Korean Journal of Pharmacognosy (생약학회지)

The Korean Society of Pharmacognosy (한국생약학회)
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Isolation of the Constituents from Clinopodium chinense var. shibetchense and Inhibition Activity on Cancer Cell Growth and Nitric Oxide Production

산층층이꽃 추출물로부터 성분 분리 및 암세포성장 및 NO 생성 억제활성

  • Received : 2020.04.14
  • Accepted : 2020.05.28
  • Published : 2020.06.30
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Abstract

This study was performed to find anti-inflammatory or antitumor compounds from the polar fraction obtained from the extract of Clinopodium chinense var. shibetchense (H. Lev) Koidz (Labiatae). Chromatography of the BuOH fraction yielded two flavonoid glycosides (compounds 1 and 2) and two saponins (compounds 3 and 4). On the basis of spectroscopic data, compounds 1 and 2 were identified to be ponciretin 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-α-D-glucopyranoside (neoponcirin) and naringenin 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-α-D-glucopyranoside (isonaringin). Compounds 3 and 4 were identified to be 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-fucopyranosyl}-saikogenin F (buddlejasaponin IV) and 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-fucopyranosyl}-21β-hydroxysaikogenin F (clinoposaponin XV). In addition, ursolic acid (5) was isolated and identified from the CHCl3 fraction. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) assay and sulforhodamine B (SRB) assay were performed to lead a potential anti-inflammatory or anti-tumor compounds from C. chinense var. shibetchense. Of the four compounds (1 - 4), compound 3 considerably inhibited cancer cell growth and NO production (IC50s, 5.59 μM in iNOS assay and 6.62 - 14.88 μM in SRB assay).

Keywords

산층층이꽃{Clinopodium chinenese var. shibetchense (H.Lev) Koidz}의 전초는 생약 풍륜채(風輪菜)의 기원식물의 하나로 약용으로 하고 있다. 이 생약은 여름감기로 열이 있을 때 사용할 수 있으며, 급성담낭염, 장염, 볼거리염, 유선염, 급성결막염, 간염 등에 사용되어 왔다. 그 외에도 종기 치료, 과민성 피부염, 가려움증 등과 같은 곳에도 사용되어왔다.1) 한방 풍륜채의 기원식물로는 산층층이꽃(C. chinenesevar. shibetchense) 외에도 층층이꽃(C. chinense varparviflorum), 두메층층이{C. micranthium (Regel) Hara}, 탑꽃{C. multicaule (Maxim) Kuntze}, 애기탑꽃{C. gracile (Benth.) Kumtze)} 등도 유사식물이므로 풍륜채로 사용될 수 있다.1,2)

저자들은 강원도 원주시 귀래면에서 자생하고 있는 산층층이꽃을 채집할 수 있었으므로 본 연구에서는 그 성분을 동정하고 항염효과 혹은 항암효과를 가지는지 검정하고자 하였다. C. vulgare L. 식물로부터 clinoposaponin에 속하는 성분이 다수 밝혀져 있다.3) 또, Zhu 등은4) C. chinense에서 flavonoid와 triterpene이 결합한 flavonoid-triterpene 성분의 구조와 anti-apoptic effect를 밝힌 바 있다. 그 외에 C.mexicanum으로부터 neoponcirin을 분리한 항불안효과 및 진통효과가 보고되었다.5)

Saikosaponin은 시호에서 분리되어 항바이러스효과,6) 항염효과,7) 항암효과8) 등이 보고되고 있다. 이에 따라 저자들은 산층층이꽃으로부터 그러한 사포닌과 같은 배당체 성분을 분리하여 항암효과 혹은 항염효과가 있는지 테스트하기 위해 본 실험을 수행하였다. 항암효과는 5종의 암세포종{폐암세포(A549), 대장암세포(HCT116), 위암세포(SNU638), 간암세포(SK-Hep-1), 유방암세포(MDA-MB-231)}을 이용하여 SRB assay로 암세포 성장 억제효과를 측정하였고, 항염효과 테스트를 위하여 LPS로 유도한 대식세포(RAW 264.7)의 NO 생산에 대한 저해효과를 실험하였다.

재료 및 방법

기기

선광도는 Atago사의 Polax-2L polarimeter를 이용하여 측정하였다. UV spectrum은 UV-160A UV-visible spectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 그리고 IR spectrum은 JASCO 4200 FT-IR spectrometer를 이용하여 KBr disk 법으로 측정하였다. 1H 및 13C-NMR spectrum은 내부표준물질로 tetrametylsilane(TMS)를 사용하여 Bruker AM-600 spectrometer로 측정하였다. NMR spectrum 측정의 해석을 위하여 이차원의 1H-1 H COSY, 1H-13C COSYNMR spectrum 외에도 HMBC spectrum을 측정하여 스펙트럼 해석을 원활히 하도록 하였다.

식물재료

한국의 강원도 원주시 귀래면에 자생하고 있는 산층층이꽃(C. chinenese var. shibetchense (H. Lev) Koidz, Labiatae)의 지상부 및 지하부를 포함하는 전초를 채집하여 햇볕에서 건조한 후 세절하여 추출을 위한 식물재료로 사용하였다. 산층층이꽃의 식물은 상지대학교 산림과학과 송병민 교수에 의해 동정되었다. 이 식물의 표본 (natchem-#119)은 상지대학교 제약공학과 천연물화학 실험실에 보관 중이다.

추출 및 분획

건조한 후 세절한 산층층이꽃 550 g을 16.0 L의 MeOH에 넣고 환류 하에 3회 반복하여 추출하였다. 이를 여과하여 얻은 추출액을 진공농축기로 감압 하에 농축한 후 이를 동결건조하여 MeOH 추출물 57.5 g을 얻었다. 이 MeOH 추출물 중 46.0 g을 취한 후 이를 분획하기 위하여 증류수 1.0 L에 현탁시킨 후 hexane으로 분배추출하는 과정을 3회 반복하였다. Hexane 가용부는 농축하여 hexane 분획 18.9 g을 얻었다. 수층은 계속하여 같은 방법으로 CHCl3 1.0 L로 분획하는 과정을 3회 반복하였다. CHCl3 가용부를 농축하여 6.8 g의 CHCl3 분획을 얻었다. 남은 수층에 대하여 같은 방법으로 BuOH 1.0 L로 분획하는 과정을 3회 반복하였고, BuOH 가용부를 농축한 후 동결건조하여 BuOH 분획 19.2 g을 얻었다. 18.0 g의 BuOH 분획으로부터 유리당과 무기이온을 제거하기 위하여 diaion HP-20column을 이용하는 컬럼분획을 실시하였다. 이 컬럼에서 먼저 H2O 1.0 L로 용출한 후 40% MeOH 2.0 L로 용출하였다. 40% MeOH로 용출한 용액을 농축하여 얻은 분획을 40% MeOH 분획(12.6 g)이라 하였다.

분리

40% MeOH 분획으로부터 성분을 분리하기 위하여 silica gel column chromatography를 실시하였다. 컬럼으로는 Yamazen사(Japan)의 silica gel column(30 μm, SiO2, 5.2×23 cm)을 사용하였고, 전개용매로는 CHCl3-MeOH-H2O(67 : 33 : 10, 하층)을 사용하여 50 mL씩 수집하였다. 수집된 액을 TLC 체크하여 동일한 화합물군을 포함하는 용액을 모아서 농축하였다.

용리액 7-12번의 분획을 모아서 농축한 CC-1, 17-36번을 농축한 CC-2, 47-56을 농축한 것을 CC-3라 하였다. MeOH에 녹인 CC-1으로부터 침전하는 화합물 1을 얻었다. CC-2는 Sephadex LH-20에서 전개한 후 농축하여 화합물 2와 화합물 3을 얻었다. 그리고 CC-3를 농축하여 화합물 4를 얻었다.

용리액 7-12번의 분획을 모아서 농축한 CC-1, 17-36번을 농축한 CC-2, 47-56을 농축한 것을 CC-3라 하였다. MeOH에 녹인 CC-1으로부터 침전하는 화합물 1을 얻었다. CC-2는 Sephadex LH-20에서 전개한 후 농축하여 화합물 2와 화합물 3을 얻었다. 그리고 CC-3를 농축하여 화합물 4를 얻었다.

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Fig. 1. Structure of compounds 1 - 5 isolated from C. chinense var. shibetchense.

화합물 1 (Neoponcirin)

White powder, [α]D 7.8= + 148.0° (c = 0.0025, MeOH); UV (MeOH) λmax (absorbance) : 230.4 (4.22), 282.8 (4.11), 326.0 (3.77); IR νmax (KBr) cm-1 : 3478 (broad, OH), 2935, 2910 (aliphatic C-H), 1648 (α,β-unsaturated ketone), 1608 (C=C), 1519, 1446 (CH2), 1354 (CH3), 1299, 1185 C-O), 1092 (glycoside CO), 982, 833; 1 H-NMR (600 MHz, pyridine-d5) δ: 5.50 (1H, dd, J=13.2, 3.0 Hz, H-2), 3.19 (1H, dd, J=16.8 and 13.2 Hz, Ha-3), 2.82 (1H, dd, J=16.8 and 3.0 Hz), 6.61 (1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 6.51 (1H, s, J=1.8 Hz, H-8), 7.03 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2',6'), 7.19 (overlapped with pyridine-d5, H-3',5'), 3.67(3H, s, OCH3); 7-O-Glc - 5.62 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1''); 6''-O-rha - 5.46 (1H, brs, H-1'''), 1.56 (1H, d, J=6.0 Hz, CH3 of L-rhmanose); 13C-NMR (150 MHz, pyridine-d5) δ: aglycone - 79.0 (C-2), 42.8 (C-3), 196.7 (C-4), 164.3 (C-5), 97.6 (C-6), 166.3 (C-7), 96.2 (C-8), 131.1 (C-1'), 128.4 (C-2', 6'), 114.3 (C-3', 5'), 160.2 (C-4'); 7-O-glc-101.3 (C-1''), 74.4 (C-2''), 77.6 (C-3''), 71.1 (C-4''), 78.2 (C-5''), 67.2 (C-6''); 6’’-O-rha-102.3 (C-1'''), 71.9 (C-2'''), 72.5 (C-3'''), 73.9 (C-4'''), 69.5 (C-5'''), 18.3 (C-6''').

화합물 2 (Isonaringin)

Amorphous powder, [α]D 6.8 =-84.0° (c = 0.005, MeOH); UV (MeOH) λmax (absorbance) : 230.4 (4.20), 282.6 (4.17), 329.6 (3.73); IR λmax (KBr) cm-1 : 3377 (broad, O-H), 2918 (aliphatic C-H), 1702 (carboxylic acid), 1641 (α,β-unsaturated ketone), 1579, 1520 (C=C), 1448 (CH2), 1370 (CH3), 1272, 1175 (C-O), 1065 (glycoside C-O), 836, 811; 1 H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ: 5.40 (1H, dd, J = 13.0 and 3.0 Hz, H-2), 3.16 (1H, dd, J=17.4 and 3.0 Hz, H-3a), 2.77 (1H, dd, J=17.4 and 3.0 Hz, H-3b), 6.22 (1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 6.18 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 7.34 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2', 6'), 6.85 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3', 5'); 7-O-Glc-4.97 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1'' of D-glc); 6’’-O-rha-4.73 (1H, brs, H1'''), 1.22 (3H, d, J=5.4 Hz, CH3 of L-rha); 13C-NMR (150 MHz, MeOH-d4) δ: aglycone-79.2 (C-2), 42.7 (C3), 197.1 (C-4), 163.5 (C-5), 96.6 (C-6), 165.4 (C-7), 95.8 (C-8), 163.1 (C-9), 103.6 (C-10), 129.8 (C-1'), 129.5 (C2', 6'), 116.0 (C-3', 5'), 157.6 (C-4'); 7-O-glc- 99.8 (C-1''), 75.7 (C-2''), 76.5 (C-3''), 71.0 (C-4''), 79.1 (C-5''), 66.0 (C6''); 6''-O-rha-100.6 (C-1'''), 73.4 (C-2'''), 72.7 (C-3'''), 69.9 (C-4'''), 68.4 (C-5'''), 16.6 (C-6''').

화합물 3 (Buddlejasaponin IV)

Amorphous powder, [α]D 6.8 =-21.4° (c = 0.007, MeOH); IR νmax (KBr) cm-1 : 3388 (broad, O-H), 2940 (aliphatic C-H), 1646 (α,β- unsaturated ketone), 1452 (CH2), 1385 (CH3), 1076 (glycoside C-O), 905, 767; 1 H-NMR (600 MHz, MeOHd4) δ: triterpene-3.65 (1H, dd, J=11.4, 4.2 Hz, H-3), 1.81 (1H, d, J=3.0 Hz, H-9), 5.41 (1H, dd, J=10.8, 3.0 Hz, H-11), 5.97 (1H, d, J=10.8 Hz, H-12), 4.20 (1H, dd, J=11.4, 6.0 H, H-16), 1.80 (1H, brs, H-18), 3.82 (1H, d, J=16.2 Hz, Ha-23), 3.31 (1H, d, J=16.2 Hz, Hb-23), 0.75 (3H, s, H-24), 0.96 (3H, s, H-24), 1.12 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-27), 3.92 (1H, d, J=7.2 Hz, Ha-28), 0.95 (3H, s, H-29), 1.01 (3H, s, H-30); 3-O-fucose-4.98 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1'), 1.29 (3H, d, J=6.6 Hz, H-6'); 2'-O-glc-4.50 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1''); 3'-O-glc-4.63 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'''); 13C-NMR (150 MHz, MeOH-d4) δ: aglycone-37.9 (C-1), 25.0 (C-2), 82.9 (C-3), 43.0 (C-4), 48.5 (C-5), 16.8 (C-6), 30.9 (C-7), 41.6 (C-8), 52.9 (C-9), 34.6 (C-10), 129.2 (C-11), 132.8 (C-12), 84.2 (C-13), 45.1 (C-14), 35.6 (C-15), 64.0 (C-16), 46.7 (C-17), 51.7 (C18), 37.2 (C-19), 30.7 (C-20), 33.9 (C-21), 24.7 (C-22), 63.1 (C-23), 11.2 (C-24), 17.5 (C-25), 18.8 (C-26), 19.9 (C-27), 72.0 (C-28), 22.7 (C-29), 32.6 (C-30); 3-O-fucose-102.1 (C-1'), 75.0 (C-2'), 84.3 (C-3'), 71.1 (C-4'), 69.9 (C-5'), 15.5 (C-6'); 2'-O-glc-103.3 (C-1''), 75.0 (C-2''), 77.0 (C-3''), 71.3 (C-4''), 76.7 (C-5''), 62.2 (C-6''); 3'-O-glc-103.9 (C-1'''), 74.7 (C-2'''), 76.8 (C-3'''), 69.9 (C-4'''), 76.9 (C-5'''), 61.1 (C-6''').

화합물 4 (Clinoposaponin XV)

Amorphous powder, [α]D 6.8 =-13.5° (c = 0.004, MeOH); IR νmax (KBr) cm-1 : 3379 (broad, OH), 2927 (C-H), 1704 (carboxylic acid), 1645 (α,β-unsaturated ketone), 1606 (C=C), 1448(CH2), 1368 (CH3), 1262, 1172 (C-O), 1073 (glycoside C-O), 905, 812; 1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ: 3.65 (1H, dd, J=11.4, 4.2 Hz, H-3), 5.41 (1H, dd, J=10.8, 3.0 Hz, H-11), 5.97 (1H, d, J=10.8 Hz, H-12), 4.20 (1H, dd, J=11.4, 6.0 Hz, H-16), 3.82 (1H, d, J=16.2 Hz, Ha-23), 3.31 (1H, d, J=16.2 Hz, Hb-23), 0.75 (3H, s, H-24), 0.95 (3H, s, H-25), 1.13 (3H, s, H-26), 1.10 (3H, s, H-27), 0.95 (3H, s, H-29), 1.05 (3H, s, H-30); 3-O-fucose-4.89 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1'), 1.29 (3H, d, J=6.6 Hz, H-6'); 2'- O-glc-4.50 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1''); 3'-O-glc-4.63 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'''); 13C-NMR (150 MHz, MeOH-d4) δ: aglycone-37.9 (C-1), 25.0 (C-2), 82.9 (C-3), 43.0 (C4), 48.5 (C-5), 17.5 (C-6), 31.7 (C-7), 41.5 (C-8), 52.8 (C-9), 34.7 (C-10), 129.0 (C-11), 132.8 (C-12), 84.2 (C13), 45.2 (C-14), 35.6 (C-15), 65.0 (C-16), 48.5 (C-17), 51.0 (C-18), 37.9 (C-19), 27.1 (C-20), 73.4 (C-21), 34.7 (C-22); 3-O-fucose-102.1 (C-1'), 75.0 (C-2'), 84.4 (C-3'), 71.0 (C-4'), 69.0 (C-5'), 15.5 (C-6'); 2'-O-glc-103.3 (C1''), 73.9 (C-2''), 77.0 (C-3''), 71.3 (C-4''), 76.8 (C-5''), 62.2 (C-6''); 3''-O-glc-103.9 (C-1'''), 74.7 (C-2'''), 76.9 (C-3'''), 69.9 (C-4'''), 76.9 (C-5'''), 61.0 (C-6''').

CHCl3 분획으로부터 Ursolic Acid의 분리

CHCl3 분획 이 암세포 성장 억제작용을 보였기 때문에 이 분획이 함유하는 주성분을 알기 위한 실험을 하였다. CHCl3 분획 4g을 취하여 silica gel column{Yamazen column(SiO2 30 µm, 110 g, 3.0 cm×40 cm)}에서 전개용매 CHCl3-MeOH-H2O (8 : 1 : 1, 하층)으로 전개하여 25 mL씩 수집하였다. 분획의 번호 11-16 번을 농축한 후 이를 Sephadex LH-20 column에서 더욱 정제하여 화합물 5를 얻었다.

화합물 5 (Ursolic Acid)

amorphous powder, mp 282-283o C; 1 H-NMR (600 MHz, pyridine-d5) δ: 3.46 (1H, tlike), 5.49 (1H, t, J=5.4 Hz, H-12), 2.64 (1H, d, J=10.8 Hz, H-18), 0.97 (3H, s, 23-CH3), 1.02 (3H, s, 24-CH3), 1.00 (3H, s, 25-CH3), 0.85 (3H, s, 26-CH3), 0.98 (3H, s, 27-CH3), 0.89 (3H, d, J = 5.4 Hz, 29-CH3), 1.23 (3H, d, J = 7.8 Hz, 30-CH3); 13C-NMR (150 MHz, pyridine-d5) δ: 39.2 (C-1), 23.7 (C-2), 77.9 (C-3), 39.8 (C-4), 55.6 (C5), 18.6 (C-6), 33.4 (C-7), 39.3 (C-8), 47.8 (C-9), 39.1 (C-10), 23.7 (C-11), 125.4 (C-12), 139.1 (C-13), 42.3 (C14), 27.9 (C-15), 21.2 (C-16), 47.9 (C-17), 53.4 (C-18), 37.1 (C-19), 37.2 (C-20), 30.9 (C-21), 38.9 (C-22), 16.3 (C-23), 17.3 (C-24), 17.2 (C-25), 15.5 (C-26), 23.4 (C27), 179.6 (C-28), 21.2 (C-29), 23.7 (C-30).

세포배양

암세포 성장 억제효과를 위해 사용한 인체 암세포는 폐암 세포(A549), 대장암 세포(HCT116), 간암세포(SK-Hep-1), 유방암 세포(MDA-MB-231) 등의 암세포와 마우스 대식세포(RAW 264.7)을 American Type Collection (ATCC, VA, USA)로부터 제공받았다. 5종의 암세포 중 위암 세포(SNU-638)는 Korean Cell Line Bank(KCLB)로부터 제공받아 사용하였다. 세포주들의 배양을 위해 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS) 및 antibioticsantimycotics(PSF; 100 units/mL penicillin G sodium, 100ng/mL streptomycin과 amphotericin B)를 추가한 배지를 사용하였다. 여기서 SK-Hep-1), MDA-MB-231, RAW 264.7 세포주는 DMEM 배지로 배양하였고, A549, HCT116, SNU-638에 대해서는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 각 세포들은 5% CO2를 함유한 습윤 공기 중에서 37°C 온도를 유지하였다.

세포증식 실험

암세포 성장 억제효과를 위한 실험으로 sulforhodamine(SRB) assay로 수행하였다.9) 여러 농도의 시료를 넣은 96-well plate에 세포를 접종하고, 5% CO2를 함유한 습윤 공기 중에서 37°C에서 72시간 배양한 후 10%trichloroacetic acid로 고정하였다. 고정된 세포 단백질을 1% acetic acid 용액을 포함하는 SRB로 염색한 후 10 mM Tris buffer(pH 10.0)에 녹였다. 세포증식 백분률 계산을 위해 cell proliferation(%) = 100 × [(Atreated- Azero day)/(Acontrol- Azero day)}의 계산식을 이용하였다. 이 식에서 A는 흡광도를 뜻한다. IC50 값의 계산을 위해 TableCurve 2D v5.01(Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 이용한 비직선 회귀분석을 수행하였다.

iNOS Assay

마우스 대식세포주(RAW 264.7 cell)를 10% FBS-DMEM에서 배양하고 24-well plate(2×105 cells/mL)에 접종하였다.10) 그 다음 날 1% FBS-DMEM으로 교체하고 시료를 처리하였다. 1시간이 지난 뒤 NO 생성을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)-control을 제외하고 1 μg/mL LPS를 첨가하였다. 이를 18시간동안 배양한 후 Griess 반응으로 배지의 NO 생성을 측정하였다. 간략히 설명하면, 180 μL의 Griess reagent{0.1% N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride in H2O and 1% sulfanilamide in 5% H3PO4}를 100 μL 배지에 첨가하였다. 흡광도 측정은 540 nm 파장을 이용하였다. iNOS 억제율 계산은 100 × [(Atreated- ALPS-/(ALPS+-ALPS-)]의 식을 이용하였다. 그 IC50의 계산도 세포증식 실험에서와 같이 TableCurve 2Dv5.01(Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)을 이용한 비직선 회귀분석법에 의거하였다. 계산된 IC50의 단위는 MeOH 추출물과 분획물(hexane 분획, CHCl3 분획, BuOH분획)에서는 μg/mL로, 분리된 성분(화합물 1-4)은 μM로 나타내었다.

세포생존율 실험

세포생존율을 시험하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. iNOS assay에서 사용한 상기 24-well plate에 최종농도를 500 μg/mL로 한 MTT 용액을 각 well에 넣고 37°C에서 4시간 배양하였다. 배지 제거 후에 dimethylsulfoxide(DMSO)를 가하였다. 세포생존율 평가는 570 nm에서 측정한 흡광도를 컨트롤 그룹(LPS+)와 비교하여 결정하였다.

결과 및 고찰

산층층이꽃 MeOH 추출물로부터 순차적으로 분획하여 hexane 분획, CHCl3 분획, BuOH 분획을 얻었다. 본 연구에서는 주로 clinoposaponin 유사체 성분의 수득에 관심이 있었으므로 BuOH 분획으로부터 크로마토그래피를 이용하여 성분을 분리하고자 하였다. 이 BuOH 분획으로부터 당과 무기이온을 제거하기 위하여 diaion HP-20 column chromatography에서 H2O로 용출하였고, 계속하여 40%- MeOH로 용출하여 얻은 용출액을 농축하여 40%-MeOH 분획을 얻었다. 이것으로부터 각종의 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물 1-4를 얻었다.

Table I. Inhibition activity (IC50) of the MeOH extract, its fractions, and isolated compounds from C. chinenese var. shibetchese on LPS-induced NO production and cell viability in RAW 26 4.7 cells

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화합물 1은 UV spectrum에서 flavonoid 특유의 band에서 그 흡수극대파장(λmax)이 282.8 nm와 326 nm에서 나타나 flavonoid에 속하는 것으로 예상되었다. 이 화합물은 백색의분말로 얻어지며 IR spectrum에서 OH기(3478 cm-1), 지방족 C-H(2935 cm-1, 2910 cm-1), α,β-unsaturated ketone(1648 cm-1), glycoside bond C-O(1092 cm-1)가 나타나, 이 화합물은 flavonoid glycoside로 예상되었다. 화합물 1의 1H-NMRspectrum에서는 H-6과 H-8이 δ 6.61과 δ 6.51에서 나타나고 J치가 1.8 Hz였으므로 meta-coupling하고 있었다. 또 H2',6'와 H-3',5'가 각각 δ 7.03과 δ 7.19에서 J치가 8.4 Hz로서 서로 ortho-couping하므로 δ 3.67에서 나타나는 3H의 피크는 4'-OCH3에 의한 것임을 알 수 있다. 한편 두 개의 당은 β-D-glucopyranose와 α-L-rhamnopyranose임은 재료 및 방법항에 그 데이터를 나타낸 바와 같다. 이러한 두 당의 결합은 통상의 flavonoid glycoside에서 α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranose(neohesperidose)와 α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranose(hesperidose) 두 종류가 주로 나타나는데11), D-glucose의 C-6이 δC 67.1에서 나타나므로 이것은 (1→6) 결합을 하는 후자에 속하는 이당류임을 알 수 있다. 또, HMBC spectrum에서 L-rhamnose의 H-1'''에 기인한 δ 5.46이 δC 67.1 (C-6'')과 correlation하고 있었으므로 그 사실을 확정하였다. HMBC spectrum에서 Dglucose의 H-1''에 기인한 δ 5.62가 C-7의 δC 166.3과 correlation하고 있었으므로 첫 당인 D-glucose의 당은 비당체의 C-7에 결합하고 있음을 알 수 있다. 이상과 같은 사실로부터 화합물 1은 ponciretin 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside의 화합물인 neoponcirin임을 알 수 있었다. 1H 및 13C-NMR 데이터가 neoponcirin의 문헌치와5,12) 일치하였으므로 화합물 1은 neoponcirin이다.

Table II. Inhibition activity (IC50) of the MeOH extract, its fractions, and isolated compounds from C. chinenese var. shibetchese on cancer cell growth in vitro

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1)Cancer cell line: A549 (lung), HCT116 (colon), MDA-MB-231 (breast), SNU638 (stomach), SK-HeP-1 (liver)

2)Unit: μg/mL in the extract and fractions, μM in the isolated compounds. The value represents the mean of three independent experiments.

3)Positive control.

화합물 2도 화합물 1과 유사한 UV 및 IR data를 보여서 이 화합물은 flavonoid glycoside에 속하는 화합물로 보였다. 그러나 1 H-NMR 및 13C-NMR data로서 OCH3 의 피크가 나타나지 않으므로 이 화합물의 비당체는 naringenin으로 예상되었다. 화합물 2의 1 H- 및 13C-NMR spectrum은 비당체 부분이 naringenin의 문헌치와13) 잘 일치하였다. L-rhamnose 의 H-1의 피크인 δ 4.73이 D-glucose의 H-6에 correlation하였으므로 이당류의 구조는 화합물 1의 경우와 같이 α-Lrhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranose이었으며, Dglucose의 H-1''의 피크인 δ 4.97은 비당체인 naringenin의 C-7에 correlation하므로 첫 당인 D-glucose는 naringenin의 C-7에 결합하고 있음을 알 수 있다. 그러므로 이 화합물은 naringenin 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside 구조를 가지는 isonaringin 화합물인 것으로 동정하였다.

화합물 3과 4는 각각 Liebermann-Burchard 반응에서 양성을 보였을 뿐 아니라, 재료 및 방법항에 IR data를 나타내었듯이 이 두 화합물은 방향족 고리에 따른 피크를 보이지 않는 대신 배당체 결합의 C-O가 1076 cm-1에서 큰 흡수 띠를 나타내어 triterpene glycoside 구조를 가지는 사포닌 화합물로 예상되었다. 화합물 3은 1H-NMR spectrum에서 이 화합물은 oleanane 구조에 따른 피크가 δ 0.75 (H-24), 0.96 (H-25), 1.81 (H-26), 1.07 (H-27), 0.95 (H-29), 1.01 (H30)에 해당하는 singlet로 나타나 6개의 methyl기가 모두 tertiary methyl기였으므로 이 화합물은 oleanane계의 triterpene 구조를 가지고 있음을 알 수 있었다. saikosaponintype 사포닌에서 확인되는 특징적인 H-28의 두 수소의 δ3.92와 δ 3.07이 J치가 7.2 Hz의 doublet로 나타나며 C-28은 δC 72.0에서 나타났다. 그리고 이중결합의 H-11과 H-12가 각각 δ 5.41 (1H, dd, J=10.8, 3.0 Hz)과 δ 5.97 (1H, d, J=10.8 Hz)에서 확인된다. 한편 23-CH2OH의 두 수소가 J=16.2 Hz로 geminal coupling하여 δ 3.82와 δ 3.31에서 나타난다. H-16이 J=11.4, 6.0 Hz로서 double doublet로 분열하여 나타나는 수소가 δ 4.20에서 나타나 16-OH는 β-결합을 하고 있음을 알 수 있었다. 그러므로 이 화합물의 비당체는 saikogenin F의 구조를 가지고 있음을 알 수 있다.3) 한편 saikosaponin-type의 사포닌에서는 나타나는 삼당류는 β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-Dfucopyranosyl가 비당체의 3-위치에 결합한다. 많은 clinoposaponin에서 나타나는 이 구조의 당부에 기인한 NMR data와 잘 일치하였다.3) 그러므로 화합물 3은 3-O-{β-Dglucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-Dfucopyranosyl}-saikogenin F의 구조를 가지는 buddlejasaponinIV로 동정할 수 있었다. 1H 및 13C-NMR data를 buddlejassaponin IV의 문헌치와14) 비교한 결과 잘 일치하였다.

화합물 4는 화합물 3과 유사한 NMR data를 나타내었다. 이 화합물의 13C-NMR data에서 비당체에서 산소가 결합한 탄소인 oxycarbon의 피크가 δ 63.1, (C-23), δ 65.0 (C-16), δ 73.0 (C-28), δ 73.9 (C-21)에서 4개 나타났다. 그러므로 이 화합물은 화합물 3에 비해 OH기를 하나 더 가지고 있어서 그 비당체가 21β-OH를 가지는 21β-hydroxysaikogeninF의 문헌치와 일치하였다.3) 그리고 당부도 β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-Dfucopyranosyl의 삼당류가 비당체의 3-위치에 결합하고 있는 것은 화합물 3과 동일하였다. 이에 따라 화합물 4는 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-fucopyranosyl}-21β-hydroxysaikogenin F의 구조를 가지는 clinoposaponin XV이었다. 화합물 4의 1H 및 13C-NMR data를 clinoposaponin XV의 문헌치와3) 비교한 결과 잘 일치하였다.

이상과 같이 BuOH 분획에서 4종의 화합물을 얻었으나 본 실험 중 CHCl3 분획에서 암세포 성장 억제효과가 나타났으므로, 추가적으로 그 활성물질을 동정하기 위한 차원에서 분리를 수행하여 CHCl3 분획으로부터 화합물 5를 얻었다. 이 화합물은 우선 13C-NMR spectrum에서 탄소 30개의 피크가 나타났으므로 triterpene 화합물로 예상되었다. 1H-NMR spectrum에서는 δ 0.85(C-26), 0.98(C-27), 1.00(C25), 1.01(C-23), 1.02(C-24)에서 5개의 3차 메틸기가 나타나고 δ 0.89(C-29), 1.23(C-30)에서 2차 메틸기가 두 개 나타났으므로 이 화합물은 ursane계의 triterpenoid이었다. H-3이 δ 3.46에서, 그리고 12-olefinic proton이 δ 5.49에서 나타나며, 17-COOH가 δC 179.6에서 확인되므로, 이 화합물은 ursolic acid로 판단되었다. 이 화합물의 1H-NMR 및 13C-NMR data를 ursolic acid의 문헌치와 비교하여 잘 일치하였으므로 화합물 5를 ursolic acid로 동정하였다.

계속하여 약리효과 실험으로 항염효과를 테스트하기 위하여 대식세포를 이용한 iNOS assay 외에도 항암효과를 검색하기 위한 SRB assay를 수행하였다. 본 연구에서는 BuOH 분획에 함유된 배당체 화합물에 관심이 있었으므로 이 분획으로부터 상기와 같이 4종의 화합물을 분리한 후 iNOS assay 및 SRB assay를 수행하였다. iNOS assay에서는 buddlejasaponin IV만이 강한 효과를 나타내었고, 분획 중에서는 hexane 분획이 효과를 나타내었다. 특히 buddlejasaponinIV는 iNOS assay에서 그 IC50가 5.59 μM에서 효능을 보였으며, 이 결과는 세포독성을 나타내는 농도 이하에서 나타나므로 이것은 세포독성 효과에 따른 것이 아니라 iNOS의 활성을 저해한 결과에 따른 것이다. 한편 hexane 분획은 그 IC50가 37.94 μg/ml로 나타나 효과가 있었으므로 iNOS 저해물질을 포함할 것으로 예상된다.

암질환에 대한 유효성을 검증하기 위하여 폐암세포(A549), 대장암세포(HCT116), 위암세포(SNU638), 간암세포(SKHep-1) 및 유방암세포(MDA-MB-231)를 사용하여 SRB assay로 검색하였다. MeOH 추출물과 3종의 분획에 대해 테스트했을 때 CHCl3 분획과 BuOH 분획에서 유효한 효과가 나타났으나, BuOH 분획은 두 암세포인 간암세포(SK-Hep1)와 유방암세포(MDA-MB-231)에서는 효과가 없었다. 분리한 4종(화합물 1-4)의 화합물 중 buddlejasaponin IV만이 5종의 암세포 성장을 유효하게 저해한 반면, 다른 3종의 화합물은 그 효과를 나타내지 못했다. 특이하게 21β-hydroxysaikogenin F를 비당체로 갖는 clinoposaponin XV는 효과를 나타내지 않았으므로 21-OH의 존재 때문인 것으로 보인다. Zhu 등은15) C. chinense (Benth.)에서 분리한, clinoposaponin의 ursane계라 할 수 있는 많은 종의 clinopoursaponin 화합물이 암세포성장 억제효과가 없다는 사실을 보고한 바 있다. 그러나 buddlejasaponin IV는 항암효과가 보고되고 있기 때문에16) 그 구조화학적 측면에서 이 화합물은 항암제로서의 가능성이 있다. 한편, CHCl3 분획이 뚜렷한 암세포성장 저해작용을 나타냈기 때문에 이의 구성성분을 분리하기 위한 실험을 했을 때 그 주성분 화합물은 ursolic acid로 확인되었다. Ursolic acid는 세포독성 및 항암작용 등이 잘 알려졌으므로,17) CHCl3 분획의 활성성분은 ursolic acid임을 잘 판단할 수 있음에 따라 추가적인 세포독성 테스트는 수행하지 않았다.

결론

한약 풍륜채의 약용자원으로 이용되고 있는 산층층이꽃의 항염 및 항암효능을 갖는 활성물질을 검출하기 위하여 식물화학적 연구 및 약리적 연구를 수행하였다. 그 결과 산층층이꽃으로부터 neoponcirin, isonaringin, buddlejasaponin IV, clinoposaponin XV 및 ursolic acid의 화합물을 분리하여 분광학적 데이터를 얻은 후 동정하였다. 항염활성 검정을 위해서는 LPS로 유도한 macrophage RAW 264.7 세포가 생산하는 NO의 양을 측정하였고, 암세포 성장억제 효과검색을 위해서는 5종의 암세포를 이용하여 SRB assay로 그 효능을 측정하였다. 산층층이꽃 추출물의 BuOH 분획에서 얻어진 buddlejasaponin IV의 IC50치가 iNOS assay에서는 5.59 µM이었으며 SRB assay에서는 6.62–14.88 µM 범위에서 나타났으므로, buddlejasaponin IV은 산층층이꽃의 항염 및 항암물질로 중요하게 작용할 것으로 예상된다.

사사

이 논문은 2019년도 상지대학교 교내연구비 지원에 의한 것임.

References

  1. Kim, T. J. (1996) Korean Resources Plants IV, Publishing Center of Seoul National University, pp. 62-63, Seoul.
  2. Ko, K. S. and Jeon, E. S. (2003) Korean Wild Plants, p. 577, Iljinsa, Seoul.
  3. Miyase, T. and Matsushima, Y. (1997) Saikosaponin homologues from Clinopodium spp. The structures of clinoposaponin XII-XX. Chem. Pharm. Bull. 45: 1493-1497. https://doi.org/10.1248/cpb.45.1493
  4. Zhu, Y. D., Chen, R. C., Wang, H., Jiang, H., Huang, X. L., Zhang, M. L., Li, L. Y., Hu, Z., Xu, X. D., Wang, C. J. and Yang, J. S. (2018) Two new flavonoid-triterpene saponin meroterpenoids from Clinopodium chinense and their protective effects against anxia/reoxygenation-induced apoptosis in H9c2cells. Fitoterapia 128: 180-186. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2018.05.023
  5. Cassani, J., Araujo A. G. E., Martinz-Vazquez, M., Manjarrez, N., Moreno, J. and Estrada-Reyes, R. (2013) Anxiolytic-like and antinociceptive effects of 2(S)-neoponcirin in mice. Molecules 18: 7584-7599. https://doi.org/10.3390/molecules18077584
  6. Fang, W., Yang, Y. J., Guo, B. L. and Cen, S. (2017) Antiinfluenza triterpenoid saponins (saikosaponins) from the roots of Bupleurum marginatum var. stenophyllum. Bioorg. Med. Chem. Lett. 27: 1654-1659. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2017.03.015
  7. Yamamoto, M., Kumagai, A. and Yamamura, Y. (1975) Structure and actions of saikosaponins isolated from Bupleurum falcatum L. I. Anti-inflammatory action of saikosaponins. Arzneimittelforschung. 25:1021-1023.
  8. Zhong, D., Zhang, H. J., Jiang, Y. D., Huan, P. W., Qi, H., Cai, C., Zheng, S. B. and Dang, Q (2016) Saikosaponin-d: A potential chemotherapeutics in castration resistant prostate cancer by suppressing cancer metastases and cancer cell stem cell phenotypes. Biochem. Biophys. Res. Comm. 474: 722-729. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2016.05.017
  9. Pyee, Y., Chung, H., Vhoi, T. J., Park, H. J., Hong, J., Kim, J. S., Kang, S. S. and Lee, S. K. (2014) Suppression of inflammatory responses by handelin, a quaianolide dimer from Chrysanthemum boreale, via down regulation of NF-${\kappa}B$ signaling and pro-inflammatory cytokine production. J. Nat. Prod. 77: 917-924. https://doi.org/10.1021/np4009877
  10. Kim, D., Lee, S. K., Park, Y., Kwon, N. and Park, H. J. (2019) Isolation of constituents with nitric oxide synthase inhibition activity from Phryma leptostachya var. asiatica. Nat. Prod. Sci. 25: 34-37. https://doi.org/10.20307/nps.2019.25.1.34
  11. Shin, K. C., Nam, H. K. and Oh, D. K. (2013) Hydrolysis of flavanone glycosides by $\beta$-glucosidase from Pyrococcus furiosus and its application to the production of flavanone aglycones from citrus extracts. J. Agric. Food Chem. 61: 11532-11540. https://doi.org/10.1021/jf403332e
  12. Tang, K. S. C., Konczak, T. I. and Zhao, J. (2016) Identification and quantification of phenolics in Australian native mint (Mentha australis R. Br.). Food Chem. 192: 698-705. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.07.032
  13. Olsen, H. T., Stafford, G. I., Staden, J., Christensen, S. B. and Jager, A. K. (2008) Isolation of the MAO-inhibitor anringenin from Mentha aquatic L.. J. Ethnopharmacol. 117: 500-502. https://doi.org/10.1016/j.jep.2008.02.015
  14. Yamamoto, A., Miyase, T., Ueno, A. and Maeda, T. (1991) Buddlejasaponin I-IV, four new oleanane-triterpene saponins from the aerial parts of Buddleja japonica Hemsl. Chem. Pharm. Bull. 39: 2764-2766 (1991). https://doi.org/10.1248/cpb.39.2764
  15. Zhu, Y. D., Hong, J. Y., Bao, F. D., Xing, N., Wang, L. T., Sun, Z. H., Luo, Y., Jiang, H., Xu, X. D., Zhu, N. L., Wu, H. F., Sun, G. B. and Yang, J. S. (2018) Triterpenoid saponins from Clinopodium chinense (Benth.) O. Kuntze and their biological activity. Arch. Pharm. Res. 41: 1117-1130. https://doi.org/10.1007/s12272-017-0943-9
  16. Kim, J. E., Vhung, W. Y., Chun, K. S., Lee, C. K., Park, H. J., Kim, W. B. and Park. K. K. (2010) Pleurospermum kamtsaticum extract induces apoptosis via Mitochondrial pathway and NAG-1 expression in colon cancer cells. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74: 788-792. https://doi.org/10.1271/bbb.90826
  17. Chi, K. Q., Wei, Z. Y., Wang, K. S., Wu, J., Chen, W. Q., Jin, X. J., Piao, H. R. (2017) Design, synthesis and evaluation of novel ursolic acid derivatives as HIF-$1{\alpha}$ inhibitors with anticancer potential. Bioorg. Chem. 75: 157-169. https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2017.09.013