Inhibition of Lipid Accumulation in 3T3-L1 Adipocytes by Different Enzymatic Hydrolysates of Dried Red Sea Cucumber Stichopus japonicus

건조 방법에 따른 홍해삼(Stipchopus japonicus) 효소 가수분해물의 지방 축적 억제 효과

Abstract

Red sea cucumber Stichopus japonicus, was dried using three methods-far-infrared ray, vacuum, and freeze drying and then enzymatically hydrolyzed using nine proteases: Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Neutrase, Protamex, trypsin, α-chymotrypsin, and papain. In addition, the potential ability of hydrolysates to inhibit lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes was evaluated. The yield of hydrolysates from red sea cucumbers dried using each method was higher than that of the distilled water extract, and protein contents were either similar or higher. The hydrolysates that exhibited inhibitory effects on lipid accumulation, as demonstrated via Oil red O staining, were those obtained by far-infrared ray drying coupled with Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, or Neutrase treatment. In addition to the advantages of far-infrared drying and the characteristics of Flavourzyme, the Flavourzyme hydrolysate of far-infrared-dried red sea cucumber showed the highest inhibitory effect on lipid accumulation. In addition, this hydrolysate significantly decreased the expression of the protein factor fatty acid-binding protein 4, which is related to the late differentiation of 3T3-L1 adipocytes. Taken together, these results suggest that Flavourzyme hydrolysates from farinfrared-dried red sea cucumber may be used as a functional food and/or a pharmaceutical ingredient for the inhibition of lipid accumulation.

서론

현대 사회는 식생활의 서구화, 생활환경의 변화 및 가공식품 증가에 따른 과다 영양 섭취와 신체활동량의 감소로 인해 비만인구가 급증하고 있다(Kim et al., 2017). 비만이란, 에너지 섭취가 소비를 초과하는 에너지 불균형에 의해 지방 세포 수 및 세포 내지질의 크기를 증가시킴으로써 인체 내 지방이 과도하게 축적되어 나타나는 현상이다(Hwang et al., 2019). 또한, 비만은 비만 자체로도 심각한 문제가 되지만 고혈압, 제 2형 당뇨, 고지혈증, 관절염 등과 같은 만성 퇴행성 질환을 유발하는 주요 원인으로 알려지면서 심각한 질환으로 인식되고 있다(Lee et al., 2017). 따라서, 대사질환을 야기하는 비만을 예방 및 치료를 위한 약물 개발의 연구가 계속되고 있으며 비만 치료제 시장은 점차 증가하고 있다. 유통되고 있는 비만 치료제인 제니칼(xenical)은 지방의 흡수를 떨어뜨리는 역할을 하지만 지방 변, 배변 실금 등을 유발한다는 보고가 있어 사용에 제한이 크며, 시부트라민(sibutramine)의 경우 심혈관계 부작용을 나타나는 사례가 있어 처방 및 판매가 금지되었다(Jun et al., 2004). 이처럼 인공적으로 합성된 의약품의 부작용을 최소화 하기 위해 최근에는 천연물로부터 비만 예방 및 치료제 개발의 필요성이 요구되고 있다. 지방전구세포는 분화를 거쳐 지방세포로 되는 과정에서 세포의 형태적 변화와 유전자 발현 등의 생화학적 변화를 통해 체내에 지방을 축적하게 된다(Kim et al., 2017). 지방전구세포는 insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-methylxantine(IBMX) 등의 분화유도인자를 첨가하였을 때 지방세포로 분화하게 되는데 이러한 분화 과정은 분화유도인자에 의해 분화 초기 전사인자와 분화 후기 전사인자의 발현을 유도하게 되고 지방세포로의 지방세포형성 분화 조절이 이루어지게 된다(Kim et al., 2017). 따라서, 지방세포 분화과정에서의 분화 초기 및 분화 후기 전사인자의 발현을 조절할 수 있는 천연물질을 찾는 것이 핵심이다.

최근 해양생물자원에서 유래된 새로운 생리활성물질에 관한 연구는 전세계적으로 증가하고 있다. 또한, 다양한 구조와 생리활성의 특이성을 가지고 있어 연구 및 개발에 많은 관심이 집중되고 있다. 생체 활성 펩타이드는 단백질의 효소 분해에 의해 생성되며 장의 소화 과정을 거쳐 잠재적인 생리활성물질로 작용할 수 있다(Ko et al., 2013). 때문에 광어, 미더덕, 해마 등 해양생물 유래 가수분해물과 이로부터 분리된 펩타이드의 다양한 생물학적 기능에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Ko et al., 2012; Ko et al., 2013; Ko and Jeon, 2015; Kim et al., 2016; Kim et al., 2019). 그 예로 Park et al. (2011)은 홍어껍질로부터 피부세포의 결합조직을 구성하는 주요 성분인 콜라겐 분해에 관여하는 matrix metalloproteinase (MMP) 특히, 주름 형성에 관여하는 MMP-1 즉, collagenase-1의 활성을 저해하는 펩타이드인 Leu-Asp-Val-Leu-Glu-Val-Phe를 분리하였다. 그리고, Ko et al. (2012)은 미더덕 살(tissue) 부위로부터 효소 가수분해한 뒤 Ala-His-Ile-Ile-Ile 펩타이드를 얻었는데 이 펩타이드는 체내 체액의 양을 조절함으로써 혈압을 조절하는 renin-angiotensin 시스템의 중심 성분인 Angiotensin-converting enzyme (ACE)을 억제시키는 효능을 나타낸다. 이외에도 광어 근육으로부터 얻은 펩타이드 Val-Cys-Ser-Val (VCSV)과 Cys-Ala-Ala-Pro (CAAP)는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrzayl (DPPH) 자유 라디칼을 소거하며 세포 내에서 산화적 스트레스에 의해 발생하는 세포 내 활성산소와 세포사멸을 억제시키는 것으로 밝혀졌다(Ko et al., 2013). 해삼(Stichopus japonicas)은 한국, 일본 등 아시아 일대에서 자생하고 있는 돌기해삼과의 한 종으로 무척추동물로서 유연하고 길쭉한 모양의 몸체를 나타내며 아시아에서 식용 및 약용으로 이용되어 왔다(Jeon et al., 2018). 해삼은 녹색, 흑색 및 적색의 세 가지로 분류되며 적색을 띄는 홍해삼(red sea cucumber)은 일반적으로 해안에서 자갈과 같은 독특한 서식지에서 발견되며 다른 색의 해삼과 다른 유전체 및 색소체가 관찰된다(Ding et al., 2018). 선행 연구에 따르면 홍해삼의 특유한 특징으로 항산화, 항염, 항암, 항균, 멜라닌 생성 억제, 주름 개선 등의 다양한 기능성을 나타낸다고 보고되었다(Liu et al., 2012; Park et al., 2012; Jeon et al., 2017; Ding et al., 2018; Jeon et al., 2018). 또한, 해삼의 주성분이 단백질로 알려져 있으나 단백질 성분의 기능성에 관한 보고는 미비하고, 주로 에탄올 추출물의 효능에 관한 연구가 보고되었다. 또한, 제주산 홍해삼의 종묘생산기술은 2006년부터 가능하였지만 제주도에서 양식하는 홍해삼의 기능성, 유용성분의 함량 등에 관한 연구가 미흡한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 제주도 특화 홍해삼으로부터 단백질 효소 가수분해 방법을 이용하여 얻은 다량의 단백질이 함유된 가수분해물의 지방세포 분화과정에서 지방축적 억제와 분화 초기 및 분화 후기 전사인자의 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하였다.

재료 및 방법

실험 재료

본 실험에 사용된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum (BS), penicillin/streptomycin (P/S), phosphate buffered saline (PBS), EDTA-trypsin은 Gibco-BRL (Burlington, ON, Canada)에서 구입하였으며, 상업용 식품 단백질 분해 효소인 Alcalase 2.4 L FG, Flavourzyme 500 MG, Kojizyme 500 MG, Neutrase 0.8 L, Protamex는 Novo Co. (Novozyme Nordisk, Bagasvaerd, Denmark)에서 구입하였고, pepsin, trypsin, a-chymotrypsin, papain 단백질 분해 효소와 insulin, dexamethasone, IBMX, Oil red O, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoluim Bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 단백질 발현에 사용된 anti-SREBPc-1, anti-FABP4, anti-GAPDH는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 이 외에 사용 된 다른 화학 물질과 시약은 분석 등급을 사용하였다.

홍해삼 재료 및 효소 가수분해물 제조

본 실험에 사용된 홍해삼은 한국해양과학기술원 제주연구소의 제주특성연구센터로부터 제공 받았으며, 흐르는 물로 수세하여 염분과 협잡물을 제거하고, 원적외선, 진공 및 동결 건조 등 세 가지 방법으로 건조하여 사용하였다. 세 가지 방법으로 건조된 홍해삼은 가수분해 전 분쇄기로 균질화시켜 효소 가수분해를 하였다. 홍해삼의 효소 가수분해는 Ko et al. (2012)의 방법에 따랐다. 홍해삼 분말을 증류수에 넣고 효소에 대한 기질의 비율을 100:1로 하여 식품 단백질 가수분해 효소인 Alcalase 2.4 L FG, Flavourzyme 500 MG, Kojizyme 500 MG, Neutrase 0.8 L, Protamex와 소화 효소 pepsin, trypsin, α-chymotrypsin, papain을 각각 첨가하여 각 효소의 반응 최적 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 각 효소의 최적 조건은 다음과 같다: Alcalase, pH 8.0, 50°C; Flavourzyme, pH 7.0, 50°C; Kojizyme, pH 6.0, 40°C; Neutrase, pH 6.0, 50°C; Protamex, pH 6.0, 40°C; pepsin, pH 2.0, 30°C; trypsin pH 8.0, 37°C; α-chymotrypsin, pH 8.0, 37°C; papain, pH 8.0, 37°C. 그 후, 가수분해물을 pH 7.0으로 조정하고, 효소 반응을 불활성화 시키기 위하여 100°C에서 10분간 가열하였다. 그리고, 물 추출물의 제조를 위하여 홍해삼 분말을 증류수에 넣고 24시간 동안 상온에서 교반하여 추출하였다. 각 효소 가수분해물과 물 추출물의 잔류물을 제거하기 위하여 3,000 g, 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 잔사를 제거한 상층액을 취한 후 감압 여과하여 동결 건조 후 -20°C에 보관하였다.

수율 측정 및 일반성분 분석

수율은 홍해삼으로부터 유효성분을 제조방법에 따라 획득한 다음 양을 %로 계산하였다. 단백질 함량은 Lowry method로 분석하였고, 당 함량은 phenol sulfuric acid method를 이용하여 측정하였다. 황산기 함량은 Saito et al. (1968)이 제시한 BaCl₂/gelation 방법을 이용하여 분석하였다.

세포 배양 및 지방세포 분화

마우스 유래 3T3-L1 전지방 세포주는 American type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받아 사용하였으며 10% BS과 1% P/S을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 1×10⁵ cells/mL로 분주 후 confluent 상태가 될 때까지 37°C를 유지하는 CO₂ incubator에서 배양하였다. 분화 유도는 다음과 같이 8일 동안 2일 간격으로 배지를 교체하면서 시행하였다. 분화 유도 첫째 날(day 0)에는 MDI (0.5 mM IBMX, 0.25 µM dexamethasone, 5 µg/mL insulin)가 함유된 분화 유도 배지(10% FBS, 1% P/S의 DMEM 배지)로 교체하였고, 2일 동안 배양하였다. 그 후, 10% FBS와 1% P/S, 5 µg/mL insulin이 함유된 DMEM 배지로 교체하였고(day 2), 2일 동안 배양하였다. 다시 10% FBS와 1% P/S이 함유된 DMEM 배지로 2일 간격으로 교체하여 4일 동안 더 배양하였다.

세포 독성 평가

세포를 1×10⁵ cells/mL 농도로 하여 24 well plate에 분주하고 16시간 경과 후, 건조 방법별 홍해삼 효소 가수분해물을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 세포 독성은 MTT 방법을 이용하여 실험하였다. MTT 용액 100 µL (2 mg/mL in PBS)를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 이후 상층액을 완전히 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Oil red O staining을 활용한 세포 내 지방 염색

분화 유도 첫날부터 건조 방법별 홍해삼 효소 가수분해물을 8일 동안 2일 간격으로 분화 유도 배지 교체와 함께 4회 처리한 후 지방 세포 내의 지방 축적 정도를 확인하기 위하여 세포 내 지방 방울(lipid droplet)을 선택적으로 염색하는 Oil red O staining을 실시하였다. 분화된 지방세포의 상층액을 제거한 후 PBS로 세척하고 10% formalin 첨가하여 1시간 세포 고정하였다. 고정한 세포를 증류수로 3회 세척 후 마지막으로 60% isopropanol로 세척하고 well을 완전히 건조시킨 후 Oil red O 용액(0.5 g in 100 mL isopropanol)으로 2시간 동안 염색하였다. 이후 염색 용액을 완전히 제거하고 증류수로 4회 세척하였다. 염색 후 지방 세포 분화 정도를 CoolSNAP-Pro color digital camera로 확인하였으며, 100% isopropanol을 가하여 염색된 Oil red O를 완전히 용해시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western Blot 분석

세포를 ice cold-PBS로 2회 세척한 후 lysis buffer (20 mM Tris, 5 mM EDTA, 10 mM Na₄P₂O₇, 100 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 1% NP-40, 10 mg/mL Aprotinin, 10 mg/mL Leupeptin, 1 mM PMSF)로 1시간 동안 4°C에서 균질화하고 14,000 g, 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도를 Pierce^TM BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MD, USA)로 정량하여 30 µg의 단백질을 10%의 sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고, nitrocellulose (NC) membrane으로 이동시켰다. NC membrane은 5% nonfat dry milk 함유 TBS-T (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2.65 mM KCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 상온에서 2시간 동안 반응하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그 후, 1차 antibody (SREBPc-1, FABP4)를 blocking buffer에 희석하여 4°C에서 overnight하였다. TBS-T로 20분간 3회 세척한 후 2차 antibody를 blocking buffer에 희석하여 실온에서 반응시켰다. TBS-T로 20분간 3회 세척하고 ECL 용액 (Amersham, Arlington Heights, IL, USA)에 반응시켜 단백질의 발현 정도를 eVo-6 camera가 장착된 FUSION Solo6S program (Vilber Lourmat, Marne-La-Vallée, France)으로 분석하였다.

통계 분석

실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. SPSS 프로그램(Ver. 12.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 One-way ANOVA-test를 실시하여 조사 항목들 간의 유의성 검증은 Turkey’s multiple range test로 *P<0.05 및 **P<0.01 수준에서 실시하였다.

결과 및 고찰

건조 방법별 홍해삼 효소가수분해물의 수율 및 일반 성분

가수분해 효소는 다양한 생물체로부터 생물학적으로 활성이 풍부한 수많은 천연물을 추출하는데 적용되어 왔다(Ding et al., 2018). 단백질 가수분해 효소는 아미노산 또는 펩타이드 혼합물을 만드는 효소이며 일반적으로 단백질 가수분해 효소를 이용하여 시료를 가수분해 하였을 때 효소 양과 가수분해 시간에 비례하여 증류수 추출물에 비해 높은 수율과 단백질 함량을 나타냄을 확인할 수 있다(Kim et al., 2016). 또한, 다양한 단백질 효소 가수분해로부터 잠재적인 생리활성 펩타이드가 생성되며 이들은 식품의 장내 소화 과정 동안 생리 조절 인자로 작용할 수 있다. 따라서, 단백질 효소 가수분해물과 이로부터 생성되는 펩타이드의 항산화 및 항고혈압 등의 생리활성에 대한 연구가 보고되고 있다(Ko et al., 2012). 또한, 최근 해조류 또는 해양생물의 효소 가수분해물로부터 새로운 기능성 단백질이나 생리활성 펩타이드를 분리하고 있으며, 이들로부터 새로운 기능성 천연물 소재를 찾으려 노력하고 있다(Samarakoon and Jeon, 2012; Kim et al., 2016; Je et al., 2019).

해삼은 단백질 함량이 높고 지방 함량이 적으며 트립토판(tryptophan), 아르기닌(arginine), 라이신(lysine)과 같은 필수 아미노산이 풍부하다고 알려져 있고, 해삼의 체벽 단백질의 약 70%는 불용성 콜라겐 섬유로 구성되어 있는데, 이 콜라겐은 피부와 뼈의 결합 조직에서 중요한 구조 단백질이다(Park et al., 2012; Lee et al., 2014). 또한, 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate)이 풍부하게 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Park et al., 2017). 홍해삼은 제주 지역의 해양 특산물로 주로 제주 해역에서만 서식하여 생산량이 매우 적지만 일반 해삼 보다 크기가 크고 사포닌(saponin), 콘드로이틴 황산과 같은 영양 성분을 많이 포함하고 있다고 알려져 있다(Choi, 2017). 따라서, 홍해삼의 주요성분인 단백질을 효율적으로 얻고자 본 연구에서는 단백질 분해 효소를 이용하여 제주산 홍해삼을 가수분해하고, 이로부터 얻은 가수분해물이 지방세포 분화 과정에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.

먼저, 홍해삼의 효소 가수분해를 위하여 산업적으로 사용하고 있는 9가지의 단백질 분해 효소 Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Neutrase, pepsin, Protamex, trypsin, α-chymotrypsin, papain과 증류수를 이용하여 추출하였으며, 건조 방법별 홍해삼 효소 가수분해물의 수율은 Table 1과 같다. 원적외선 건조, 진공 건조, 동결 건조 홍해삼 효소 가수분해물 중 원적외선 건조 홍해삼 Protamex 가수분해물과 동결 건조 홍해삼 Kojizyme 가수분해물을 제외한 모든 가수분해물에서 70% 이상의 높은 수율을 나타내었다. 특히, 진공 건조 홍해삼 Alcalase 효소 가수분해물이 91.5%의 가장 높은 수율을 나타내었고, 이 외에도 원적외선 및 동결 건조 홍해삼 Alcalase, Neutrase, pepsin, trypsin, α-chymotrypsin 가수분해물과 진공 건조 홍해삼 pepsin 가수분해물이 80% 이상의 높은 수율을 나타내었다. 그리고, 증류수 추출물의 수율은 Table 1에서 나타낸 것과 같이 원적외선 건조 홍해삼은 약 60.50%, 진공건조 홍해삼은 약 49.00%, 동결건조 홍해삼은 약 56.75%를 보였고, 각 건조 방법별 가수분해물이 물 추출물 보다 수율이 높았다.

Table 1. Yield and chemical composition of enzymatic hydrolysates of red sea cucumber Stipchopus japonicas dried by three methods

A, Alcalase hydrolysate; F, Flavourzyme hydrolysate; K, Kojizyme hydrolysate; N, Neutrase hydrolysate; P, pepsin hydrolysate; Pro, Protamex hydrolysate; T, trypsin hydrolysate; α-chymo, α-chymotrypsin hydrolysate; Pa, papain hydrolysate; DW, Distilled water extract.

홍해삼의 주요성분인 단백질 함량을 측정하기 위하여 Lowry method를 이용하여 측정하였고, 그 결과는 Table 1에 나타내었다. 원적외선 건조 홍해삼 효소 가수분해물 중에서는 α-chymotrypsin 가수분해물이 가장 높은 단백질 함량(약 37.12%)을 나타내었고, 이는 물 추출물의 단백질 함량(약 26.05%)와 비교하였을 때 약 1.42배 높다. 그리고, Alcalase 가수분해물을 제외한 8종의 효소 가수분해물 모두 물 추출물 보다 단백질 함량이 높았다. 진공 건조 및 동결 건조 홍해삼 효소 가수분해물의 경우 9종의 효소 가수분해물 모두 물 추출물 보다 단백질 함량이 높았다. 진공 건조의 경우 약 1.67배(Alcalase 가수분해물, 약 26.19%)에서 많게는 약 2.32배(trypsin 가수분해물, 약 36.24%)를 나타내었고, 동결 건조의 경우 약 2.04배(Kojizyme 가수분해물, 약 10.48%)에서 많게는 약 3.25배(trypsin 가수분해물, 약 34.10%)를 나타내었다.

다음으로 홍해삼의 주요 생리활성 성분으로 알려진 콘드로이틴의 황산기 함량을 측정하기 위하여 당 함량과 콘드로이틴 황산기 함량을 측정하였다. 그 결과, 당 함량은 Table 1에서 나타낸 것과 같이 모든 가수분해물에서 3.34% 이상의 당 함량을 나타내었는데 진공 건조 홍해삼의 가수분해물의 경우 모두 물 추출물의 당 함량(약 7.40%) 보다 높은 당 함량을 나타내었으며, 그 중에서도 Neutrase 가수분해물이 약 13.08%로 가장 높은 당 함량을 나타내었다. 반면, 원적외선 및 동결 건조 홍해삼의 가수분해물에서는 진공 건조 효소 가수분해물 보다 비교적 낮은 당 함량을 나타내었는데 원적외선 건조 홍해삼의 가수분해물 중 Flavourzyme (약 8.37%), Kojizyme (약 8.86%), Neutrase (약 8.05%), Protamex (약 7.89%), trypsin (약 7.08%) 가수분해물은 물 추출물의 당 함량(약 5.94%) 보다 높은 당 함량을 나타내었다. 하지만, 동결 건조 홍해삼의 가수분해물은 물 추출물의 당 함량(약 4.32%)과 유사하거나 낮은 당 함량을 나타내었다. 콘드로이틴 황산기 함량의 경우, 모든 효소 가수분해물에서 약 4.51% 이상의 함량을 나타내었고, 각 건조 방법별 홍해삼 물 추출물의 함량(약 7.41%) 보다 낮거나 비슷하였다(Table 1). 이를 통해 9종의 단백질 분해 효소를 이용하여 높은 수율과 단백질 함량을 얻은 수 있는 것을 확인하였다.

건조 방법별 홍해삼 효소가수분해물의 지방 축적 억제 효능

지방세포는 에너지 항상성 유지 및 지질 대사에 중요한 역할을 하고, 지방전구세포인 3T3-L1은 다양한 호르몬과 전사인자들에 의해 지방세포로 분화되면서 세포 내 지방을 생성 및 축적한다(Hwang et al., 2019). Oil red O staining은 지방세포 내 축적된 중성지방을 붉은색으로 염색하여 세포의 붉은색 정도로 분화 정도를 시각화 할 수 있다(Kim and Jeung, 2019). 따라서, 지방세포로 분화 유도된 3T3-L1에서 건조 방법별 홍해삼 효소 가수분해물이 지방 축적에 미치는 효과를 Oil red O staining을 통해 관찰하였다. 먼저, 건조 방법별 홍해삼 효소 가수분해물은 Fig. 1A-1C에 나타낸 것처럼 50 µg/mL에서 3T3-L1 cell에 대해 유의한 독성이 확인되지 않았다. 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 건조 방법별 홍해삼 효소 가수분해물을 3T3-L1 세포에 처리하여 Oil red O staining을 통해 지방 축적을 관찰한 결과, MDI에 의해 지방세포 분화가 유도된 세포군에서는 세포 내 지방구 형성 및 생합성에 의한 축적이 관찰되었다(Fig. 1D-1F). 반면, MDI에 의해 지방세포로 분화가 유도된 세포 내 지방구 및 지방생합성은 건조 방법별 홍해삼 효소 가수분해물 처리군에서 유의하게 억제됨을 확인하였는데, 원적외선 건조 홍해삼 효소 가수분해물 중 Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Neutrase 가수분해물이 유의하게 지방 축적을 억제하는 것을 확인하였고, pepsin, protamex, trypsin 가수분해물 및 물 추출물 처리군은 Oil red O staining 후 용해물의 흡광도 측정 결과에서 지방 축적 억제 효능을 나타내는 것으로 보였지만, 광학 현미경 사진 촬영을 통해 8일 동안 4회 처리하면서 세포에 독성을 나타낸 것을 확인하였다(Fig. 1D-1F). 그리고, 진공 건조 홍해삼 효소 가수분해물 중 trypsin, papain 가수분해물을 제외한 모든 가수분해물이 유의하게 지방 축적을 억제하는 것을 확인하였고, 물 추출물 처리군은 광학 현미경 사진 촬영을 통해 8일 동안 4회 처리하면서 세포에 독성을 나타낸 것을 확인하였다(Fig. 1E). 마지막으로, 동결 건조 홍해삼 효소 가수분해물 처리군은 Oil red O staining 후 용해물의 흡광도 측정 결과 지방 축제 억제 효능을 나타내는 것으로 보였지만, 광학 현미경 사진 촬영을 통해 8일 동안 4회 처리하면서 모든 효소 가수분해물 및 물 추출물이 세포에 독성을 나타낸 것을 확인하였다(Fig. 1F). 결과를 종합하여 볼 때, 8일의 분화 과정 동안 원적외선 건조 홍해삼 효소 가수분해물 중 Flavourzyme 가수분해물이 세포에 독성을 미치지 않으며 약 70% 정도 지방 축적을 억제하는 것을 확인하였다.

Fig. 1. Effects of enzymatic hydrolysates of red sea cucumber Stipchopus japonicas on cell viability in 3T3-L1 cells. 3T3-L1 cells were treated with enzymatic hydrolysates (50 µg/mL) of far-infrared ray dried (A), vacuum dried (B), and freeze dried (C) Red Sea cucumber for 48 h and then cell viability was measured by MTT assay. Effects of enzymatic hydrolysates of Red Sea cucumber on adipocytes differentiation in 3T3-L1 cells. Post-confluent 3T3-L1 cells were treated with enzymatic hydrolysates (50 µg/mL) of far-infrared ray dried (D), vacuum dried (E), and freeze dried (F) Red Sea cucumber during adipocyte differentiated for 8 days and then the stained lipid accumulation content was quantified by measuring absorbance. A, Alcalase hydrolysate; F, Flavourzyme hydrolysate; K, Kojizyme hydrolysate; N, Neutrase hydrolysate; P, pepsin hydrolysate; Pro, Protamex hydrolysate; T, trypsin hydrolysate; α-chymo, α-chymotrypsin hydrolysate; Pa, papain hydrolysate; DW, Distilled water extract. Experiments were performed in triplicate and the data were expressed as mean±SE; * P<0.05, and ** P<0.01 as compared to the untreated group.

원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물이 지방세포 분화 및 지방생합성 관련 단백질에 미치는 영향

식품의 보존을 위해 사용되는 열처리를 최소화하려는 연구가폭 넓게 이루어지고 있으며 이에 따라 원적외선 건조, 진공 건조, 동결 건조 등의 방법이 사용되고 있다(Lee et al., 2000). Lee et al. (2000)은 진공 건조는 색조, 풍미, 복원성 등이 우수하며 재료의 함수율이 높을 때 낮은 온도에서 건조할 수 있는 특징이 있어 고품질 농산물을 건조하는데 많이 쓰이고 있으며 원적외선 건조는 열원에서 나온 전자파가 공기와 같은 매체의 영향을 받지 않고, 피가열 물체에 직접 도달하여 피가열 물체의 파장과 같은 원적외선 파장이 흡수된 후 열로 변하여 스스로 내부 온도를 상승시키기 때문에 건조 시간의 단축은 물론 제품의 품질을 향상시킬 수 있다고 보고하였다. 동결 건조 방식은 식품을 급속 동결시킨 후 진공압력을 낮추어 수분을 승화시켜 건조하는 방법으로 제품의 신선도를 유지할 수 있는 장점을 갖고 있으나 값이 비싸고 건조 후에 빛에 불안정하여 습기나 공기 접촉 시 변질이 빨리 될 수 있다고 알려져 있다(Kim et al., 2014). 그리고, 진공 동결건조와 비교했을 때, 원적외선 건조는 시료의 원형 유지는 어렵지만 풍미를 낼 수 있고, 품질 유지 및 대량 생산이 가능하다는 내용도 보고된 바가 있다(Park et al., 2017). 최근 건조 방법에 따른 기능성 성분의 변화에 대한 연구가 집중되고 있으나 건조 시간 증가에 따른 효율이 떨어짐에 따라 원적외선을 이용한 연구가 관심 받고 있다(Park et al., 2017). 게다가, 가수분해를 위해 사용된 단백질 효소 중에서 Flavourzyme은 효소의 역가 지속성이 좋고, 특히 효소를 처리하여 분해된 가수분해물이 쓴맛을 내는 것이 많은데 Flavourzyme은 이러한 쓴맛이 적기 때문에 많이 이용되고 있다(Chae et al., 2003). 따라서, 원적외선 건조 홍해삼 중에서 물 추출물 보다 수율이 높고, 단백질함량이 높으며 3T3-L1 세포 내 지방 축적 억제 효능이 높았던 Flavourzyme 가수분해물을 선택하여 추후 실험을 진행하였다. Adipogenesis는 전지방세포(preadipocyte)가 증식 및 분화 과정을 거쳐 성숙한 지방세포 (adipocyte)로 되는 과정을 말하며 (Kim et al., 2017), 이때 뚜렷한 형태학적, 생화학적인 변화를 나타나게 되는데, 이 분화과정에서 지방세포 특이적 단백질들의 발현을 통해 이루어진다(Seo, 2015). 원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물이 항비만 소재로서의 가능성이 확인되어 이를 3T3-L1 세포에 처리하여 세포 내 지방 생합성에 미치는 영향을 확인하였다. 먼저, 세포 내 지방축적 억제 효능 탐색을 위해 세포에 처리되었던 농도(50 µg/mL)를 바탕으로 6.25-50 µg/mL를 처리하여 세포 내 지방축적 억제 효능을 Oil red O staining 방법으로 재평가하였다. 그 결과, Fig. 2에 나타낸 것처럼, MDI에 의해 지방세포 분화가 유도된 세포군에서는 세포 내 지방구 형성 및 생합성에 의한 축적이 관찰되었다. 반면, MDI에 의해 지방세포로 분화가 유도된 세포 내 지방구 및 지방생합성이 원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물에 의해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다.

Fig. 2. Effect of Flavourzyme hydrolysates of far-infrared ray dried red sea cucumber Stipchopus japonicas on adipocytes differentiation in 3T3-L1 cells. Post-confluent 3T3-L1 cells treated with 6.25, 12.5, 25, and 50 µg/mL of sample during adipocyte differentiated for 8 days and then the stained lipid accumulation content was quantified by measuring absorbance. (A) Captured photographs with a microscope. Scale bar=50 μm (magnification, ×100). (B) The quantified graphs of the lipid accumulation using ELISA reader at 520 nm.

지방세포로 분화되면 지방세포 특이적 유전자들의 활성, 지방 구가 형성되며, 세포 내 지방성분이 축적되어 비만을 초래하게 된다(Seo, 2015). 3T3-L1 전지방세포가 지방세포로 성숙되는 과정에서 C/EBPα (CCAAT, enhancer-binding protein-alpha), PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma), SREBPc-1 (sterol regulatory element-binding protein) 지방세포 분화 조절 유전자가 관여한다고 알려져 있다(Kim and Jeung, 2019). 이 중 SREBPc-1은 지방세포 분화 조절뿐만 아니라 지방생합성을 조절하여 체지방량 조절에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Hwang et al., 2019). 분화 후기 단계는 FABP4 (fatty acid binding protein 4)와 AP2 인자가 발현되면서 제방세포로의 분화가 완성되는데, 이 두 유전자는 성숙된 지방세포에서만 과다하게 발현되는 인자이다(Seo, 2015). 그 중 FABP는 대사증후군과 관련된 여러 질환의 의학적 biomarker로 이용되며 adipocyte FABP (A-FABP)로 알려져 있을 만큼 지방조직과 성숙한 지방세포에서만 감지되는 인자로서 세포 내 FABP4 유전자의 발현량은 지방산의 대사 비율에 비례한다고 보고되고 있다(Seo, 2015). 따라서, 지방세포 분화 단계 중 초기와 후기 단계에 관여하는 인자인 SREBPc-1과 FABP4 단백질 발현 양상을 Western Blot 분석법으로 분석하였다. 그 결과, 지방세포의 분화에 의한 지방조직의 생성과 관련된 SREBPc-1의 발현은 MDI 처리군에 비하여 원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물 처리군에서 유의미하게 감소하는 것을 확인하지 못하였다. 반면, FABP4 단백질의 발현은 MDI 처리군에 비하여 원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물 처리군에서 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 3). 이를 통해 지방세포로 분화 유도된 3T3-L1 세포에서 원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물은 지방분화 초기 단계보다 후기 단계에 관여하여 지방 축적을 억제시킨 것으로 사료된다. 그러나 지방분화 초기 및 후기 단계를 포함하여 중기 단계에서도 본 연구에서 확인한 SREBPc-1과 FABP4외 여러 가지 반응 경로가 있으므로 다른 작용기전 관련 신호전달체계 및 단백질 활성에 관한 연구는 좀 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.

Fig. 3. Effect of Flavourzyme hydrolysates of far-infrared ray dried red sea cucumber Stipchopus japonicas on expression SREBPc-1 and FABP4 in 3T3-L1 cells. Post-confluent 3T3-l1 cells treated with 25, and 50 µg/mL of sample during adipocyte differentiated for 8 days. SREBPc-1 and FABP4 protein expressions were analyzed by Western blot. (A) Images of Western blot analysis using FUSION Solo6S program equipped with eVo-6 camera (Vilber Lourmat, Marne-La-Vallée, France). Statistical graphs showing the expression levels of SREBP-1 (B) and FABP4 (C) protein were obtained from panel (A). Experiments were performed in triplicate and the data were expressed as mean±SE; *P<0.05, and **P<0.01 as compared to the untreated group.

본 연구에서는 홍해삼의 건조 방법과 효소 가수분해 방법에 따라 3T3-L1 전지방세포의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 본 연구의 결과를 종합하였을 때 원적외선 건조된 홍해삼 효소 가수분해물에 의해 지방세포의 lipid droplet의 형성이 유의적으로 억제되었으며 더불어 비만세포 후기 단계에 관여하는 FABP4 단백질이 유의미하게 감소되었다. 원적외선 건조는 건조 시간 단축, 품질 향상 및 대량 생산이 가능한 이점이 있으며, 역가 지속성이 뛰어나고 가수분해물의 쓴 맛이 덜한 Flavouzyme의 특성으로 인하여 건조 방법에 따른 가수분해 효소별 홍해삼의 가수분해물 중에서 원적외선 건조 홍해삼 Flavourzyme 가수분해물이 지방 축적 억제 효능을 나타내는 항비만의 잠재적인 천연물 기능성소재로 이용 가능할 것으로 사료된다.