Predictive Growth Models of Bacillus cereus on Dried Laver Pyropia pseudolinearis as Function of Storage Temperature

저장온도에 따른 마른김(Pyropia pseudolinearis)의 Bacillus cereus 성장예측모델 개발

Abstract

Predictive models in food microbiology are used for predicting microbial growth or death rates using mathematical and statistical tools considering the intrinsic and extrinsic factors of food. This study developed predictive growth models for Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis stored at different temperatures (5, 10, 15, 20, and 25℃). Primary models developed for specific growth rate (SGR), lag time (LT), and maximum population density (MPD) indicated a good fit (R²≥0.98) with the Gompertz equation. The SGR values were 0.03, 0.08, and 0.12, and the LT values were 12.64, 4.01, and 2.17 h, at the storage temperatures of 15, 20, and 25℃, respectively. Secondary models for the same parameters were determined via nonlinear regression as follows: SGR=0.0228-0.0069*T₁+0.0005*T₁²; LT=113.0685-9.6256*T₁+0.2079*T₁²; MPD=1.6630+0.4284*T₁-0.0080*T₁² (where T₁ is the storage temperature). The appropriateness of the secondary models was validated using statistical indices, such as mean squared error (MSE<0.01), bias factor (0.99≤B_f≤1.07), and accuracy factor (1.01≤A_f≤1.14). External validation was performed at three random temperatures, and the results were consistent with each other. Thus, these models may be useful for predicting the growth of B. cereus on dried laver.

서론

김(Laver Pyropia sp.)은 홍조 식물문, 홍조강, 김 파래목, 김 파래과에 속하며, 한국뿐만 아니라 일본·중국 등의 해외에서도 식용하며, 증산(增産)을 위해 양식하는 대표적 품목이다(KATI, 2019; Kwon et al., 2018). 김은 현재 국내 수산물 수출품 1위 품목으로 그 액수는 매년 계속해서 증가하여 2019년에는 5.8억 달러의 역대 최고 수출액을 달성하였다(MOF, 2020). 김은 칼슘, 마그네슘, 철분, 아연, 비타민 등이 많이 함유되어 있어 영양가가 풍부하며 맛이 좋아 예로부터 각종 미네랄, 식이 섬유 및 영양소의 공급원으로 애용되어 온 영양 기호식품이다(Kim et al., 2014). 최근에는 건강식을 선호하는 소비자들을 중심으로 health snack으로 인식되어 소비가 확대되고 있으며 특히 일본인들에게 한류 상품으로 가장 높은 구매율을 나타내는 식품이 되었다(Lim and Lim, 2013; Lee, 2018). 한편, 국내 대부분의 김 가공업체는 지하수와 저수지의 물을 끌어다 원초를 세척하며 따로 살균 공정을 거치지 않고 마른김을 생산하고 있어 식품안전성 면에서 위생관리에 취약하다. Kim et al. (2006)의 비가공 농수산식품의 미생물오염도 평가 연구에서, 김의 일반세균과 대장균군은 각각 2.8-7.1 log CFU (colony forming unit)/g 및 1.0-1.8 log CFU/g로 검출되었다. 또한, 미역에서는 약 1-logCFU/g수준으로 B. cereus가 5건 검출되었다고 보고하였다. Lee et al. (2017)은 돌김 중 B. cereus가 약 2-log CFU/g로 검출되었다고 보고하였다. 마른김의 국내 B. cereus의 기준 범위가 g당 1,000 이하이므로 김의 미생물 오염도 평가 연구들은 기준 범위 이내로 적합하였지만, B. cereus는 김의 주요 관리 대상 식중독세균이라고 할 수 있다(Lee et al., 2017; MFDS, 2019). B. cereus의 성장 최적 온도는 28-35°C이며 균주에 따라 최저 4-5℃, 최대 55℃에서도 성장이 가능하다(MFDS, 2016; Jo et al., 2017; NIFDS, 2019). 특히, 김이 생산되는 해역의 수온은 4.5-15℃ 전후이며, 마른 김의 표면온도는 약 21℃이다(Kim and Shin, 2014; Yoon, 2014). 김은 주로 상온에서 유통 및 보관되므로 5-25℃의 저장온도에서의 부적절한 관리는 B. cereus가 g당 1,000 이상(>3-log CFU/g) 성장하여 위해성을 보일 수 있다(MFDS, 2019). 또한, 이전의 연구에 따르면 일반적으로 식품의 B. cereus가 105 CFU/g이면 식중독을 일으킬 수 있다(Ziane et al., 2019). 따라서, 5-25℃의 저장 온도에서 마른김의 B. cereus에 대한 생육패턴의 확인이 필요하다.

최근에는 특정 식중독의 원인이 되는 병원성 미생물을 관리를 위한 방법으로 예측 미생물학(predictive food microbiology, PFM) 분야가 활발히 연구되고 있다(Park et al., 2019a). 어떤 특정 식중독 세균에 오염된 식품을 섭취하는 경우 해당 식품의 위해 정도를 과학적으로 그리고 정량적으로 평가하는 정량적 미생물위해평가(quantitative microbial risk assessment, QMRA)중의 노출평가(exposure assessment)에서 예측미생물학은 식중독 세균의 증식, 생장, 사멸에 대한 수학적 모델을 제공한다(Bahk et al., 2005). 예측 미생물학은 식품의 재료에서 생산, 유통, 판매, 소비 및 보관 전 과정에서의 각 식품이 갖게 되는 Aw, pH, NaCl 함량과 같은 식품의 고유 특성인 내부적 요인(intrinsic factor)과 식품의 미생물의 성장에 영향을 끼치는 저장 온도, 습도, 대기 상태 등의 외부적 요인(extrinsic factor)을 수학적 모델을 사용하여 식중독세균 혹은 부패세균의 성장을 예측하여 위해요 인을 사전에 차단 및 관리할 수 있는 방법으로 인정되고 있다(Chen, 2007; Koseki and Isobe, 2007). 따라서, 예측 미생물학은 식중독 예방에 큰 효과가 있는 것으로 평가되고 있으나 현재 B. cereus에 대한 성장예측 모델은 농산품(e.g. 쌀, 파스타, 콩), 육가공품(e.g. 우유, 햄, 닭고기), ready-to-eat 식품 등에 한정되어 있으며 수산식품에 대한 모델 개발을 거의 찾아볼 수가 없다(FAO/WHO, 2002; Park et al., 2010; Enkhjargal et al., 2013; Juneja et al., 2019).

김의 생산, 유통 및 소비 전 과정에서 부적절한 온도 관리는 세균 오염 증식의 주요 원인이 될 수 있다. 김의 B. cereus에 관한 성장 예측에 관한 연구는 향후 김의 식품 위생학적 및 안전성 관리를 위한 기초 연구 자료가 될 것이라고 사료된다. 따라서, 본 연구에서는 미생물학적 안전성 확보를 위해 국내와 해외에서 수요가 많은 마른 김에 B. cereus를 대상으로 다양한 저장 온도 조건에 따른 이 균의 성장을 예측할 수 있는 모델을 개발하였다.

재료 및 방법

시험균주 및 시험균액

본 연구에서 사용한 Bacillus cereus (ATCC 11778, ATCC 14579, ATCC 14893)는 American type culture collection에서 분양 받은 것으로 glycerol stock으로 -80°C에서 보관중인 균주를 사용하였다. 보존 배양된 각 시험 균주는 tryptic soy broth(TSB; BD/Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37℃의 배양기에서 18-24시간 동안 2차례 전배양시킨 후 본 실험에 사용하였다. 배양된 시험균주는 10,000 g로 10분 동안 원심 분리한 후 침강된 펠릿(pellet)을 10 mL의 0.1% 펩톤수에 현탁하였다. 이 현탁액을 0.1% 펩톤수를 이용해 단계 희석한 각각의 균주를 합쳐 3-4 log CFU/mL 수준의 농도를 지닌 cocktail로 제조하고 이를 시험 균액으로 사용하였다.

김 시료 및 실험설계

본 연구에서 사용된 마른김(Pyropia pseudolinearis)은 M마트(Tongyeong, Korea)에서 구입한 김을 사용하였다. 시험균의 접종 전 김 시료의 표면 잔존미생물 제거를 위해 70% 에탄올로 표면을 닦은 후, 멸균된 가위를 이용해 가로 6 cm, 세로 6 cm의 크기로 절단하여 1 g을 칭량해 petri dish (90×15 mm)에 담아 사용하였다. 이렇게 제조된 시료는 김의 주요 생산 및 유통 공정에서 B. cereus 성장과 관련한 중요한 인자로 선택된 저장온도 변수에 따라 5, 10, 15, 20 및 25℃로 결정하였다. 저장온도별 균의 성장 속도를 고려하여, 각 시간대별로 시료를 채취하여 분석하였다. 각각의 실험은 2회 반복하였고 각 샘플링 시간별로 3개의 시료를 사용하여 분석하였다.

접종 및 균수측정

시험균액은 김 시료에 10 μL씩 10군데 점-접종(spot-inoculation)한 후 biological safety cabinet (CHC Lab Co., Daejeon, Korea) 내에서 2차 오염을 방지하면서 미생물이 표면에 잘 부착되도록 1시간 동안 건조한 후 저장온도별로 보관하였다. 각 저장온도별로 배양된 김을 멸균팩에 0.1% 펩톤수로 10배 희석하여 stomacher를 이용하여 균질화 하였다. 0.1% 펩톤수로 균질화된 시험용액을 각각 10진 희석법으로 희석하여 1 mL을 petri dish (90×15 mm)에 분주하고 45-50℃정도로 식힌 tryptic soy agar (TSA; BD/Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 petri dish에 주입평판법(pour plate method)으로 배양해주었다. 미생물의 증식은 식품공전(MFDS, 2019)에 따라 표준한천평판 균수측정법(standard plate count method)으로 35±1℃에서 48±2시간 배양한 후 15-300개의 집락을 형성한 배지만 계수하여 log CFU/g으로 나타냈다.

1차모델 개발

본 연구에서는 김의 저장온도에 따른 B. cereus의 최대 증식 속도(specific growth rate, SGR)와 유도기(lag time, LT) 및 최대개체군밀도(maximum population density, MPD)에 대하여 Graphad PRISM version 8 (Graphad Software, San diego, CA, USA) 프로그램을 이용하여 실험결과를 Gompertz equation에 대입하여 산출하였다. 1차 모델 Gompertz equation은 다음과 같다(Yang et al., 2016).

Y=N₀+C×exp [-exp{(2.718×SGR/C)×(LT-X)+1}]

Y, Viable cell count (log CFU/g)

N₀ , Initial log number of cells (log CFU/g)

C, Difference between the initial and final cell number (log CFU/g)

X, Incubation time (h)

성장예측 2차모델 개발

도출된 최대증식속도(SGR)와 유도기(LT)의 온도 및 초기 오염균수와의 상관관계 규명을 위해 Gompertz model equation을 통해 구한 SGR과 LT 값을 SAS version 9.4 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하여 도출된 매개변수를 수학적 정량평가모델인 polynomial equation에 대입하여 모델을 개발하였다. 2차 모델 polynomial equation은 다음과 같다(Yang et al., 2016).

SGR or LT=b₀+b₁A+b₂A²+ɛ

A, Storage temperature (℃)

b₀-b₂ , Regression coefficients

ɛ, Random error

모델의 적합성 평가

개발된 B. cereus 성장예측 모델의 내부검증(internal validation)을 평가하기 위한 적합성 평가로 coefficient of determination (R²), Mean square error (MSE), bias factor (B_f), accuracy factor (A_f) 값을 사용하였다(Park et al., 2019b). R²은 회귀분석식에서 종속변수 y의 데이터 Yi에 대하여 yi의 총변동합에 대한 변동합의 비율을 구한 값으로서 0에서 1사이의 값을 나타낸다(Duffy et al., 1994). MSE는 미생물의 최대 증식속도에 대한 실험값과 예측 값의 차이를 이용하여 개발된 예측모델의 적합성을 평가하는 수치이다.

MSE=ΣLog (observed values-predicted values)²/n

B_f는 실험을 통해 얻어진 실험값과 유도된 2차 모델식에서 얻어진 예측값의 평균 차이를 평가한 것이다.

B_f for SGR or LT = 10^{ΣLog|(observed values/predicted values)|/n}

A_f는 실험을 통해 얻어진 실험값과 유도된 2차 모델식에서 얻어진 예측값의 평균 차이의 절대값을 평가한 것이다.

A_f for SGR or LT=10^{ΣLog|(predicted values/obseved values)|/n}

마직막으로, 개발된 모델의 범위 내에서 모델개발에 사용하지 않은 온도(13, 18, 23℃)를 선정하여 위와 동일한 방법으로 실험하여 외부검증(external validation)을 평가하였다.

통계분석

모든 실험은 각 샘플링 시간별로 3개의 시료를 사용하여 2회 반복으로 수행하였으며, 통계프로그램은 SPSS version 25.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)에서 one-way ANOVA 중 Duncan’s multiple range test를 사용하여 P<0.05에서 각 온도별 SGR, LT 및 MPD의 유의성을 조사하였다. 또한, Paired t-test를 사용하여 P<0.05에서 개발된 모델의 SGR, LT 및 MPD의 예측값과 실험값의 유의성을 조사하였다.

결과 및 고찰

저장온도에 따른 B. cereus 생육 패턴 및 1차모델개발

각 저장온도(5, 10, 15, 20, 25℃)에 따른 김에서 B. cereus 성장변화는 Fig. 1에 나타냈다. 마른 김의 초기 오염농도는 3.2-3.6 log CFU/g이었으며, B. cereus의 생육 패턴은 크게 3가지로 나누어졌다. 첫째, 냉장온도 5℃ 및 10℃에서 보관된 마른 김은 가장 느린 균의 생육을 보였으며, 저장 7일차(168시간)에 약 4 log CFU/g에 도달하고 이후 균의 뚜렷한 성장이 관찰되지 않았다. Cronin and Wilkinson (2009)는 쌀을 4℃에서 냉장보관시 본 연구와 유사하게 B. cereus는 처음에 접종된 수준을 유지하였다고 보고하였으며, 반면에 10℃에서 보관한 쌀의 B. cereus는 3일차(72시간) 부터 급속히 성장하여 6일차(144시간)에는 약 6 log CFU/mL로 성장하였다.

Fig. 1. Growth curves of Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis at 5, 10, 15, 20, 25℃. Error bars indicate the standard deviations for the mean of two replicates of three samples at each storage time and temperature.

둘째, 15℃의 저장온도에서 보관된 마른김의 B. cereus의 생육 패턴은 36시간까지는 균의 성장이 느리고 일정하였지만, 48시간부터는 균수가 급격히 증가하여 168시간에는 6.5 log CFU/g까지 성장하였으며 전체 저장온도 중에서 중간 형태의 균의 생육이 관찰되었다. 이 균은 지표수, 지하수 및 약수 등의 수중에도 존재할 수 있기 때문에 식품을 오염시켜 식품 부패 또는 식중독을 유발할 수 있고 그 감염량(infective dose)이 5 log cells/g 이상인 점을 고려하면, 이는 적절한 저장온도에서 김을 보관할 필요성이 있음을 시사하였다(Schoeni and Lee, 2005; Jo et al., 2017). 또한, 168시간(7일) 내에 김의 B. cereus가 정체기(stationary phase)에 도달하지 않을 가능성을 고려하여 추가로 8-10일 동안 15℃의 저장온도에서 B. cereus 균의 성장을 모니터링하였지만, 약 6.4-6.6 log CFU/g 이상 증식하지 못하였다(data not shown).

마지막으로, 20℃와 25℃에서 보관된 김의 B. cereus는 가장 빠른 생육 패턴을 보였는데 단지 48시간만에 6.5 log CFU/g 이상의 성장을 나타냈다. 특히, 25℃에 보관된 김의 B. cereus는 가장 짧은 저장 4시간 만에 급격한 균의 성장을 보여주었다. 이와 관련하여 Moon et al. (2005)은 균의 생육은 초기균수보다 온도에 지배적인 영향을 받으며, 새로운 환경에 적응하기 위하여 낮은 온도일수록 초기 성장이 지연된다고 보고하였다. 한편, 20℃와 25℃에서 48시간 이상 보관된 김의 B. cereus는 정체기 상태에 머물렀으며, 최대 7.2 log CFU/g까지 성장하였다. Kang et al. (2010)에 의하면 13℃의 저장 온도에서는 탄수화물 음식(e.g. 밥, 빵, 국수)이 식물성 단백질 식품(e.g. 두부, 삶은 콩나물)보다 훨씬 더 빠른 균의 성장을 보였으며 30℃의 저장 온도에서는 탄수화물 음식이 동물성 단백질 식품(e.g. 햄버거 패티, 훈제 치킨)보다 더 느린 균의 성장을 보고하였다. 이러한 연구 결과는 B. cereus와 같은 식중독균의 생육은 식품의 매트릭스와 식품의 고유 특성(pH, 수분활성도, 소금함량, 영양성분 등)인 내부적 요인(intrinsic factor) 차이에 따른 것으로 판단된다.

1825년 Gompertz가 인구동태 조사 결과를 경험식으로 제시한 Gompertz model equation은 Sigmoid형의 미생물 성장곡선을 표현하기 위해 사용하는 대표적인 연속함수 식이며, 현재 상용화 되는 pathogen modeling program (PMP) 등의 개발에 사용되었다(FAO/WHO, 2002). 각 온도별(5, 10, 15, 20, 25℃) 김에 오염된 B. cereus의 생육 결과(Fig. 1)를 기초로 저장 온도와 시간에 따른 MPD값과 변형된 Gompertz model equation을 적용하여 1차 모델링 SGR과 LT를 산출하였다(Table 1). Nauta et al. (2003)의 연구에 의하면 B. cereus의 MPD는 6.0-8.5 log CFU/g 농도로 식품의 종류, 초기 균수, 환경 등에 따라 다르다. 본 연구에서 냉장온도 5℃ 및 10℃에서 보관된 마른 김은 7일(168시간) 동안 B. cereus가 MPD에 도달하지 못하였으며, 이에 따른 SGR과 LT를 예측할 수 없었다. 또한, 15℃에서 저장된 김의 B. cereus는 아직 완전히 MPD에 도달하지 못하였을 가능성이 있는 MPD값을 6.5 log CFU/g으로 간주하였다. SGR은 미생물의 최대증식속도를 나타내며 저장 온도가 높아질수록 B. cereus의 SGR은 유의적으로 증가하였다(P<0.05). 반면에, 미생물이 성장을 시작하기 이전에 주위 환경에 적응하는 기간을 나타내는 B. cereus의 LT는 저장 온도가 높아질수록 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 본 연구와 유사하게, Juneja et al. (2019)은 밥(cooked rice)에서 온도에 따른 B. cereus 성장을 측정한 연구에서 온도의 증가에 비례하여 B. cereus 생육 속도 또한 증가하였다고 보고하였다. 따라서, 김을 안전하게 보관 및 섭취하기 위해서는 가급적 서늘한 저장 온도에서 단시간 내에 보관하여 김의 미생물의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 최대개체군밀도를 나타내는 MPD는 20°C, 25℃에서 각각 7.1, 7.3 log CFU/g이었으며 서로 간의 유의적 차이는 없었으며(P>0.05), 15℃에서 저장된 김의 B. cereus (6.5 log CFU/g)보다 유의적으로 높은 MPD를 나타냈다(P<0.05). 1차 모델링의 적합성을 나타내는 R²값은 1에 가까울수록 모델의 적합도가 높은 것을 나타내며, 15℃, 20℃, 25℃ 저장온도에서 모두 0.98 이상으로 나타났다(Table 1). 따라서 Gompertz equation으로 산출한 1차 모델이 적합함을 증명하였다.

Table 1. Growth parameters of Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis obtained from the Gompertz equation for the primary modeling

SGR, Specific growth rate; LT, Lag time; MPD, Maximum population density; CFU, Colony-forming unit; NG, No Growth; NA, No Application. The data are presented as mean values and standard deviation (three samples/condition of temperature). Means in a column with different letters (a-b for SGR or a-c for LT and MPD) differ significantly (P<0.05) by Duncan’s multiple range test at the 5% level of probability.

B. cereus의 성장예측 2차모델 개발 및 적합성 평가

1차 모델링에서 계산된 SGR, LT, MPD 등이 환경적 변수인 저장온도에 따라 어떻게 변화하는지 예측하는 2차 모델링은 다음의 다항 2차방정식인 polynomial equation을 적용하여 산출하였다(Table 2).

SGR model for dried laver: Y=0.0228-0.0069*T₁+0.0005*T₁²

LT model for dried laver: Y=113.0685-9.6256*T₁+0.2079*T₁²

MPD model for dried laver: Y=1.6630+0.4284*T₁-0.0080*T₁²

Table 2. Growth parameters of Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis obtained from the polynomial equation for the secondary modeling

SGR, Specific growth rate; LT, Lag time; MPD, Maximum population density; CFU, Colony-forming unit; NG, No Growth; NA, No Application.

T₁은 저장온도를 나타내며, polynomial equation으로 산출된 R²값은 SGR은 0.93, LT는 0.95, MPD의 경우 0.89이였다. 따라서 본 연구에서 예측된 2차 모델링 SGR, LT 값은 0.90 이상이므로 모델링이 잘 되었으며 MPD는 15℃ 저장온도의 실제 MPD에 도달하지 못하였을 가능성이 있음으로 0.90보다 약간 낮았지만 전체적으로 양호한 적합성을 나타냈다. 또한, 예측된 2차 모델 또한 저장온도에 따라 SGR값은 증가하였으며, LT값은 감소하였다. Kim and Oh (2014)의 연구는 15℃에서 저장된 당근의 B. cereus의 SGR은 0.032이며, LT는 14.57으로 본 연구의 15℃에서 저장된 김의 B. cereus의 SGR 0.03, LT 15.46과 유사한 결과를 보였다. 반면 25℃에서 저장된 당근의 B. cereus의 SGR 0.113, LT 5.01은 본 연구의 25℃에서 저장된 김의 B. cereus의 SGR 0.15, LT 2.37과는 좀 더 큰 차이를 보였다. 이는 저장온도가 증가하면서 식품 매트릭스의 차이와 당근의 미산성 차아염소산수와 초음파의 병용 살균처리 효과가 균의 성장에 영향을 주었음을 시사한다.

2차 모델을 통해 예측된 모델의 신뢰성을 확보하기 위해서는 실제 적용 전에 통계적인 적합성 검증이 필요하다(FAO/WHO, 2002). 김의 저장온도별 B. cereus의 내부검증(internal validation)을 평가하기 위해 MSE, B_f, A_f 값을 Table 3에 나타냈다. 먼저 MSE값은 0에 가까울수록 개발된 예측모델의 적합성이 높음을 의미하며 SGR, LT, MPD 모두 0.01보다 매우 작은 0에 가까운 값이 나왔으므로 적합하였다(Park et al., 2019b). B_f값은 1에 가까울수록 모델이 정확한 것을 나타내며 1보다 작은 경우는 과소 예측된 것이며, 1보다 크면 과대 예측된 것이다. 0.7보다 작거나 1.5보다 큰 값을 나타내면 모델이 적합하지 않아 사용이 불가능하다(Park et al., 2019a; Ross et al., 2000). 본 연구의 B_f값은 SGR (1.02), LT (1.07), MPD (0.99)이였으며, 모든 결과값이 신뢰할 수 있는 예측값을 제공할 수 있음을 나타냈다. A_f값은 1에 가까울수록 모델 적합성이 높음을 의미하며 값이 커질수록 부정확함을 나타낸다. 예를 들어, 계산된 A_f 값이 0.9-1.1 사이면 모델이 10% 과소 및 과대 예측된 것이다(Ross, 1996). 본 연구의 A_f 값은 SGR (1.14), LT (1.13), MPD (1.01)으로 SGR 및 LT의 A_f 값은 14, 13%의 오차가 있으나 다른 두 통계지표 MSE, B_f값이 매우 높은 적합성을 나타내므로 본 모델링은 통계적으로 신뢰성을 확보하였다.

Table 3. Internal validation of the secondary modeling using statistical indices for growth parameters of Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis

MSE, Mean square error; A_f, Accuracy factor; B_f, Bias factor; SGR, Specific growth rate; LT, Lag time; MPD, Maximum population density.

Table 4는 본 연구에서 개발된 모델을 외부검증(external validation)하기 위하여 모델 개발에 사용하지 않은 13, 18, 23℃의 저장온도에서 실험하여 paired t-test를 사용하여 P<0.05에서 개발된 모델의 예측값과 실험값을 비교하여 나타낸 것이다. 비교 결과, 23℃에서 저장된 B. cereus의 SGR값과 13℃ 및 18℃에서 저장된 B. cereus의 LT값은 예측값과 실험값 간의 유의적인 차이가 있었지만(P<0.05), 대부분의 저장온도 및 샘플링 시간별 실험값과 예측값의 SGR, LT 및 MPD간의 유의적인 차이가 없었다(P>0.05). Walls and Scott (1996)의 생 쇠고기의 E. coli O157:H7의 성장을 예측 및 검증한 연구에서는 lag phase duration과 generation time의 예측값과 실험값의 t-test에 의한 유의적인 차이가 있었지만(P<0.05), exponential growth rate에서는 예측값과 실험값의 유의적인 차이가 없었다(P>0.05). 본 연구에서는 개발된 예측 모델의 보다 높은 신뢰성을 확보하기 위하여 외부검증에 대한 통계적인 적합성 평가를 추가적으로 실시하여 Table 5에 나타냈다. 외부검증의 MSE값은 SGR과 LT가 내부검증보다 다소 높은 0.04 및 0.03이 나왔지만, MPD 를 포함한 모든 값이 0에 가까워 매우 높은 적합성을 나타냈다. B_f값은 SGR (1.06), MPD (0.98)으로 1에 가까워 양호한 적합성을 나타냈으며, LT는 0.78로 비록 내부검증보다는 낮은 적합성을 나타냈지만, Ross et al. (2000)의 예측모델링에 관한 연구에서는 0.7-0.9 범위의 B_f값은 신뢰할 수 있는 예측값이라 보고하였다. A_f 값은 SGR (1.47), LT (1.43), MPD (0.99)으로 1에 가까운 MPD는 매우 높은 예측 모델의 적합성을 나타냈으며, 1.50이하의 SGR과 LT값은 본 연구의 예측 모델이 신뢰할 수 있는 예측값을 제공하였음을 나타냈다(Bahk et al., 2005; Carrasco et al., 2006). 내부 및 외부 모델링 결과의 실험값과 예측값의 전체 비교는 Fig. 2에 나타냈으며, 모든 결과의 비교에 대한 회귀분석 결과 R²가 0.90 이상의 높은 상관관계를 보였으며 최종적으로 본 연구의 모델링은 받아들여질 수 있다고 판단하였다.

Table 4. Comparison of the observed and predicted growth parameter values of Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis

SGR, Specific growth rate; LT, Lag time; MPD, Maximum population density; CFU, Colony-forming unit; NG, No Growth; NA, No Application. The data are presented as mean values and standard deviation (three samples/condition of temperature). Asterisk (*) also indicates a significant difference between observed and predicted by paired t-test.

Table 5. External validation of the secondary modeling using statistical indices for growth parameters of Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis

MSE, Mean square error; A_f, Accuracy factor; B_f, Bias factor; SGR, Specific growth rate; LT, Lag time; MPD, Maximum population density.

Fig. 2. Comparative plots of the observed and predicted SGR (a), LT (b), and MPD (c) for Bacillus cereus on dried laver Pyropia pseudolinearis.

본 연구는 마른 김의 저장온도-시간 관계 측면에서 마른 김의 생산, 유통, 소비, 보관 전 과정에서 증식할 수 있는 B. cereus 의 성장예측모델을 제시하였다. 수산물의 예측미생물학 연구는 아직 왕성하게 진행되지는 않았으나, 최근 성장예측모델 개발은 과거의 broth 상의 pilot study를 뛰어넘어 실제 식품의 각 위해요소 식중독균을 직접 접종하여 모델을 개발하는 방향으로 전환되고 있다(Juneja et al., 2019). 이러한 관점에서 볼 때, 본 연구는 김의 B. cereus에 관한 예측 모델을 제시하였으며, 3종의 B. cereus 균주를 culture cocktail 기법을 활용하여 다른 표준 균주에 대한 신뢰성을 확보하였다. 하지만 본 연구의 한계로는 미생물 성장관련 중요한 인자를 저장온도만으로 한정하였다는 것이다. 그러나, 본 성장예측 모델은 마른 김의 제조공정에서 HACCP 시스템 적용시 critical control point 및 한계기준설정에 활용될 수 있으며, 또한 미생물위해평가(microbial risk assessment) 수행과정의 노출평가(exposure assessment)를 위한 simulation model에 접목하여 마른김의 제조, 유통 및 소비 전 과정에서 온도-시간 조건별 B. cereus의 성장이 추정 가능하며 이를 근거로 위생관리 및 기준설정에 활용이 가능하리라 사료된다.