다양한 단백질들을 분해한다[6]. Elastase는 진피 내에서 분비하는 백혈구의 효소 중 하나이며 자외선 노출 또는 피부의 다른 기질 단백질 분해효소로 인해 elastase 농도가 증가하여 collagen, elastin 등을 분해하여 조직 파괴의 직접적인 원인이 되고 결과적으로 피부 탄력을 감소시킴으로써 주름을 생성한다. 이러한 elastase 활성을 저해함으로써 피부의 주름 생성을 억제할 수 있다. 석류추출물이 elastase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, Fig. 4와 같이 추출물의 농도가 증가함에 따라 저해 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 최고농도인 1, 000 μg/ml의 농도에서 30%의 저해활성을 나타내었다. Lim 등[25]의 포공영 에탄올 추출물과 열수 추출물이 1, 000 μg/ml의 농도에서 각각 21.6%, 12.2%의 활성이 있다고 보고하였으며 Kwak 등[19]은 각종 약용식물의 elastase 저해 효과가 1, 000 μg/ml의 농도에서 30% 미만의 저해 활성이 있다고 보고하였다.

Fig. 4. Inhibition rate of Punica granatum L. extract on elastase activity. Each value represents mean ± SD of three in- dividual experiments. Significant as compared to control (*p<0.05, **p<0.01).

이러한 연구 결과와 비교했을 때 석류 추출물의 elastase 저해활성이 유의한 것을 확인할 수 있었다.

Collagenase 저해활성 측정 결과

세포 외 기질은 조직 안에 있는 세포에서 분비되어 조직 내의 세포들을 결합시켜주는 물질이다. 세포외 기질 성분으로는 대표적으로 collagen, fibronectin, laminin, elastin 등이 있으며 피부 진피의 90%를 차지하는 것이 바로 collagen이다[8].

Collagen은 피부의 유연한 결합조직으로 형태와 강도를 유지시킨다. 또한, collagen은 다양한 세포 외 기질과 가교 결합을 하는데 collagen이 collagenase에 의해 가수 분해되면 가교 결합을 이루지 못해 피부 형태 유지가 어려워져서 주름이 생기게 되고 elastin도 본래의 기능을 하지 못해 피부의 탄력이 떨어지게 된다[21]. Collagen은 세포 외 기질 중에서도 높은 비율을 차지하므로 collagenase에 의해 가수 분해되면 피부 주름에 있어 큰 영향을 미칠 수 있다 [26]. 석류추출물이 생성을 촉진시키는 collagenase 활성에 미치는 결과, Fig.5와 같이 500μg/ml의 농도에서 000μg/ml의 농도에서는 47.2%로 활성을 활성 억제 효과는 농도가 증가함에 따라 확인할 수 있었다. Cho 등[5]의 지골피, 빈랑자에탄올 추출물은 1, 250μg/ml의 농도에서 각각 10%, 30%의 활성 억제가 보고되었다. 이러한 연구 결과와 석류추출물이 피부의 주름 생성을 촉진시키는 collagenase 활성에 미치는 영향을 측정한 결과, Fig. 5와 같이 500 μg/ml의 농도에서 31.1%, 1, 000 μg/ml의 농도에서는 47.2%로 활성을 억제하였으며, collagenase 활성 억제 효과는 농도가 증가함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Cho 등[5]의 지골피, 빈랑자에탄올 추출물은 1, 250 μg/ml의 농도에서 각각 10%, 30%의 collage- nase 활성 억제가 보고되었다. 이러한 연구결과와 비교했을 때 석류추출물의 collagenase 저해 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 5. Inhibition rate of Punica granatum L. extract on collagenase activity. Each value represents mean ± SD of three individual experiments. Significant as compared to con- trol (*p<0.05, **p<0.01).

MTT assay에 의한 세포 생존율 측정 결과

석류추출물이 섬유아세포(CCD-986sk)의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. Fig. 6과 같이 석류추출물을 농도별(5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/ml)로 처리하였고, 그 결과 500 μg/ml의 농도 이하에서는 130% 이상의 생존율을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 세포 생존율이 100% 이상의 농도인 25, 50, 100 μg/ml의 농도에서 사용하였다.

Fig. 6. Cell viability of extracts from Punica granatum L. on fibroblast cell (CCD-986sk). Each value represents mean ± SD of three individual experiments. Significant as compared to control (*p<0.05, **p<0.01).

Western blot을 통한 단백질 발현 측정 결과

Matrixin이라고 알려진 matrix metallopeptidases (MMPs) 는 Zn⁺⁺에 의해 활성화되는 내 인성 proteinase로서 collagen, fibronectin, laminin, elastin 등으로 이루어진 세포 외 기질을 분해하여 구조를 붕괴하는 데 중요한 역할을 하는 효소이며 MMP-1과 MMP-3는 섬유아세포에서 IL-β에 의해 유도되고 MMP-1은 type Ⅰ, type Ⅱ, type Ⅲ collagen을 분해하고 MMP- 2는 type Ⅳ, type Ⅴ collagen을 분해하며, MMP-3는 type Ⅲ, type Ⅳ collagen을 주로 분해한다[27,33].세포막에 존재하는 막형 MMPs가 주로 MMP-2를 활성화시킨다고 알려져 있다 [34,35]. 주름 개선을 위해서는 이러한 matrix metallopep- tidases (MMPs)의 활성이나 발현 억제가 중요하며, 석류추출물이 이와 같은 단백질의 발현과 연관이 있는지 알아보기 위해 Western blot을 통해 CCD-986sk 세포 내의 MMP-1, MMP-2, MMP-3 단백질의 발현양을 Fig. 7과 같이 확인하였다. MMP- 1의 단백질 발현을 조사한 결과, 석류 추출물을 처리하지 않은 control 군과 비교했을 때 100 μg/ml의 농도에서 23.2%의 발현 억제를 보였다. MMP-2와 MMP-3는 100 μg/ml의 농도에서 각각 81.9%, 69.2%로 단백질 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 7. Effect of Punica granatum L. on MMP-1 (A), MMP-2 (B), MMP-3 (C) protein expression. Each value represents mean±SD of three individual experiments.

유화 입자 및 액정 구조 형성 확인 결과

액정구조를 확인하기 위해서 Table 1의 조성비로 각각 O/ W liquid crystal emulsion을 제조하였다. 장기간 액정을 유지하기 위해서는 반드시 제형의 안정성을 확보해야 한다. 제형 안정성면에서 carbomer는 고온 안정성에 중요한 역할을 하며 emulsion 입자 상태에 영향을 줄 수 있다. 석류추출물에는 폴리페놀류 등의 다양한 유효성분들이 들어 있어 비교적 낮은 pH를 나타내고 있기 때문에 제형의 안정성에 영향을 줄 수 있기 때문에 액정을 형성하는 데 있어 유화제의 선택이 한정적이다.

Polyethylene glycol (PEG) 과 같은 성분들이 들어가면 유화 입자가 좀 더 일정하고 작게 많이 만들어지고 제형 안정성이 좋아질 수 있으나 오히려 액정이 무너지거나 잘 형성되지 않을 수 있다. Fig. 8과 같이 광학현미경으로 대물렌즈를 40배로 확대하여 각각의 유화 입자 상태를 확인하였고 Fig. 9와 같이 편광현미경으로 각각의 제형에 대한 액정 상태를 확인하였다.

Fig. 8. Photographs of emulsified particles observed with an optical microscope. T-1 sample contained 0.1% carbomer, T-2 sample did not contain extract and the carbomer content was 0.2%, T-3 sample contained carbomer content 0.2% and the extract 0.1%. T-4 sample contains glyceryl stearate and PEG-100 stearate emulsifier in T-3 sample.

Fig. 9. Photographs of liquid crystal structure observed with polarization microscope. T-1 sample contained 0.1% carbomer, T-2 sample did not contain extract and the carbomer content was 0.2%, T-3 sample contained carbomer content 0.2% and the extract 0.1%. T-4 sample contains glyceryl stearate and PEG-100 stearate emulsifier in T-3 sample.

T-1은 일정한 크기의 액정들이 많이 만들어졌으나 다른 제형들에 비해 빈 공간이 많아 유동성이 커서 점도가 가장 낮았고 고온 안정도에서 액정이 서서히 사라지는 것을 관찰하였다. T-2는 액정의 크기가 일정하지는 않지만 제형 안정도가 좋았고 액정도 오래 유지되었다. T-3는 T-2 제형에 석류추출물을 0.1% (w/v)가 되게 첨가한 것으로 제형 안정도에 크게 영향을 주지 않았다. T-4는 T-3 제형에 PEG 성분이 포함된 유화제를 0.5% (w/v)가 되도록 첨가하면 광학현미경으로 관찰했을 때는 유화 입자가 많고 크기가 작고 일정하였으며 유동성이 가장 적어 점도가 가장 높았지만 편광현미경으로 관찰했을 때는 액정 유화 입자는 거의 없거나 망가져 있었다. 그 결과 전체적으로 제형 안정도가 좋았고 액정이 오래 유지되며 석류추출물의 효능을 기대할 수 있는 T-3가 제품을 개발하는 데 있어 가장 적합하다고 판단된다.

pH 측정 결과

피부는 박테리아로부터 몸을 보호하기 위해 일반적으로 pH 4.5~5.5의 약산성 또는 미 산성 pH를 유지하고 있다. 따라서 화장품의 pH가 약산성 또는 중성 이하가 되어야 피부의 민감도를 낮추고 자극을 최소화할 수 있다. pH에 따라 제형의 안정성이 달라질 수 있으므로 pH 변화는 일정 범위 내에서 안정해야 한다. 석류추출물을 0.1% (w/v)가 되게 첨가한 O/ W liquid crystal emulsion T-3 제형을 각각의 온도에서 30일간 측정하였고 pH 측정 결과, Fig. 10 와 같이 일정하게 나타났다. 대조군으로 석류추출물을 첨가하지 않은 T-2 제형을 각각의 온도에서 30일간 측정한 결과, Fig. 11 와 같이 일정하게 나타났다. 석류추출물을 0.1% (w/v)가 되게 첨가한 제형의 pH 가 더 낮은 것으로 보아 석류 추출물에는 산성 pH를 가진 성분들이 들어있는 것으로 판단된다.

Fig. 10. pH changes on the T-3 formulation. (T-3 : formulation of the O/W liquid crystal emulsion containing 0.1% (w.v) Punica granatum L. extract).

Fig. 11. pH changes on the T-2 formulation. (T-2 : formulation of the O/W liquid crystal emulsion without Punica granatum L. extract).

온도에 따른 제형 안정성 실험 결과

일반적으로는 4℃, 25℃, 45℃에서 안정성을 측정하여 제형의 안정성을 확인한다. 가혹 조건에서의 안정성을 확인하기 위해 50℃를 추가하여 측정하였다. 45℃ 이상의 고온에서는 변색, 변취, 점도 감소 및 수분 증발로 인한 제형 분리 등을 확인할 수 있고 4℃의 저온에서는 석출, 응고, 제형 분리, 침전 등을 확인할 수 있다. 보통 저온에서 제형이 분리되는 제형은 O/W 제형에서는 관찰되지 않았고 외상에 분체가 분산되어있는 W/O 저점도 제형에서 관찰되었다. 이러한 현상들이 일어나는지 확인하기 전에 먼저 석류 추출물을 첨가하지 않고 폴리머인 carbomer의 함량만 다르게 한 T-1 제형과 T-2 제형의 온도에 따른 점도 안정성을 확인한 결과를 Table 3에 나타내었다.

Table 3. Viscosity stability test of O/W liquid crystal emulsion according to polymer content in constant temperature condition (4, 25, 45, 50℃)

그런 다음 온도 변화에 따른 제형 안정성이 더 좋았던 T-2 제형에 석류추출물을 0.1% (w/v)가 되게 첨가한 T-3 제형의 안정성을 평가한 결과를 Table 4에 나타내었다. 그 결과, 성상, 냄새, 점도가 온도에 따라 변화 없이 30일 동안 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.

Table 4. Stability test of the O/W liquid crystal emulsion containing Punica granatum L. extract in constant temperature condition(4, 25, 45, 50℃)

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.