다양한 Rotifer (Brachionus plicatilis) 영양강화가 태평양 대구(Gadus macrocephalus) 자어의 성장 및 지방산 조성에 미치는 영향

Effect of Different Rotifer Enrichment Products on Survival, Growth, and Fatty Acid Composition of Larval Pacific Cod Gadus macrocephalus

Abstract

This study compared the survival rates, growth, and fatty acid content of larval Pacific cod Gadus macrocephalus fed with rotifers raised on different enrichment diets. We used four commercial rotifer enrichment products (one domestic, ER1, and three imported, ER2, ER3 and ER4). Twelve 200-L tanks were used, with three replicates per treatment. Larvae were fed rotifers 3 times daily at a rate of 5 rotifers/ml/feeding from 7 to 21 days post-hatch. At the end of the feeding trial, the survival rate and total length of larvae fed ER3 were greater than those of larvae fed ER1, ER2, or ER4. ER3 had the highest proportions of eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), and polyunsaturated acid (PUFA). Partially reflecting this composition, larvae fed ER3 had the highest proportions of DHA and PUFA. These results show a positive effect of rotifer DHA and PUFA proportions on the survival and growth rates of Pacific cod larvae.

서론

태평양 대구(Gadus macrocephalus)는 한국과 일본 해역 및 오호츠크해, 베링해, 알래스카만과 캘리포니아 연안까지 광범위하게 분포하고 수심 40-500 m에서 서식하는 대표적인 한해성 어종이다(Westrheim, 1996; NOAA, 2010). 국내 연근해 어획량은 1982년에 약 4,500톤으로 가장 높았으나, 1990년대에 약 500톤 이하로 급격하게 감소하였다. 이에 따라 대구의 자원 회복을 위한 다양한 초기 종자생산 기술 개발 연구(Kim et al., 2007; Lee et al., 2007; Gwak, 2010; Choi et al., 2011; Gwak et al., 2012; Shin et al., 2019)가 이루어졌으며, 이를 통한 수정란 및 치어 방류사업을 통해 최근 2019년에는 어획량이 약 1만톤으로 상승하여 자원이 회복되고 있는 추세이다(KOSIS, 2020). 그러나 보다 안정적이고 건강한 종자를 대량 생산하기 위해서는 다양한 분야의 연구가 수행될 필요가 있으며, 특히 초기 자어의 영양학적 연구가 반드시 수행되어야 한다.

일반적으로 난황 흡수 직후 자어의 영양 결핍과 기아는 비정 적인 소화기관의 발달, 먹이 효율의 감소 및 먹이섭취 활동의 감소 등과 밀접한 관계가 있다(Heming et al., 1982; Taylor and Freeberg, 1984; Rice et al., 1987; Gisbert et al., 2004). 또한 자어의 입 크기를 고려한 적정 먹이생물의 선택과 이들 먹이생물 내 필수영양소의 함량은 초기 개체발생 단계의 영양 요구량 측면에서 매우 중요하다(Hamre, 2016). 대부분의 해산어 초기 자어의 먹이로서 대량 생산과 영양강화를 통한 영양소 함량 조절이 용이한 rotifer와 Artemia를 주요 먹이생물로 공급한다(Yoshimura et al., 1997; Dhert et al., 2001; Kotani et al., 2009). 특히, rotifer Brachionus plicatilis는 난황 흡수 후 자어가 섭취하기에 용이한 크기와 섭취 자극 움직임 등의 특징을 가지고 있어 개구 후 첫 먹이로서 주로 공급된다. Rotifer는 Chlorella 또는 빵 효모를 먹이로 이용하여 대량 배양이 가능하지만, 초기 자어의 발달과 생존율 향상을 위한 필수영양소가 결핍이 발생하기 때문에 먹이내 필수영양소의 함유를 위한 영양 강화가 필요하다(Coutteau and Sorgeloos, 1997; Sargent et al., 1997, 1999a; Cutts et al., 2006). 특히 docosahexaenoic acid (DHA, C22:6n-3), eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5n-3) 및 arachidonic acid (ARA, C20:4n-6)과 같은 다가불포화지방산 (poly unsaturated fatty acid, PUFA)은 세포막 인지질 이중층의 주요 구성 요소로서 초기 자어의 망막과 뇌 등의 신경 발달에 필수영양소인 것으로 알려져 있으며(Sargent et al., 1997,1999a; Benítez-Santana et al., 2007), 자어의 변태, 체색소 및 스트레스 내성에 효과적인 것으로 알려져 있다(Kanazawa, 1997; Rainuzzo et al., 1997; Watanabe and Kiron, 1994; Weirich and Reigh, 2001).

이와 같이 초기 자어의 성장과 발달을 위해서는 rotifer의 PUFA 함유를 위한 영양강화는 필수적이기 때문에 다양한 상업용 시판 영양강화제가 개발 및 판매되고 있으며, 이를 이용한 영양강화 rotifer의 공급에 따른 다양한 해산어 자어의 생산성에 미치는 영향에 대한 연구가 다수 수행된 바 있다(Coutteau and Sorgeloos, 1997; Dhert et al., 2001; Sorgeloos et al., 2001; Harel et al., 2002; Park et al., 2006; Cavalin and Weirich, 2009). 그러나 태평양 대구 자어의 첫 먹이로서 PUFA가 함유된 상업용 시판 영양강화제를 이용한 영양강화 rotifer의 이용성에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 다양한 상업용 시판 영양강화제를 이용한 rotifer의 영양강화가 태 평양 대구 자어의 생존율, 성장 및 지방산 조성에 미치는 영향을 조사하였다.

재료 및 방법

Rotifer 영양 강화

실험에 이용된 rotifer는 국립수산과학원 동해수산연구소 (Gangneung, Korea)에서 Yoo et al. (2016)의 방법으로 약 155 L 저온성 먹이생물 배양장치에서 10°C에 순치된 rotifer를 이용 하여 영양강화 하였다. 영양강화는 수온 10°C 및 염분 20 psu 배양수가 수용된 원형 배양수조(6 L)에 개체 밀도가 5,000개체/L가 되도록 접종하여 10°C로 조절된 배양기(Cryste, NOVAPRO Co., Ltd., Gwangmyeong, Korea)에서 24시간동안 영 양강화 하였다. 영양강화에 이용된 영양강화제는 국내에서 시판되고 있는 영양강화제 1종(ER1)과 국외 시판용 영양강화제 3종(ER2, ER3 및 ER4)을 사용하였다. 준비한 영양강화제는 1일 2회, 각 로티퍼 배양 수조에 제품사에서 권고하는 첨가 용량에 따라 첨가하였으며, 영양강화한 rotifer는 담수로 잘 세척한 후 먹이원으로 공급하였다.

자어 사육

2019년 1월 경상남도 진해만에서 어획된 대구 어미 5마리를 복부 압박을 통해 확보한 성숙란과 정액을 건식법으로 인공 수정하였다. 수정란은 세란 작업을 거친 후 국립수산과학원 동해수산연구소에 위치한 여과 및 살균 해수가 수용된 5톤 원형 polyethylene 수조의 바닥에 수정란을 고르게 분산시켜 부화를 유도하였다. 부화 전까지 사육수의 평균 수온은 Seo et al. (2007)에 따라 부화 적정 수온인 7°C 내외를 유지하였고, 환수량은 1회전/일, 용존산소와 염분은 각각 9.14±0.26 mg/L와 33.24±0.28 psu를 유지하였다. 수정 후 272시간째에 부화가 관찰되기 시작하였으며, 288시간째에 거의 모든 수정란이 부화하였다. 부화한 자어는 핸들링에 매우 민감하므로 바로 사육 실험에 이용하지 않고, 폐사 발생이 안정적인 시기(부화 후 13 일)까지 부화 수조에서 사육을 실시하였으며, 이때 먹이의 공급 영양강화 하지 않은 rotifer를 1일 3회, 3-4개체/mL 밀도로 공급하였다. 이후 사육 실험을 위하여 마리당 평균 6.0 mm의 부 화 후 14일령 자어를 자외선살균기와 마이크로필터(ø 50 μm)로 살균 및 여과한 해수(33.4 psu)가 담긴 12개의 300 L 원형 fiber-reinforced plastic 수조(수량, 200 L)에 500마리씩을 각각 분산 수용하였다. 사육 실험기간 동안 수온은 평균 7.2°C를 유 지하였고, 환수량은 실험 시작 시에는 3 L/min에서 종료 시에는 5 L/min로 점차적으로 증가시켰다. 광주기는 12 L (light): 12 D (dark) 조건을 유지하였고, 영양강화 rotifer의 공급은 1회 공급 시 5개체/mL밀도로 1일 3회(09:00, 13:00 및 17:00), 2주간 공급하였으며 총 3반복구로 진행하였다.

샘플링 및 성장 평가

2주간의 사육 실험 종료시 각 실험수조에서 생존한 자어 50마리를 무작위로 샘플하였으며, 각 자어의 전장은 digital caliper (Mitutoyo Corporation, Kawasaki, Japan)를 이용하여 0.01 mm단위까지 전장을 측정하였고, 측정한 자어는 일반성분 및 지방산 조성 분석 전까지 초저온(-70°C) 냉동고에 보관하였다.

영양강화 rotifer와 자어의 일반성분 및 지방산 분석

일반성분 및 지방산 분석을 위해 사육 실험 시작시 샘플링한 자어 500마리와 종료시 자어 50마리 및 먹이로 공급된 실험구 별 영양강화 rotifer는 증류수로 깨끗하게 세척한 후 분석에 이용하였다. 일반성분분석은 AOAC (1990)의 방법에 따라 조단 백질(N×6.25)은 KD310-A-1015 KjelROC Analyzer (OPSIS Liquid LINE, Sweden)을 이용하여 분석하였고, 조지질은Soxtec extractor (ST 243 Soxtec™; FOSS, Hillerod, Denmark)를 사용하여 Soxhlet 추출법으로 분석하였다. 수분은 105°C dry oven에서 24시간 건조시킨 후 측정하였으며, 회분은 550°C 회화로에서 4시간동안 태운 후 정량하였다. 지방산 분석은 Folch et al. (1957)의 분석 방법에 따라 chloroform과 methanol 혼합액(2:1 v/v)으로 영양강화 rotifer와 사육 종료시 자어의 총 지질을 추출하여 BF3 -MeOH (Sigma, St. Louis, MO, USA)으 로 지방산을 methylation 시킨 후 SP-2560 capillary column (100 m × 0.25 mm i.d., 0.2 μm film thickness; Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 perkinElmer clarus 600 gas chromatograph (Shelton, CT, USA)으로 지방산 조성을 분석하였다.

통계 분석

SPSS program version 25.0 (SPSS Michigan Avenue, Chicago, IL, USA)를 이용하여 One-way ANOVA와 Duncan’s multiple range test (Duncan, 1955)로서 각 실험구간의 유의성을 검증하였다.

결과

시판용 영양강화제로 영양강화한 rotifer의 일반성분 및 지방산 조성 결과는 Table 1에 나타내었다. 영양강화 rotfier의 수분, 조단백질, 조지질 및 회분 함량은 각각 70.1-71.4%, 13.7- 14.5%, 10.8-11.8% 및 2.1-2.4%의 범위로 나타났다. 그러나 linoleic acid (C18:2n-6)의 함량은 ER2 실험구에서 44.46%로 가장 높게 나타났지만, EPA와 DHA 함량은 ER3 실험구가 각각 7.03%와 24.06%로 다른 실험구에 비하여 비교적 높게 나타났다. 또한 ER3 실험구의 SFA과 n-6 FA 함량 및 EPA/DHA은 다른 실험구에 비하여 낮았으나, PUFA 함량과 n-3 FA 함량 및 n-3/n-6은 다른 실험구에 비해 높게 나타났다.

Table 1. Proximate composition (% wet weight) and fatty acid composition (% total fatty acids) of rotifers enriched with commercial enrichment products

ER, enriched rotifer; SFA, saturated fatty acid; PUFA, polyunsaturated fatty acid, DHA, docosa hexaenoic acid; EPA, eicosapentaenoic acid.

다양한 상업용 영양강화제로 영양강화한 rotifer를 2주간 공급 시 자어의 생존율과 전장은 Fig. 1과 Fig. 2에 나타내었다. 생존율은 ER3 공급구가 유의적으로 가장 높게 나타났으며 (P<0.05), ER4 공급구가 유의적으로 가장 낮은 생존율을 보였다(P<0.05). 전장은 ER4 공급구가 ER3 공급구보다 유의적으로 낮았으나(P<0.05), ER1과 ER2 공급구와는 유의적인 차이가 나타나지 않았다(P>0.05).

Fig. 1. Survival (%) of larval Pacific cod Gadus macrocephalus fed different enriched rotifers at the end of feeding trial. Values are means of triplicate±SE. Different letters in each bar indicated significant (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. ER, enriched rotifer.

Fig. 2. Total length (mm) of larval Pacific cod Gadus macrocephalus fed different enriched rotifers at the end of feeding trial. Values are means of triplicate±SE. Different letters in each bar indicated significant (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. ER, enriched rotifer.

시판 영양강화제로 영양강화한 rotifer를 2주간 공급받은 대구 자어의 일반성분 및 지방산 조성 분석 결과는 Table 2에 나타내었다. 사육 종료시 자어의 일반성분은 공급된 영양강화 rotifer에 따른 유의한 영향이 나타나지 않았다(P<0.05). Oleic acid (C18:1n-9)의 함량은 ER1, ER2 및 ER4를 공급한 실험구가 ER3 공급구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). Linoleic acid (C18:2n-6)의 함량은 ER4를 공급받은 실험구 가 다른 모든 실험구에 비하여 유의적으로 높게 나타났으나 (P<0.05), α-linolenic acid (C18:3n-3)의 함량은 ER2를 공급받은 실험구가 다른 모든 먹이 공급구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). EPA 함량은 ER2와 ER3을 공급받은 실험구가 ER1을 공급받은 실험구에 비하여 유의적으로 높게 나타났으나(P<0.05), ER4를 공급받은 실험구와는 유의적인 차이가 나타나지 않았다(P>0.05). DHA 함량은 ER3을 공급받은 실험구가 나머지 다른 모든 먹이 공급구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). SFA의 함량은 ER4 공급구가 다른 먹이 공급구에 비하여 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), PUFA, n-3 FA, n-3/n-6 및 DHA/EPA은 ER3을 공급받은 실험구가 ER1, ER2 및 ER4를 공급받은 실험구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

Table 2. Proximate composition (% wet weight) and fatty acid composition (% of total fatty acids) of larval Pacific cod Gadus morhua fed rotifers enriched with four different enrichment products

ER, enriched rotifer; SFA, saturated fatty acid; PUFA, polyunsaturated fatty acid, DHA, docosa hexaenoic acid; EPA, eicosapentaenoic acid. Values (means of triplicate±SE) in the same row sharing a common superscript are not significantly different (P>0.05)

고찰

Rotifer는 Brachionus 속으로 인위적으로 필수영양소의 함량을 영양강화를 통하여 조절이 가능할 뿐만 아니라 다양한 기호적인 특성(부유성, 움직임 등) 때문에 대다수 해산어류 자어의 개구 후 첫 먹이로서 널리 이용되고 있다(Hagiwara et al., 2001; Kobayashi et al., 2008; Kotani et al., 2009). Rotifer의 영양강화는 영양소(지방산 등) 조성에 효과적으로 반영되지만(Frolov et al., 1991; Kotani et al., 2013), 배양 조건과 영양강화제의 종류에 따라 몇몇 영양소의 결핍이 나타날 수 있다(Hamre, 2016). 본 연구에서는 국내∙외 시판용 영양강화제를 통한 영양강화가 rotifer의 PUFA 함량을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히 ER3 의 PUFA 함량이 다른 실험 먹이구에 비하여 높게 나타났으며, 필수지방산인 EPA와 DHA 함량 또한 다른 실험구보다 높게 나타났다.

이전 다수의 연구결과(Cho et al., 2001; Faulk and Holt, 2005; Faulk et al., 2005; Park et al., 2006; Garcia et al., 2008)와 유사하게 본 연구에서도 상업용 영양강화제를 통한 영양강화 rotifer의 공급이 태평양 대구 초기 자어의 생존율, 성장 및 지방산 조성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 일반적으로 영양 강화를 통한 먹이생물내 필수지방산 함량의 차이는 해산어 자어의 생산성에 영향을 크게 미치는 것으로 알려져 있다(Bautista and De la Cruz, 1988; Sargent et al., 1997, 1999a, 1999b; Kanazawa, 2003; Tocher, 2003). 본 연구에서도 사육 실험에 이용된 각 영양강화 rotifer내 DHA와 EPA 함량 차이에 따라 생존율과 성장이 각각 차이가 나타났으며, PUFA 함량이 높은 ER3 공급구가 다른 먹이 공급구에 비하여 우수한 생존율과 성장을 보였다.

DHA 및 EPA와 같은 PUFA는 해산어 세포막의 인지질 층의 주요 구성 성분이며(Sargent et al., 1999a), 초기 자어 발달에 있어 중요한 에너지원으로 이용된다(Tocher, 2003). Craig et al. (1994)에서 PUFA 함량이 낮은 rotifer의 공급은 홍민어(Sciaenops ocellatus) 자어의 성장을 감소시켰으며, yellowtail flounder Limanda ferruginea는 rotifer 영양강화를 통한 PUFA 함량의 증가가 자어의 성장 향상에 효과적으로 나타났다(Copeman et al., 2002). 특히, PUFA 함량이 우수한 AlgaMac 2000 (Aquafauna Bio-Marine), Aquagrow Advantage 및 Aquagrow Advantage+ARA (Advanced BioNutrition Corporation, Columbia, Maryland, USA)과 같은 상업용 시판 영양강화제를 이용한 영양강화 rotifer의 공급은 비교적 PUFA 함량이 낮은 미세조류(Isochrysis galbana 또는 Nannochloris oculate)를 이용한 영양강화 rotifer 공급보다 yellowtail snapper Ocyurus chrysurus 자어의 성장을 향상시켰다(Faulk et al., 2005). Faulk and Holt (2005)의 연구에서도 PUFA 함량이 높은 상업용 영양 강화제인 Algamac 2000, Algamac 2000+AquagrowARA 및 AlgaMac 3050 (Aquafauna Bio-Marine)로 영양강화한 rotifer 를 cobia Rachycentron canadum 자어에 공급시 PUFA 함량이 낮은 미세조류 영양강화 rotifer 공급구보다 높은 성장을 보였다. 특히 냉수성 어종인 대서양 대구(G. morhua) 자어는 영양 강화 rotifer의 PUFA 함량이 증가할수록 생존율과 성장 향상에 효과적이었다(Park et al., 2006). 이처럼 시판용 영양강화제를 이용한 rotifer의 영양강화는 PUFA 함량의 증가를 통한 대다수 해산어 자어의 생존율과 성장 향상에 효과적인 것으로 사료된다. 또한 태평양 대구 자어의 생산성 향상을 위해서는 먹이생물의 PUFA 영양강화가 필수적인 것으로 사료되지만, 먹이생물 내 적정 PUFA 함량에 대한 연구는 추후 수행될 필요가 있는 것으로 판단된다.

일반적으로 해산어 부화 직후 자어의 난황내 DHA/EPA 비율은 약 2인 것으로 알려져 있으며(Parrish et al., 1994; Sargent et al., 1997), 이에 따라 대부분의 해산어 초기 자어의 영양강화 rotifer내 적정 DHA/EPA비율은 2인 것으로 알려져 있다(Tocher and Sargent, 1984; Sargent et al., 1999). 본 연구에서 또한 DHA/EPA 비율이 2인 ER3 공급구가 다른 공급구에 비하여 우수한 생존율과 성장을 보였다. 그러나 대서양 대구 자어는 DHA/EPA비율이 증가할수록(10까지) 생존율과 성장 향상에 효과적이었으며(Park et al., 2006), yellowtail flounder 자어는 DHA/EPA 비율이 8인 공급구가 2인 공급구에 비해 높은 성장과 생존율을 보였다(Copeman et al., 2002). 그러나 turbot 과 넙치 자어의 성장은 DHA/EPA비율에 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(Estevez et al., 1999; Furuita et al., 1999). 이와 같이 해산어 자어의 성장과 생존율에 있어서 먹이생물 내 적정 DHA/EPA 비율은 종 특이적인 것으로 사료되며, 본 연구 조건에서 태평양 대구 자어의 생산성 향상을 위한 영양강화 rotifer 내 DHA/EPA 비는 2가 적절한 것으로 판단된다.

또한, Watanabe (1993)는 부화 자어가 성장과 발달함에 따라 어체 내 DHA 함량이 감소하기 때문에 먹이생물의 영양강화를 통한 DHA 공급의 필요성을 강조한 바 있다. 본 연구에서는 사육 실험 종료시 태평양 대구 자어의 DHA 함량은 ER1, ER2 및 ER3 공급구(각 19.52%, 19.32% 및 18.74%)가 시작시 자어의 DHA 함량(25.57%)에 비하여 감소하였으나, ER3을 공급받은 자어의 DHA 함량(28.03%)은 시작시에 비하여 다소 증가하였지만 큰 변화가 없는 것으로 나타났다. 이와 유사하게 Park et al. (2006)의 연구에서 사육 실험 시작시 대서양 대구 자어의 DHA 함량이 사육종료 시까지 큰 변화없이 유지된 공급구가 우수한 성장과 생존율을 보였으며, 이는 상대적으로 높은 DHA 함량과 높은 DHA/EPA 비율을 가진 영양강화 rotifer의 공급에 따른 결과인 것으로 보고하였다. 그러나 본 연구에서 사육 실험 종료시 자어의 DHA 함량을 제외한 다른 필수지방산인 EPA와 ARA 함량은 성장과 뚜렷한 경향이 나타나지 않았으며, 이는 태평양 대구 자어의 성장과 생존율에 있어 영양강화 rotifer 내 필수지 방산 중 EPA와 ARA 보다 DHA에 대한 이용성이 우수한 것으로 판단된다.

이상의 결과를 고려하면 본 연구 조건에서 DHA/EPA 비율이 2인 영양강화 rotifer의 공급은 태평양 대구 자어의 성장과 생존율을 향상시키며, PUFA 함량이 높은 영양강화제를 이용한 rotifer의 영양강화는 먹이의 영양학적 가치를 향상시킬 뿐만 아니라 태평양 대구 자어의 종자 생산에도 효과적인 것으로 판단 된다. 본 연구결과는 태평양 대구 자어를 양식 생산하는데 있어 기초 자료로서 적극 활용될 것으로 기대되며, 추후 보다 안정적인 대량 종자생산을 위한 초기 먹이생물의 필수지방산, 유리아미노산, 수용성 단백질 함량 등을 고려한 영양학적 연구가 필요한 것으로 사료된다.