Chemical Constituents of Ostericum koreanum Stem

강활(Ostericum koreanum) 줄기의 성분

Abstract

Three coumarins, one chromone, and a phytosterol were isolated from the stem of Ostericum koreanum. Basis on the spectral data, we determined to be the structures of isolated compounds as bergapten, xanthotoxin, auraptenol, hamaudol, and mixture of phytosterols. Auraptenol was isolated for the first time from this plant.

강활의 학명은 Ostericum koreanum, Ostericum praeterium, Angelica reflexa 등으로 보고되어 있으며,^1-3) 대한민국 약전 제12 개정에서는 강활의 학명을 Ostericum koreanum으로 기재하고 있다. 이 식물의 뿌리는 한방에서 신온해표약(辛溫解表藥)으로 산한해표(散寒解表), 거풍지통(祛風止痛)의 효능이 있어 풍한감모(風寒感冒), 풍한습비(風寒濕痺)의 치료에 이용되고 있다.⁴⁾ 강활의 성분연구로는 coumarin, chromone, monoterpene, sesquiterpene 등의 화합물이 분리, 보고되었으며,^5-8) 강활의 추출물 또는 분리한 화합물에 대한 활성으로는 항염증작용,⁹⁾ 항균활성,¹⁰⁾ 항알러지효과,¹¹⁾ 항암활성,¹²⁾ 혈관근이완효과,¹³⁾ 파골세포형성억제효과¹⁴⁾ 등의 활동이 보고되었다. 이상과 같이 강활의 연구는 뿌리를 중심으로 연구가 이루어져 있을 뿐 줄기에 관한 연구는 찾아볼 수 없었다. 이에 본 연구자 등은 강활의 줄기로부터 성분을 분리하고 그 구조를 규명하여 자원으로서의 가능성 여부를 알아봄과 동시에 성분계통분류학의 기초 자료를 제시하기 위하여 연구에 착수하고 MeOH 추출물로부터 5종의 화합물을 분리하고 그 구조를 밝혔기에 이를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료

실험에 사용한 강활(O. koreanum)의 줄기는 2016년 8월 태기산에서 채집하여 강원대학교 약학대학 권용수 교수가 감정한 후 음건하여 실험에 사용하였으며, 확증표본(KNUH-S-1608-1)은 강원대학교 약학대학 생약학 연구실에 보관 중이다.

기기 및 시약

¹H 및 ¹³C-NMR은 Bruker사의 AVANCE 600을 이용하여 측정하였다. Mass spectra는 AB Sciex사의 API 3200 LC/MS/MS systme과 Jeol사의 JMS-700 Mass spectrometer를 이용하여 측정하였다. GC-MS의 분석은 다음의 조건으로 실시하였다. GC는 Agilent사의 Agilent 7890A GC machine을 이용하여 column은 DB-5ms(30 m×0.25 mm, 0.25 µm)를 사용하였으며, 이동상은 He gas를1.5 mL/min로 흘려주었다. injection 온도는 250℃, interface의 온도는 280℃로 유지하였다. MS는 Agilenet 5975C를 이용하여 EI mode에서 70 eV로 측정하였다. Column chromatography용 충진제는 Merck사의 Kieselgel 60 63-200 µm와 40-63 µm를 사용하거나 YMC사의 YMC gel ODS-A, 150 µm을 이용하였다. TLC plate는 Merck사의 precoated Kieselgel 60 F254s(layer thickness 0.25 mm, 20×20 cm, Merck Art. No. 5715), RP-18 F254s를 사용하였다. Open column chromatography에 사용한 용매는 특급시약을 사용하였으며, TLC plate의 발색은 20% ethanol성 H₂SO₄ 용액을 사용하였다.

추출 및 분리

채집한 후 음건한 강활(O. koreanum)의줄기 1.8 kg에 MeOH 9 L를 가하고 수욕상에서 4시간씩 3회 추출한 후 여과한 후 여액을 감압농축하여 116 g의MeOH 엑스를 얻었다. 얻어진 MeOH 엑스를 증류수에 현탁시키고 분액깔대기에 넣고 n-hexane으로 분획하고 감압농축하여 n-hexane 가용성 분획 12 g을 얻었다. 여액을 다시 EtOAc로 분획하고 감압농축하여 EtOAc 가용성 분획 7 g을 얻었으며 마지막으로 n-BuOH를 넣고 분획한 후 농축하여 n-BuOH 가용성 분획 13 g을 얻었다. 연구자 등은 모든 분획의 함유 성분을 분리하고 구조를 규명하기로 결정하고 먼저 n-hexane 분획에 대한 성분 분리를 실시하였다. n-Hexane 가용성 분획 10 g을 silica gel에 흡착시킨 후 silicagel 500 g(63-200 µm)을 column(7×50 cm)에 충진시키고benzne:EtOAc=4:1을 용매로 용출시키고 TLC 분석을 통하여 4개의 분획(OH-1~OH-4)으로 나누었다. 분획 OH-1(2.7 g)을 대상으로 다시 siglica gel (120 g, 63-200 µm) column(4×50 cm)에 걸고 n-hexane:EtOAc=3:1로 용출시켜 5개의 소분획(OH-1-1~OH-1-5)으로 나누었다. 이 중 소분획 OH-1-2를 MeOH로 재결정을 실시하여 침상결정 A(120 mg)를 얻었다. 소분획 OH-1-4(0.4 g)를 대상으로 silica gel(20 g, 40-63 µm)을 column(2.5×20 cm)에 걸고 n-hexane:EtOAc=3.5:1로 용출시켜 화합물 1(4.8 mg)와 2(2.8 mg)을 얻었다. 분획 OH-4(3.5 g)을 대상으로 silica gel(200 g, 63-200 µm)을 충진제로 column(4×50 cm)에 걸고 n-hexane:EtOAc을 용매로 3:1에서 1:1까지 순차적으로 용출시키고 6개의 소분획(OH-4-1~OH-4-6)을 얻었다. 소분획 OH-4-2(0.6 g)을 대상으로 70% MeOH로 ODS(20 g, 150 µm) column(2.5×20 cm)를 실시하여 화합물 3(1.8 mg)를 얻었다. 소분획 OH4-5(0.9 g)을 대상으로 50% MeOH과 60% MeOH을 용매로 ODS(20 g, 150 µm) column(2.5×20 cm)를 반복 실시하여 화합물 4(1.6 mg)를 얻었다.

침상결정 A

White needles; Liebermann-Bürchard test 양성; ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz): δ 5.33 (1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 5.14 (1H, dd, J=15.1, 8.7 Hz, H-23), 5.01 (1H, dd, J=15.1, 8.7 Hz, H-22), 3.50 (1H, m, H-3), 0.99 (3H, d, J=6.6 Hz, CH₃-21), 0.97 (3H, s, 19-CH₃), 0.89 (3H, d, J=6.5 Hz, 26-CH₃), 0.77 (3H, d, J=7.6 Hz, 27-CH₃), 0.67 (3H, s, 18-CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 150 MHz): δ 140.92 (C-5), 138.46 (C-22), 129.43 (C-23), 121.81 (C-6), 71.91 (C-3), 57.02 (C-14), 56.22 (C-17), 51.39 (C-24), 50.32 (C9), 42.41 (C-4), 42.36 (C-13), 40.64 (C-20), 39.84 (C-12), 37.42 (C-1), 36.65 (C-10), 32.05 (C-25, C-8), 32.03 (C-7), 31.76 (C-2), 29.07 (C-16), 25.55 (C-28), 24.52 (C-15), 21.37 (C-27), 21.23 (C-27, C-11), 19.54 (C-19), 19.14 (C-26), 12.39 (C-29), 12.01 (C-18); GC-MS m/z: peak a (campesterol) (Rt_R: 32.77) 400 [M]⁺ ; peak b (stigmasterol) (Rt_R: 33.47) 412 [M]⁺ ; peak c (β-sitosterol) (Rt_R: 35.11) 414 [M]⁺_.

화합물 1

White powder; ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz): δ 8.15 (1H, d, J=9.8 Hz, H-4), 7.59 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2′), 7.12 (1H, brs, H-8), 7.02 (1H, dd, J=2.2, 0.7 Hz, H-3′), 6.27 (1H, d, J=9.8 Hz, H-3), 4.26 (3H, s, OCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz): δ 161.45 (C-2), 158.52 (C-7), 152.82 (C-9), 149.71 (C-5), 144.93 (C-2′), 139.44 (C-4), 112.83 (C-6), 112.64 (C-3), 106.54 (C-10), 105.17 (C-3′), 93.96 (C-8), 60.21 (OCH₃); ESI-MS (negative mode) m/z : 215 [M-H]^-

화합물 2

White powder; ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz): δ 7.77 (1H, d, J=9.6 Hz, H-4), 7.69 (1H, d, J=2.2 Hz, H-2′), 7.35 (1H, s, H-5), 6.82 (1H, d, J=2.2 Hz, H-3′), 6.38 (1H, d, J=9.6 Hz, H-3), 4.30 (3H, s, OCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz): δ 160.66 (C-2), 147.90 (C-7), 146.83 (C-2′), 144.51 (C-4), 143.10 (C-9), 132.43 (C-8), 126.31 (C-6), 116.69 (C-10), 114.98 (C-3), 113.08 (C-5), 106.91 (C-3′), 61.54 (OCH₃); ESI-MS (negative mode) m/z : 215 [M-H]^-

화합물 3

White powder; ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz): δ 13.00 (1H, s, OH-5), 6.30 (1H, s, H-8), 5.97 (1H, s, H-3), 3.85 (1H, t, J=5.3 Hz, H-3′), 2.93 (1H, dd, J=17.2, 5.6 Hz, H-4′a), 2.71 (1H, dd, J=10.8, 5.6 Hz, H-4′b), 2.30 (3H, s, C2-CH₃), 1.36 (3H, s, C2′-CH₃), 1.32 (3H, s, C2′- CH₃); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz): δ 182.69 (C-4), 166.95 (C-2), 159.90 (C-5), 159.06 (C-7), 156.38 (C-8a), 108.51 (C-3), 104.55 (C-4a), 102.98 (C-6), 78.55 (C-2′), 68.94 (C-3′), 25.54 (C-4′), 25.2 (C-2′), 22.19 (C-2′), 20.70 (C-2); ESI-MS (negative mode) m/z : 275 [M-H]^-

화합물 4

White powder; ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz): δ 7.63 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4), 7.35 (1H, d, J=8.6 Hz, H-5), 6.87 (1H, d, J=8.6 Hz, H-6), 6.25 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3), 4.90 (1H, s, H-4′), 4.81 (1H, s, H-4′), 4.35 (1H, brt, J=3.5 Hz, H-2′), 3.94 (3H, s, OCH₃), 3.20 (1H, dd, J=13.6, 4.7 Hz, H-1′), 3.10 (1H, dd, J=13.6, 8.5 Hz, H-1′), 1.90 (3H, s, 3′-CH₃); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz): δ 161.05 (C-2), 160.67 (C-7), 153.52 (C-9), 147.22 (C-3′), 143.79 (C-4), 129.42 (C-1′), 127.03 (C-5), 115.06 (C-8), 113.19 (C-3), 113.06 (C-10), 110.54 (=CH₂), 107.34 (C-6), 75.28 (C-2′), 56.19 (OCH₃), 18.08 (3′-CH₃); EI-MS m/z (rel. int. %): 260 [M, 3.96]⁺, 242 (5.84), 190 (99.02), 189 (100), 175 (48.60), 161 (36.76), 147 (14.92), 131 (85.15), 118 (10.83), 103 (19.45), 89 (12.34), 77 (14.61).

Fig. 1. The structures of 1-4.

Fig. 2. Key HMBC correlations of 4.

결과 및 고찰

침상결정 A는 Liebermann-Bürchard 반응에 양성이고 ¹H-및 ¹³C NMR spectrum을 비교한 결과 phytosterol 화합물이 혼합물의 형태로 존재함을 알 수 있었고, 문헌^{15, 16)}과의 비교를 통하여 stigmasterol을 주 물질로 동정할 수 있었으나 혼합물의 종류와 비율 등을 확인하기 위하여 GC-MS 분석을 실시한 결과 campesterol 3%, stigmasterol 64.2% 및 β-sitosterol 32.4%의 비율로 존재함을 알 수 있었다. 화합물 1, 2 및 3은 문헌^17-19)과 비교하여 bergapten, xothotoxin, hamaudol로 그 구조를 각각 동정하였다. 화합물 4의 ¹H-NMR spectrum을 보면 δ_H 7.63과 6.25에서 나타나는 J=9.4 Hz의 doublet, 7.35와 6.87에서 나타나는 J=8.6 Hz의 doublet들로부터 이 화합물은 C-7과 C-8의 위치에 치환기가 존재하는 simple coumarin임을 알 수 있었다. ¹⁷⁾ δ_H 4.90과 4.81에서 나타나는 각각의 singlet과 δ_C 110.54에서 나타나는 signal은 DEPT와 HSQC spectra의 분석을 통하여 =CH₂ 기에 의한 것임을 알 수 있었으며, δ_H 4.35에서 나타나는 J=3.5 Hz의 broad triplet, 3.20에서 나타나는 J=13.6과 4.7 Hz의double doublet, 3.10에서 나타나는 J=13.6, 8.5 Hz의 double doublet 및 1.90에서 나타나는 methyl기에 의한 singlet들의 ¹H-¹H COSY, DEPT 및 HSQC spectra 분석을 통하여 이 화합물에는 2-hydroxy-3-methyl-3-butenyl기가 존재하고 있는 것을 알 수 있었다. 또한 δ_H 3.94와 δ_C 56.19에서 나타나는 signal로부터 한 개의 methoxyl기가 치환되어 있음을 알았다. 이들 치환기의 치환위치를 확인하기 위하여 HMBC sepctrum 분석을 실시한 결과 한 개의 methoxyl기는 coumarin 모핵의 7번 위치에 치환되고 2-hydroxy-3-methyl3-butenyl기는 8번에 치환되어 있음을 알 수 있었다. 이 결과들과 문헌^{20, 21)}을 비교하여 이 화합물은 auraptenol로 동정 하였다. 본 연구를 통하여 분리된 화합물들의 활성을 보면 stigmasterol은 항암,²²⁾ 지방대사촉진²³⁾ 등의 활성이 보고되었으며, bergapten은 인지능개선,²⁴⁾ 항염증,²⁵⁾ 항암,²⁶⁾ 골다공증 억제²⁷⁾ 등의 활성이 보고되었고, xanthotoxin은 bergapten과는 methoxyl기의 치환위치만 다를 뿐이어서 활성도 매우 유사하여 기억능 개선효과,²⁸⁾ 골다공증억제²⁹⁾ 활성 등이 보고되고 있다. Hamaudol은 진통작용,³⁰⁾ acetylcholinesterase 억제활성³¹⁾ 등이 보고되었다. Auraptenol은 antilarval settlement activity,³²⁾ antifibrotic acitivity,³³⁾ antibacterial activity³⁴⁾ 등이 보고되었다.

결론

강활(Ostericum koreanum)의 줄기로부터 화합물을 분리하고 성분상을 밝혀 식물화학적 자료를 제시함과 더불어 강활 줄기의 자원으로서의 사용가능성을 알아보기 위하여 연구에 착수하고 MeOH 추출물의 n-hexane 분획을 대상으로 성분을 분리를 실시하고 5종의 화합물을 분리하고 ¹H- 및 ¹³C-NMR, MS 등의 분광학적 분석을 통하여 그 구조를 각각 stigmasterol을 주성분으로 하는 phytosterol의 혼합물, bergapten(1), xanthotoxin(2), hamaudol(3) 및 auraptenol(4)로 동정하였다. 이 결과로부터 유추하면 강활의 줄기도 자원으로서의 가치를 가지고 있는 것으로 생각되며 이를 이용한 추가 연구가 필요한 것으로 생각된다.