Anti-lymphoma Activities of Phlojodicarpus sibiricus and Artemisia kruhsiana Besser Extracts

Phlojodicarpus sibiricus와 Artemisia kruhsiana Besser 추출물의 항림프종 효과 분석

Abstract

Phlojodicarpus sibiricus and Artemisia kruhsiana Besser are medicinal plants traditionally used in Russia. Phlojodicarpus sibiricus extracts (PSE) have been shown to have anti-obesity properties, and Artemisia kruhsiana Besser extracts (AKBE) contain terpenoid compounds that exert various medicinal effects. Here, we investigated the potential pro-apoptotic effects of PSE and AKBE in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and elucidated the underlying mechanism. PSE and AKBE treatment of six DLBCL cell lines with various genetic abnormalities effectively reduced cell viability in a dose-dependent manner, while having a minimal impact on the survival of normal murine bone marrow cells and splenocytes. This suggests that the cytotoxic effects of PSE and AKBE are specific to DLBCL cells. Therefore, we expect limited side effects when these plant extracts are administered to DLBCL patients. Our JC-1 assays demonstrate that the pro-apoptotic effects of these plant extracts are produced by a reduction of anti-apoptotic Bcl-2 family members and, thereby, disruption of the mitochondrial membrane potential. Moreover, PSE and AKBE induce cell death independently of Myc, whose abnormalities are frequently observed in patients with DLBCL and are associated with poor prognosis. Our findings reveal hitherto uncharacterized pro-apoptotic effects of PSE and AKBE in DLBCL. Isolation of single compounds with anti-lymphoma activities should be pursued further.

Phlojodicarpus sibiricus와 Artemisia kruhsiana Besser는 러시아 극한 지방에서 자생하며, 민간요법으로 널리 쓰여 왔다. 최근 연구에 따르면, 두 식물 추출액(PSE와 AKBE)은 항비만효과, 혈관신생 억제 효과 등 다양한 의학적 효과를 가진 것으로 나타났다. 본 연구논문에서는 PSE와 AKBE의 항림프종 효과와 기작을 분석하였다. PSE와 AKBE를 다양한 유전적 변이를 가진 DLBCL 세포주에 처리하였을 때, 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하였다. 하지만, 마우스의 골수나 비장으로부터 분리한 정상 세포에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보아, 두 식물 추출액의 세포사멸 효과는 종양세포 특이적인 것으로 예상되며, 환자에 적용할 경우 부작용이 최소한만 나타날 것으로 예상된다. PSE와 AKBE의 세포사멸 효과는 Bcl-2, Bcl-xL, 그리고 Mcl-1 등의 anti-apoptotic Bcl-2 family member 유전자의 감소로 인한 미토콘드리아의 막 전위 붕괴에 기인함을 증명하였다. 흥미롭게도, 두 식물 추출액에 의한 세포사멸 효과는 Myc 종양유전자와는 독립적으로 일어났다. 이 결과를 종합하면, PSE와 AKBE는 항림프종 효과를 보유하고 있으며, 추후 연구를 통하여 세포사멸에 관여하는 단일 물질을 분리할 경우, 기존의 항암제를 대체할 수 있는 새로운 방법을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.

서론

미만성 거대 B 세포 림프종(Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)은 면역 B 세포가 암화된 비호지킨 림프종 중에서 가장 흔한 타입으로 알려져 있다[16]. DLBCL은 사람 면역체계를 구성하는 림프계에서 발생하지만, 위장관의 모든 부위를 비롯하여 폐, 간, 신장 등 다른 주요 장기로의 전이가 자주 발견되는 악성종양이며, 몸의 여러 부위에서 동시에 다발성으로 발병할 수 있다[9,11]. DLBCL은 유전자 발현 프로파일링에 따라서 크게 activated B-cell like (ABC)와 germinal center B-cell like (GCB) 타입으로 나뉘며, 이들은 분자유전학적으로 큰 차이점을 보여 예후와 치료 전략이 다르다[2]. ABC 타입은 GCB 타입에 비하여 생존율이 낮고, NF-κB 신호 경로의 만성적 활성이 가장 큰 특징이며, NF-κB 저해제를 처리하면 세포사가 유도된다[4]. DLBCL의 표준 항암 치료제로는 cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, 그리고 prednisone (CHOP) 병합요법이 주로 사용되고 있다. 악성화된 B 세포 림프종의 약 95%에서 CD20라는 단백질이 세포 표면에서 발현되는데, 2000년도 초반부터 CD20에 대한 단일클론항체인 rituximab 약제가 CHOP 병합요법에 더해진 R-CHOP 치료제는 DLBCL 환자의 생존율을 크게 향상시켰다[3,8]. 하지만, DLBCL 환자의 생존율은 아직 50~60% 정도에 머물고 있으며, 항암제 내성도 해결해야 할 당면 과제로 남아 있는 실정이다.

프로그램화된 세포사멸(apoptosis)은 정교하게 조절되는 과정으로 세포내 DNA의 단편화, 세포의 쪼그라듦, 세포질 수포(bleb)와 융기(apoptotic body) 등의 현상을 보인다. 세포사멸경로는 크게 내인성(intrinsic/미토콘드리아성)과 외인성(extrinsic) 경로로 나뉜다[6]. 내인성 경로는 소포체 스트레스(endoplasmic reticulum stress)와 같이 내부적 자극에 의해 유발되어 미토콘드리아 막 전위가 감소하고 카스파제(caspase)의 활성이 관찰된다. 외인성 경로는 세포외부에서 유래된 Fas-L, TNF-α 등의 세포사멸 리간드가 세포사멸 수용체에 결합하여 death-inducing signaling complexes (DISCs)를 형성함으로써 시작된다. DISC는 pro-apoptotic, anti-apoptotic Bcl-2 단백질의 활성과 발현을 조절하여 미토콘드리아의 막 전위를 감소시키고 카스파제 3과 7의 활성을 향상시킴으로써 세포사멸을 유도한다[5].

Phlojodicarpus sibiricus (PS)는 러시아의 북동부 툰드라 지역에 자생하며, 혈액 관련 질병, 결핵, 신경증, 폐렴 등의 민간 치료제로써 사용되고 있다[15]. 이 식물 추출액은 coumarin이 풍부하여 비만치료제로써 가능성이 제시되었다[7]. Artemisia kruhsiana Besser (AKB)는 PS와 비슷한 지역에서 자생하며, terpenoid 계열의 화합물이 풍부하여 기침, 열, 두통, 장내 기생충을 치료하기 위한 민간요법으로 주로 사용되고 있다[19]. 본 연구 논문에서는 두 식물 추출액의 항림프종 효과를 검증하고, 마우스 골수와 비장 유래의 세포를 이용하여 두 식물 추출액이 정상 세포에 나타낼 수 있는 독성을 분석하였다.

재료 및 방법

Phlojodicarpus sibiricus 추출액(PSE)과 Artemisia kruhsiana Besser 추출액(AKBE)

완전히 건조된 PS와 AKB를 막자사발과 막자를 이용하여 분쇄한 후, 분쇄된 가루 2 g에 70% 에탄올 100 ml을 첨가하고 72시간 동안 교반기로 섞어 추출액을 제조하였다. 추출액을 거름종이로 두 번 거른 후, IKA RV10 Basic V 회전 증발기(IKA® Korea. Ltd)를 이용하여 농축시킨다. 농축된 추출물에 7 ml의 메탄올을 점차적으로 첨가하고 초음파 욕조에서 용해시킨 후 -30°C에 보관하였다.

항체, DLBCL 세포주 및 마우스 정상 세포 배양

Bcl-2 (Cat# sc-7382), Mcl-1 (Cat# sc-819), Myc (Cat# sc-40), β-actin (Cat# sc-47778) 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)사의 제품을 구매하여 사용하였고, Bcl-xL (Cat# 14-6994-81) 항체는 eBioscience (Vienna, Austria)에서 구입하였다. 인간 유래의 DLBCL 세포주(SU-DHL4, SU-DHL6, OCI-Ly1, OCI-Ly8, OCI-Ly19) 및 HBL1은 10%의 FBS (Fetal Bovine Serum, Hyclone), 1% L-glutamine, 1% HEPES, 그리고1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI-1640 (Hyclone, Logan, Utah, USA) 배지에서 5% 이산화탄소와 37°C 환경 하에 배양되었다. 야생형 C57BL/6 마우스의 골수와 비장으로부터 분리한 정상 세포는 10% FBS를 함유한 DMEM (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. 실험동물 사용은 부산대학교 동물윤리위원회(Pusan National University-Institutional Animal Care and Use Committee, PNU-IACUC; Approval Number PNU-2016-1158)의 승인을 받았다.

Myc 과발현 OCI-Ly1 세포주 제작

pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP lentiviral constructs (Systems Biosciences, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 Myc을 안정적으로 발현하는 OCI-Ly1 세포주를 제작하였다[14].

세포 생존율 분석

DLBCL 세포주와 마우스 유래 정상 세포(3×10⁴)를 96-well plate에서 배양하면서 PSE와 AKBE (0.2-1 mg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. MTS (CellTiter 96^Ⓡ AQueous MTS Reagent Powder; Promega, USA) 시약을 첨가한 후, 450 nm에서 GloMax^TM Microplate multiple reader (Promega, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

미토콘드리아 막 전위 분석

식물 추출액의 세포사멸 효과를 확인하기 위하여 DLBCL 세포주에 식물 추출액(0 또는 1 mg/ml)을 처리하여 24시간 배양한 후, 37°C에서 15분 동안 JC-1 (5,5‘,6,6’-tetrachloro-1,1‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide; Abnova, Taipei, Taiwan) 시약을 처리하여 형광 현미경(Olympus, 100 × magnification)으로 세포를 관찰하였다.

Western blot 실험

식물 추출액에 의한 단백질 발현량 변화를 확인하기 위하여, DLBCL 세포주인 SU-DHL4와 OCI-Ly1에 식물 추출액(0, 0.5, 1 mg/ml)을 처리하였다. Na-vanadate (1 mM), β-glycer-ophosphate disodium salt (50 mM), ProteaseArrest^TM(G-Biosciences, USA), β-mercaptoethanol (142 mM), 그리고 EDTA (5 mM)를 함유한 RIPA buffer (ELPIS Biotechnology, Korea)를 사용하여 세포를 용해시킨 후, 100°C에서 10분간 끓인 다음 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 단백질은 PVDF membrane (Immobilon P)에 옮기고 1% BSA (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 blocking하였다. 4°C에서 약 16시간 동안 1차 항체를 처리하고 Tween-20 (P1362; Duchefa Biochemie, Netherlands)를 함유한 Tris-buf-fered saline (TBST)로 10분씩 3번 세척한 후, 2차 항체(Mouse & Rabbit IgG-heavy and light chain HRP-conjugated, Bethyl)를 1시간 동안 처리하였다. 다음으로 membrane을 TBST로 10분씩 3번 상온에서 세척하고 chemiluminescent substrate (EzWestLumi plus; ATTO, Japan)을 처리한 후, Luminograph II (ATTO)를 이용해 단백질 band를 시각화하였다.

통계 분석

통계 분석을 위하여 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타냈으며, 통계적으로 유의미한 차이는 Microsoft Excel (Office 2010)과 GraphPad Prism (Version 5.03)을 이용하여 two-tailed Mann-Whitney 또는 one-way ANOVA test를 수행함으로써 결정되었다. 모든 결과는 최소 3번 이상의 반복 실험을 통하여 재현성을 검증하였다.

결과 및 고찰

PSE와 AKBE의 세포사멸 유도 효과

PSE와 AKBE의 항림프종 효과를 검증하기 위하여 6개의 인간유래 DLBCL 세포주[5개의 GCB 유형(SU-DHL4, SU- DHL6, OCI-Ly1, OCI-Ly8, OCI-Ly19)과 1개의 ABC 유형(HBL1)]를 사용하였으며, 이들 세포주는 Bcl-2, Myc 유전자의 변이를 포함하여 종양 형성과 관련된 다양한 변이를 가진 것으로 알려져 있다[1]. 식물 추출액을 농도 별로 24시간 동안 처리한 후, MTS 시약을 첨가하여 세포 생존율을 측정하였다. 실험에 사용된 6개의 DLBCL 세포주 모두에서 PSE와 AKBE에 의해 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소함을 관찰하였다(Fig. 1A, Fig. 1B). 각 세포주가 두 식물 추출액에 반응하는 민감성을 분석하기 위하여 IC₅₀를 측정한 결과, PSE와 AKBE의 IC₅₀는 각각 274~390 μg/ml과 47~423 μg/ml로써 AKBE에 대해 각 세포주의 민감도가 다양하게 나타났다. OCI-Ly19 세포주는 PSE (IC₅₀ = 274 μg/ml)에 가장 민감한 반면 AKBE (IC₅₀ = 423 μg/ml)에 강한 저항성을 보였다. SU-DHL6 세포주는 AKBE (IC₅₀ = 47 μg/ml)에 높은 민감성을 보였고 PSE (IC₅₀ = 390 μg/ml)에 높은 IC₅₀ 값이 관찰되었다(Fig. 1C). 따라서 이러한 결과를 종합해 보면, PSE와 AKBE는 DLBCL 세포주의 세포 생존율을 효과적으로 감소시키며 이는 혈액암의 잠재적인 치료제로 사용될 가능성을 가질 것으로 예상된다.

Fig. 1. PSE and AKBE induce programmed cell death in DLBCL. Cell viabilities were analyzed by performing MTS assays after the exposure of indicating DLBCL cell lines to (A) PSE or (B) AKBE (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, and 1 mg/ml) for 24 hr. The statistical significance was calculated by using a two-tailed one-way ANOVA test (*p<0.05). (C) The half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) values were calculated using GraphPad Prism 5 after the treatment with indicating concentrations of the plant extracts for 24 hr.

PSE와 AKBE가 마우스 정상 세포에 미치는 영향 분석

앞선 실험의 결과는 두 식물 추출액이 DLBCL 세포주의 세포사멸을 효과적으로 유도한다는 것을 보여주고 있다. 두 식물 추출액이 환자에게 적용되었을 때 나타날 수 있는 부작용을 검증하기 위하여, 야생형 마우스의 골수와 비장으로부터 정상 세포를 분리하여 식물 추출액을 앞과 같은 방법으로 처리하였다. PSE와 AKBE 0.25, 0.5, 그리고 1 mg/ml를 24시간 동안 처리하였을 때, 비장 세포에서는 두 식물 추출액에 의해 세포 생존율이 전혀 감소되지 않았고, 골수 세포에서는 PSE만이 1 mg/ml에서 약 30% 정도의 세포사멸 효과가 관찰되었다(Fig. 2A, Fig. 2B). PSE가 실험에 사용된 대부분의 DLBCL 세포주에서 70% 이상의 세포사멸 효과를 보인 점을 고려할 때, 두 식물 추출액이 마우스 정상 세포에 미치는 영향은 전혀 없거나 매우 적다고 할 수 있다. 따라서, PSE와 AKBE의 세포사멸 효과는 종양 세포 특이적이며, 환자에 적용되었을 때 최소한의 부작용만을 가질 것으로 기대된다.

Fig. 2. PSE and AKBE show minimal cytotoxicity in normal murine splenocytes and bone marrow cells in vitro. Bone marrow cells and splenocytes were isolated from wild-type C57BL/6 mice and treated with (A) PSE or (B) AKBE (0, 0.25, 0.5, and 1 mg/ml for 24 hr), followed by MTS assays to measure cell viabilities. A two-tailed Mann–Whitney test was used to calculate the statistical significance (*p<0.05).

PSE와 AKBE에 의한 미토콘드리아 막 전위 붕괴

미토콘드리아 막 전위의 붕괴는 내인성 뿐만 아니라 외인성 세포사멸에도 관여하며, cytochrome C의 세포질로의 해리와 이에 의한 카스파제의 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[10]. 따라서 본 연구에서는 PSE와 AKBE에 의한 세포사멸 효과와 미토콘드리아의 막 전위 붕괴의 연관성을 분석하기 위하여 JC-1 분석을 수행하였다. JC-1 분자는 미토콘드리아 막이 온전하여 세포질에 머물 때에는 단량체로 존재하여 붉은색 형광을 나타내지만, 미토콘드리아 막이 파괴될 경우에는 미토콘드리아 기질로 이동하여 이량체가 되어 녹색 형광을 띠게 된다. SU-DHL4와 OCI-Ly1 DLBCL 세포주에 메탄올(0.4%)만 처리한 경우 대부분의 세포에서 붉은색 형광을 나타내어 미토콘드리아 막이 정상 상태를 유지하였다. 하지만, PSE와 AKBE (1 mg/ml)를 24시간 동안 처리한 경우, 붉은색 형광보다 녹색 형광이 월등히 많이 관찰되어 미토콘드리아 막 전위가 거의 모든 세포에서 붕괴되었음을 확인할 수 있었다. 이를 수치화하기 위해 대조군과 PSE와 AKBE가 처리된 군에 대한 붉은색과 녹색 형광의 비율을 비교하였을 때, 붉은색 형광의 비율이 SU-DHL4와 OCI-Ly1 DLBCL 세포주에서 90% 이상 감소한 것으로 나타났다(Fig. 3A).

Fig. 3. PSE and AKBE downregulate the levels of anti-apoptotic Bcl-2 family members, and decrease mitochondrial membrane potential. (A) SU-DHL4 and OCI-Ly1 cells were exposed to PSE or AKBE (0 and 1 mg/ml for 24 hr) and stained with JC-1, followed by the analysis using the fluorescence microscopy (Top panel). The JC-1 fluorescence ratio of J-aggregates (red) to J-monomers (green) was calculated to determine the mitochondrial membrane potential (Bottom panel). The statistical significance was calculated by using a two-tailed one-way ANOVA test (*p<0.05). (B) SU-DHL4 cells were treated with the plant extracts (0, 0.5, and 1 mg/ml) for 24 hr, and the protein expression levels of Bcl-2, Mcl-1, and Bcl-xL were confirmed by Western blot analysis.

이러한 현상이 나타나는 원인을 알아보기 위해서 추가적인 실험이 진행되었다. 미토콘드리아의 막 전위는 pro- & anti-apoptotic Bcl-2 family 유전자에 의해 조절되는데, pro-apoptotic Bcl-2 family 유전자의 발현 증가 또는 anti-apoptotic Bcl-2 family 유전자의 발현 감소에 의해 미토콘드리아 막 전위의 붕괴가 유발된다[12]. 여기서 Bcl-2, Mcl-1 등을 포함한 anti-apoptotic Bcl-2 family는 대부분의 DLBCL subtype에서 translocation 또는 overexpression 되어있어 더욱 중요한 의미를 가진다[1]. 따라서 우리는 두 가지 식물추출물이 해당 유전자를 조절함으로써 DLBCL 세포주의 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위해 SU-DHL4 세포주에 PSE와 AKBE 0.5, 1 mg/ml을 처리한 후, Bcl-2, Bcl-xL, 그리고 Mcl-1 anti-apoptotic Bcl-2 family의 단백질 발현을 Western blot으로 확인한 결과 모두 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig. 3B). 이를 종합해보면, 두 식물 추출액은 anti-apoptotic Bcl-2 family 유전자의 발현을 감소시켜 미토콘드리아 막 전위 붕괴를 유발하게 되고 그 결과 세포사멸을 유도하는 것으로 사료된다.

PSE와 AKBE에 의한 세포사멸과 Myc 유전자와의 연관성

Myc 유전자의 과발현은 DLBCL 환자에서 자주 발견되며, 환자의 낮은 생존율과 연관성이 있는 것으로 알려져 있다[17]. 따라서 PSE와 AKBE에 의한 효과적인 세포사멸이 Myc 유전자 발현의 저해와 어떤 연관성이 있는지 분석하기 위하여, DLBCL 세포주인 OCI-Ly1에 CDH vector 또는 CDH-Myc을 안정적으로 발현시키는 돌연변이 세포를 제작하였다(Fig. 4A). 두 식물 추출액(1 mg/ml)을 24시간 동안 처리한 후, MTS 시약으로 세포 생존율을 조사한 결과 CDH vector 또는 CDH-Myc OCI-Ly1 세포주 간에 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 4B). 이 결과는 Myc 유전자의 과발현이 두 식물 추출액이 유도하는 세포사멸 효과를 저해하지 않았으며, 따라서 PSE와 AKBE에 의한 세포사멸은 Myc 유전자와는 독립적으로 일어남을 암시한다.

Fig. 4. Cell killing effects of PSE and AKBE are independent of Myc. (A) OCI-Ly1 cells were transduced with lentiviral CDH-control or CDH-Myc, and translational levels of Myc were confirmed by western blotting. (B) OCI-Ly1 CDH-control or CDH-Myc cells were exposed to PSE or AKBE (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, and 1 mg/ml) for 24 hr, and cell viabilities were measured by MTS assays. A two-tailed Mann–Whitney test was used for calculating the statistical significance (*p< 0.05).

PS와 AKB는 러시아 극한 지방에 자생하며 전통적인 민간요법으로 널리 쓰여 왔다[18,19]. 본 논문에서는 두 식물 추출액이 가지는 항림프종 효과를 다양한 유전적 변이를 가진 DLBCL 세포주를 이용하여 검증하였고, 마우스 정상세포를 이용하여 잠재적인 독성 분석을 in vitro상에서 수행하였다. 또한 PSE와 AKBE가 보유한 세포사멸 효과는 anti-apoptotic Bcl-2 family인 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 유전자의 발현을 감소시켜 미토콘드리아 막 전위 붕괴를 유도시킴을 확인하였다.

앞선 연구(manuscript submitted)에서는 또 다른 러시아 극한 지방 자생 식물인 Dracocephalum palmatum Stephan 추출물(DPSE)에 의한 세포 생존율 저해 효과를 DLBCL 세포주를 이용하여 분석하였다. DPSE는 페놀 계열의 화합물에 의한 강한 항산화 작용을 가지는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, PSE와 AKBE에 의한 세포사멸 효과는 Myc 유전자에 독립적인 데 반해, DPSE에 의한 효과는 Myc 유전자에 의존적인 것으로 나타났다. 즉, Myc 유전자를 과발현하는 OCI-Ly1 세포주에서는 DPSE에 의한 세포사멸 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 또 다른 차이점으로는, DPSE는 Bcl-2 유전자의 발현에 전혀 영향을 미치지 못하는 반면, PSE와 AKBE는 Bcl-2 유전자를 효과적으로 저해하는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 세 식물 추출액이 가지는 항림프종 효과의 분자유전학적 기작은 다를 것으로 예상되며, 관련된 신호분자와 경로에 대해서는 추후 연구가 필요하다.

Anti-apoptotic Bcl-2 family 유전자인 Mcl-1은 많은 암 종류에서 과발현되어 있으며, Bcl-2 저해 약제인 ABT-737의 저항성에 관여하는 것으로 알려져 있다[13]. PSE와 AKBE 0.5 mg/ml을 처리하였을 때, Mcl-1 발현이 약 60% 감소됨을 관찰하였다. 이 결과에 근거하면, PSE와 AKBE는 효과적인 Mcl-1 저해제로 사용될 수 있으며, 두 식물 추출액을 ABT-737과 같은 기존에 개발된 약제와 함께 투여하는 병합 요법을 통해 Mcl-1 약제에 대한 저항성을 극복할 수 있고, 나아가 DLBCL 환자의 치료율을 높이는데 기여할 것으로 기대된다.

감사의 글

이 과제는 부산대학교 교수 국외 장기 파견지원비에 의하여 연구되었음.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.​​​​​​​