Atractylenoide II Isolated from Atractylodes macrocephala Inhibited Inflammatory Responses in Lipopolysaccharide-induced RAW264.7 Macrophages and BV2 Microglial Cells

백출에서 분리된 Atractylenolide II의 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에서의 항염증 효과

Abstract

Atractylodes macrocephala is a perennial herb and is a member of the Compositae family. This plant is known to contain various bioactive constituents indicating anti-inflammatory, neuroprotective, anti-oxidant, immunological enhancement, and gastroprotective effects. In this investigation, we isolated four compounds with similar chemical structures from A. macrocephala, and evaluated their anti-inflammatory effects. Among the four compounds, compound 2(atractylenolide II) showed the second-best inhibitory effect on the lipopolysaccharide(LPS)-induced production of nitric oxide in RAW264.7 macrophages and BV2 microglial cells. Compound 2 also inhibited the LPS-induced the production of prostaglandin E2(PGE2), and the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS) and cyclooxygenase(COX)-2 proteins in both cells. In addition, compound 2 suppressed the production of pro-inflammatory cytokines including interleukin(IL)-1β, IL-6, and tumor necrosis factor(TNF)-α. These inhibitory effects were contributed by inactivation of nuclear factor kappa B(NF-κB) and mitogen-activated protein kinases(MAPKs) pathways by treatment with compound 2. This compound did not induce the expression of heme oxygenase(HO)-1 protein indicating that the anti-inflammatory effect of compound 2 was independent with HO-1 protein. Taken together, these results suggested that atractylenolide II can be a candidate material to treat inflammatory diseases.

백출(Atractylodes macrocephala)은 국화과에 속하는 다년생 초본 식물로써, 동아시아에 널리 분포되어 있다.¹⁾ 중국 전통의학에 따르면 백출이 위장관에서 체액에 비정상적으로 정체되는 것을 풀어주어 기의 순환을 활발하게 해준다고 알려져 있다.²⁾ 때문에, 백출은 약 2천년전부터 비장의 기능 저하로 인한 식욕 저하, 복부팽창, 설사 등의 소화기 계통의 이상 증상과, 담음(淡飮)의 저류로 인한 심계항진(心悸亢進), 부종, 발한, 절박유산 등의 증상을 치료하는데 사용되었다.^{3, 4)} 최근 식물화학 연구를 통해, 백출에는 polyacetylene,⁴⁾ polysaccharide,⁵⁾ sesquiterpene,⁶⁾ phenylpropanoid, coumarin,⁷⁾ 정유 성분, 아미노산, 비타민류, 수지류⁸⁾등의 다양한 성분들이 포함되어 있음이 밝혀졌다. 백출에 포함된 성분 중 하나인 atractylenolide I은 lipopolysaccharide (LPS)로 유도한 RAW264.7 대식세포주에서 항염증 효과를 나타내었다.⁹⁾ 또한, 백출에는 신경 보호 효과,¹⁰⁾ 항암 효과,¹¹⁾항산화 효과,¹²⁾ 면역 증강 효과,¹³⁾ 위장관 보호 효과¹⁴⁾를 나타내는 성분들이 있음이 보고되었다.

대식세포, 미세아교세포, 림프구 세포, 항원제시세포, 비만 세포, 호중구, NK 세포 등 염증 관련 세포들은 인체의 선천적, 후천적 면역 반응을 담당하여, 이 세포들이 활성화되면 염증반응이 발생한다.^{15, 16)} 특히, 인체 전체에 주로 분포되어 있는 대식세포와, 중추신경계에서 대식세포 역할을 하는 미세아교세포는¹⁷⁾ 병원체나 감염체들을 감지하여 염증인자인 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE₂), interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor(TNF)- α 등의 염증성 cytokine, chemokine, 염증 신호 관련 단백질을 분비하여 인체의 항상성을 유지한다.^{18, 19)} 하지만, 지속적인 자극으로 인해 대식세포 및 미세아교세포가 지속적으로 활성화되면, 염증성 인자들의 과발현이 발생하여 심혈관계 질환, 당뇨, 종양, 천식, 패혈증, 신경퇴행성 질환 등의 다양한 염증성 질환이 발생할 수 있다.^{20, 21)}

박테리아 내독소 중 하나인 LPS는 그람 음성 박테리아의 세포벽을 이루는 주요 지질 성분이다. LPS는 toll-like receptor 4(TLR4)와의 결합을 통해 대식세포와 미세아교세포를 활성화하여 염증 반응을 유도할 수 있기 때문에, in vitro 염증 반응 모델에서 주요한 염증 유도 물질로 사용되었다.^22-25) TLR4가 활성화되면 염증성 인자 및 싸이토카인의 유전자 발현에 영향을 주는 nuclear factor kappa B(NFκB), mitogen-activated protein kinase(MAPK) 등의 하위 신호 기전의 활성화를 촉진하게 된다.²⁶⁾ 따라서, NF-κB 및 MAPK 신호 기전 경로의 활성화를 억제하는 것이 염증 인자의 과다 생성을 억제함으로써 염증성 질환 치료 약물의 개발에 중요한 목표라고 할 수 있다.

이번 연구에서는 LPS로 유도한 RAW264.7 대식세포 및 BV2 미세아교세포에서 백출에서 분리된 유사한 구조를 가진 4가지의 화합물을 대상으로 항염증 효과를 평가하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용한 백출(A. macrocephala)은 2018년 12월 경상북도 안동시에서 채집하였으며, 원광대학교 김윤철 교수에 의해 검증하였다. 채집한 표본 시료는 원광대학교 약학대학에 보관하였다.

추출, 분리, 구조 분석

백출(2.0 kg)의 건조된 뿌리줄기를 절단하여 메탄올로 80o C에서 3시간 환류 추출한 뒤 얻은 추출물(100.9 g)을 물과 섞어서(1.0 L ×3) 같은 부피의 nhexane, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol을 이용하여 분할하였다. 각 분획물은 진공 조건에서 농축하여 각각 n-hexane 분획물 8.9 g, CH2Cl2 분획물 3.7 g, EtoAc 분획물 1.5 g, n-BuOH 분획물 3.9, 물 분획물 72.3 g을 얻었다. nHexane 분획물(8.5 g)을 대상으로 silica gel 칼럼 크로마토그래피(CC)를 수행하였고, 이 때 용출 용매로는 기울기 용리법을 사용하였다(100:0→1:1). 이후 결과물을 대상으로 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하여 7개의 분획물 H1~H7을 얻었다. 분획물 H1(3.8 g)에 대상으로 Sephadex LH-20 CC(n-hexane, 100:0)를 수행하여 정제하여 6개의 소분획물 H11~H16을 얻었다. 소분획물 H13을 대상으로 silica gel CC(n-hexane/EtOAc, 30:1→10:1)와 ODS CC(MeOH/H2O, 1:1→3:1)를 수행하여 화합물 2(90.2 mg)을 얻었다. 분획물 H2(1.1 g)을 대상으로 silica gel CC를 수행하였고, 이 때 용출 용매로는 기울기 용리법을 사용하였다(n-hexane/EtOAc, 50:1→10:1). 그 결과 3개의 소분획물 H21~H23을 얻었다. 소분획물 H21을 대상으로 ODS CC(MeOH/H₂O, 2.5:1→3.5:1)를 반복적으로 수행하여 화합물 4(50.6 mg)를 얻었다. 분획물 H3(1.2 g)을 대상으로 silica gel CC를 수행하였고, 이 때 용출 용매로는 기울기 용리법을 사용하였다(n-hexane/ EtOAc, 15:1→5:1). 그 결과 6개의 소분획물 H31~H36을 얻었다. 그 중 소분획물 H31을 대상으로 silica gel CC(nhexane/EtOAc, 25:1→15:1)와 ODS CC(MeOH/H2O, 1.5:1→3.5:1)을 수행하여 정제하였고, 그 결과 화합물 1(55.6 mg)과 화합물 3(165.6 mg)을 얻었다. 분리된 4개의 화합물을 대상으로 1 H-NMR 및 13C-NMR을 수행하여 다음과 같은 스펙트럼을 얻었고, 기존에 보고된 문헌과 비교하여 각각의 구조를 결정하였다(Fig. 1).

Fig. 1. The chemical structures of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, and atractylenolide VII.

Atractylenolide I²⁷⁾

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 5.59 (1H, s, H-9), 4.90 (1H, d, J=1.2 Hz, H-15b), 4.61 (1H, d, J=1.2 Hz, H-15a), 2.67 (1H, dd, J=16.8, 3.6 Hz, H -6α), 2.52 (1H, tdd, J=16.8, 13.6, 2.0 Hz, H -6β), 2.30-2.38 (2H, m, H-3β, 5β), 2.04 (1H, m, H-3α), 1.89 (3H, d, J=1.6 Hz, H-13), 1.58-1.73 (4H, m, H-1α, 1β, 2α, 2β), 0.92 (3H, s, H-14); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 171.5 (C-12), 148.4 (C4), 148.2 (C-7), 148.1 (C-8), 120.5 (C-11), 119.2 (C-9), 107.5 (C-15), 48.5 (C-5), 39.2 (C-1), 38.2 (C-10), 36.3 (C-3), 23.1 (C-6), 22.7 (C-2), 18.7 (C-14), 8.6 (C-13).

Atractylenolide II²⁸⁾

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.83 (1H, d, J=1.2 Hz, H-15b), 4.80 (1H, t, J=6.4 Hz, H-8), 4.57 (1H, d, J=1.2 Hz, H-15a), 2.68 (1H, dd, J=13.6, 3.6 Hz, H -6α), 2.23-2.36 (3H, m, H-3β, 6β, 9β), 1.94 (1H, td, J=13.2, 6.0 Hz, H-3α), 1.80 (1H, m, Hα-5), 1.78 (3H, d, J=1.6 Hz, H13), 1.52-1.62 (3H, m, H-1β, 2α, 2β), 1.27 (1H, m, H1α), 1.09 (1H, t, J=12.0 Hz, H-9α), 0.86 (3H, s, H-14); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 174.8 (C-12), 162.6 (C7), 148.5 (C-4), 120.2 (C-11), 107.0 (C-15), 78.1 (C-8), 50.0 (C-5), 47.6 (C-9), 40.9 (C-1), 37.1 (C-10), 36.3 (C3), 25.8 (C-6), 22.4 (C-2), 16.5 (C-14), 8.3 (C-13).

Atractylenolide III²⁹⁾

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.85 (1H, d, J=1.6 Hz, H-15b), 4.58 (1H, d, J=1.6 Hz, H-15a), 2.60 (1H, dd, J=13.2, 3.2 Hz, H-6α), 2.42 (1H, td, J=13.6, 1.2 Hz, H6β), 2.35 (1H, dt, J=12.8, 2.4 Hz, H-3β), 2.26 (1H, d, J=14.0 Hz, H-9β), 1.96 (1H, m, H-3α), 1.83 (1H, m, H5α), 1.78 (3H, d, J=1.6 Hz, H-13), 1.57-1.68 (3H, m, H1β, 2α, 2β), 1.53 (1H, d, J=13.6 Hz, H-9α), 1.24 (1H, dt, J=12.4, 6.0 Hz, H-1α), 1.01 (3H, s, H-14); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 172.5 (C-12), 161.1 (C-7), 148.7 (C-4), 122.2 (C-11), 106.9 (C-15), 103.7 (C-8), 51.8 (C-9), 51.3 (C-5), 41.4 (C-1), 36.8 (C-10), 36.2 (C-3), 24.7 (C6), 22.4 (C-2), 16.7 (C-14), 8.3 (C-13).

Atractylenolide VII³⁰⁾

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.74 (1H, d, J=1.2 Hz, H-15b), 4.60 (2H, s, H-12), 4.46 (1H, d, J=1.2 Hz, H15a), 2.57 (1H, dq, J=14.8, 2.4 Hz, H-8β), 2.49 (1H, dt, J=12.0, 1.6 Hz, H-6β), 2.29 (1H, dd, J=12.4, 1.6 Hz, H3β), 2.05 (3H, s, H-17), 1.92-2.03 (2H, m, H-3α, 8α), 1.73-1.84 (2H, m, H-5α, 6α), 1.71 (3H, d, J=1.6 Hz, H13), 1.56-1.64 (2H, m, H-2α, 2β), 1.53 (1H, dq, J=12.8, 2.4 Hz, H-9β), 1.44 (1H, m, H-1β), 1.15-1.25 (2H, m, H1α, 9α), 0.79 (3H, s, H-14); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 171.5 (C-16), 151.0 (C-4), 139.9 (C-7), 120.3 (C-11), 105.5 (C-15), 65.4 (C-12), 50.3 (C-5), 42.1 (C-1), 41.5 (C-9), 36.8 (C-3), 36.3 (C-10), 28.8 (C-6), 25.7 (C-8), 23.5 (C-2), 21.2 (C-17), 16.6 (C-13), 15.9 (C-14).

시약 및 기기

RPMI1640 배지와 fetal bovine serum (FBS)는 Gibco Laboratories사에서 구입하였고, LPS(055:B5), cobalt protoporphyrin IX(CoPP)는 Sigma사에서 구입하였으며, 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Glentham Life Sciences사에서 구입하였다. 항 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 1차 항체는 Cayman 사에서, 항 cyclooxygenase(COX)-2, 항 inhibitor kappa B (IκB)-α, 항 p-IκB-α, 항 p-p65, 항 p65, 항 p-extracellular signal-regulated kinase(ERK), 항 ERK, 항 p-c-Jun Nterminal kinase(JNK), 항 JNK, 항 p-p38, 항 p38, 항 hemeoxygenase(HO)-1 1차 항체는 Cell Signaling 사에서, 항 βactin 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology사에서 각각 구입하였다. 항 mouse, 항 rabbit 2차 항체는 Merck Millipore 사에서 구입하였다. 96-well, 24-well, 6-well plate와 tissue culture dishes는 Falcon사 제품을 이용하였고, 흡광도의 측정은 Bio-Rad Laboratories의 Microplate Reader를 이용하였다.

RAW264.7, BV2 세포 배양

생쥐 대식세포 유래 RAW264.7 세포주와 생쥐 미세아교세포 유래 BV2 세포주는 100 mm dish에서 10% FBS, penicillin G(100 units/mL), streptomycin(100 mg/mL), L-glutamine(2 mM)이 포함된 RPMI1640 배지를 사용하여, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 1×105 cell/mL의 농도로 배양하였다.

세포 생존율 측정

세포 생존율은 MTT 측정법을 이용하여 확인하였다. RAW264.7 세포 및 BV2 세포를 96-well plate에 1×10⁵ cell/mL의 농도로 심은 뒤, 시험 대상 화합물들을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. MTT 시약을 50 μL 를 첨가하고 37°C에서 3시간 추가적으로 배양하였다. 상등액을 모두 제거한 후, dimethyl sulfoxide(DMSO)를 150 μL 첨가하여 15분간 섞어주고, microplate reader를 이용하여 파장 540 nm 파장 조건에서 흡광도를 측정하였다. Control 그룹의 세포 생존율을 100%로 하여, 다른 그룹의 세포 생존율을 비교하여 백분율로 표기하였다.

NO 측정

배양된 RAW264.7 및 BV2세포에서 medium 으로 분비되어 나온 NO의 양을 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. RAW264.7 세포 및 BV2 세포를 24-well plate에 2×10⁵ cell/mL의 농도로 심은 뒤, 시험 대상 화합물들을 3시간 동안 처리하고 LPS(1 μg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 상등액 100 μL와 동량의 Griess 시약(SigmaAlderich, St. Louis, MO)을 15분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 sodium nitrite의 standard curve를 기준으로 하여 결정되었다.

PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α 측정

배양된 RAW264.7 및 BV2 세포에서 medium으로 분비되어 나온 PGE₂ 및 염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 측정은 ENZO Life Science(Farmingdale, NY) 및 R&D systems(Minneapolis, MN)에서 구입한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 사용하여 측정하였으며, 자세한 방법은 구입한 제품에 동봉된 안내서를 참조하여 실시하였다.

Western Blot을 통한 단백질 발현

RAW264.7 및 BV2세포에 RIPA buffer(Thermo Scientific, MA)를 첨가하여 세포에서 단백질을 추출하였고, 단백질의 정량은 Bradford protein assay(Bio-Rad Laboratories)를 이용하였다. 동량의 단백질을 위한 후 7.5% 및 12% SDS-polyacrylamide gel에서 영동하고 Nitrocellulose membrane(NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer(0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline)에서 blocking한후 iNOS, COX-2, p-p65, p-I_KB-α, I_KB-α, p-JNK, p-p38, p-ERK, JNK, p38, ERK, HO-1 -actin antibody를 1:1000으로 희석하여 넣고 12시간 동안 4°C 조건에서 반응시켰다. 다시 2차 항체(Anti-mouse, Anti-rabbit IgG)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응한 다음, ECL 용액을 1:1로 잘 섞어서 NC membrane위에 부어서 발광시키고 ChemiDoc MP System(Bio-Rad)를 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다.

통계처리

본 실험의 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.05)에서 유의성 있는 것으로 하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서는 백출에서 분리된 구조가 유사한 화합물인 atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, atractylenolide VII를 분리하였고, 이들을 대상으로 LPS로 염증 반응을 유발시킨 RAW264.7 대식세포 및 BV2 미세아교세포에서 항염증 효과를 탐색하여 그 작용기전을 밝히고자 하였다.

우선, 분리된 화합물을 대상으로 MTT assay를 통하여 RAW264.7 및 BV2 세포에서의 독성을 확인하여 세포독성을 나타내지 않는 농도를 확인하였다. 시험 대상 화합물을 10~160 μM의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 CO₂ incubator 에서 배양한 후 세포 생존율을 확인한 결과, 두 세포 모두에서 80 μM까지 세포 독성이 나타나지 않았다(Fig. 2). 이를 바탕으로 이후 실험에 대하여 80 μM을 최고 농도로 설정하였다.

Fig. 2. Effects of test compounds on the viability of RAW264.7 macrophages (A-D) and BV2 microglial cells (E-H). Cells were pre-treated with indicated concentrations of test compounds for 24 h, and cell viability was determined by MTT assay. ***p < 0.001 compared to the control group.

LPS로 자극된 대식세포와 미세아교세포는 최종 부산물로써 NO 및 PGE₂를 발생시킨다.^{16, 31)} NO는 혈관긴장도, 신경 전달, 급성 및 만성 염증, 신체 방어 기전에 영향을 준다.³²⁾다양한 염증 세포가 병원성 유기체의 자극을 받게 되면 다른 세포와 신체를 보호하기 위해 적절한 양의 NO를 생성하게 되어 염증 반응을 유도한다.³²⁾ 하지만, NO가 과다하게 발생하면 염증성 장질환, 신경퇴행성 질환, 암 등의 염증성 질환의 발병을 초래할 수 있다.^33-35) NO는 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase(NOS)의 효소 활성을 통해 합성된다. NOS에는 대표적으로 신경성 nNOS, 유도성 iNOS, 내피성 eNOS의 주요한 isoform이 존재한다.³⁶⁾ nNOS와 eNOS는 신체의 생리적 기능을 유지하기 위해 낮은 농도의 NO를 지속적으로 분비한다. 하지만, iNOS는 LPS, cytokine, chemokine 등 외부 자극에 의해 발현이 증가하며 그 활성이 증가한다.³⁷⁾ PGE₂는 에이코사노이드 지질 조절 인자로써 NO와 같이 염증 반응에 중요한 인자 중 하나이다.³⁸⁾ PGE₂는 prostaglandin H2(PGH2)로부터 microsomal prostaglandin E synthase(mPGES)나 cytosolic prostaglandin E synthase(cPGES)의 효소 반응을 통해 생성된다.³⁹⁾ 생성된 PGE₂는 E-prostanoid receptor(EP) 1, EP2, EP3, EP4의 수용체와 결합하며,⁴⁰⁾ 각각의 수용체는 개별적인 신호 전달 체계를 나타내어 면역반응, 혈압, 위장관 활동, 생식 반응 등 여러 가지 생리적 기능을 조절한다.⁴¹⁾ PGES 이외에 COX 역시 PGE₂의 생성에 관여한다. PGE₂의 전구체인 PGH2는 arachidonic acid(AA)로부터 COX의 효소 반응을 통해 생성된다.^{40, 42)} COX는 COX-1, COX-2의 두 가지 isoform을 가지는데, COX-1는 대부분의 조직에서 낮은 농도로 일정하게 발현되는 반면, COX-2는 iNOS와 마찬가지로 LPS, cytokine, chemokine 등 외부 자극에 의해 발현이 증가하는 유도성 물질이다.^{43, 44)}

위 내용을 토대로 하여, 대상 화합물들이 LPS로 유도한 NO의 생성에 관여하는지를 확인하고자 하였다. RAW264.7 대식세포에서는 화합물 1, 2, 4 전처리에 의해 NO의 생성을 유의적으로 억제하였고, 각각의 IC₅₀값은 29.7 ± 0.93, 71.6 ± 1.89, 55.8 ± 3.06 μM으로 확인되었다(Fig. 3A.). BV2세포에서는 네 가지 화합물 모두가 NO의 생성을 유의적으로 억제하였으나, 화합물 1과 2에 의해 실험 농도 범위 내에서 50% 이상 억제 효과가 나타났으며, 각각의 IC₅₀값은 27.3 ± 0.32, 49.9 ± 2.07 μM으로 확인되었다(Fig. 3B.). 화합물 1이 RAW264.7 및 BV2 세포 모두에서 가장 효과적으로 NO의 생성을 억제하였으나, 이전 연구에서 화합물 1이 RAW264.7 세포에서 cluster of differentiation 14(CD14)/ TLR4 경로를 통한 NF-κB 및 MAPK 신호 기전의 활성 억제를 통해 항염증 효과를 나타낸다는 보고가 있었다.⁹⁾ 또한, 화합물 1은 HO-1 단백질의 발현을 유도하여 NF-κB 신호 기전을 억제함으로써 신경 보호 효과를 나타낸다는 보고도 있었다.¹⁰⁾ 따라서, 화합물 2가 PGE₂의 생성 및 iNOS 및 COX-2 단백질의 조절에 관여하는지를 확인하였다. RAW264.7 및 BV2 세포 모두에서 화합물 2에 의해 LPS로 유도한 PGE₂의 생성과(Fig. 4A, B.) iNOS 및 COX-2 단백질의 발현이 억제되었다(Fig. 4C, D.).

Fig. 3. Effects of test compounds on the LPS-induced production of NO in RAW264.7 macrophages (A) and BV2 microglial cells (B). Cells were pre-treated with 20, 40, and 80 μM of test compounds for 3 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. Nitrite levels were determined using the Griess reaction. Values shown are means ± SD of three independent experiments. *p < 0.05, and ***p < 0.001 compared to the LPS treated group.

Fig. 4. The effect of compound 2 on the LPS-induced production of PGE₂ and the expression of iNOS and COX-2 proteins in RAW264.7 macrophages and BV2 microglial cells. Cells were pre-treated with indicated concentrations of compound 2 for 3 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. (A, B) The concentration of PGE₂ was quantified by ELISA. Values shown are means ± SD of three independent experiments. ***p < 0.001 compared to the LPS treated group. (C, D) Western blot analyses were performed as described in Materials and methods. Representative blots from three independent experiments are shown.

Cytokine은 크기가 작고 저분자량의 비구조 단백질로써, 염증 및 면역 반응에 복합적으로 작용한다.^{45, 46)} IL-1β, IL6, TNF-α 등의 염증성 cytokine은 활성화된 면역 세포에서 주로 생성되며, 이들의 생성이 증가하면 신경퇴행성 질환, 골관절염 등의 염증성 질환이 발생할 수 있다.^47-50) 따라서, 화합물 2의 LPS로 유도한 염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 분비에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 두 가지 세포 모두에서40 및 80 μM의 농도의 화합물 2에 의해 IL-1β, IL-6, TNF-α의 분비가 억제되었다(Fig. 5).

Fig. 5. The effect of compound 2 on the production of pro-inflammatory cytokines in LPS-induced RAW264.7 macrophages (A-C) and BV2 microglial cells (D-F). Cells were pre-treated with indicated concentrations of compound 2 for 3 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. The concentration of IL-1β, IL-6, and TNF- was quantified by ELISA. Values shown are means ± SD of three independent experiments. ***p < 0.001 compared to the LPS treated group.

위와 같은 일련의 염증 반응들은 NF-κB와 MAPK 신호기전 경로에 의해 조절되며,^{51, 52)} LPS 자극으로 인해 이들 신호 기전이 활성화되면 iNOS, COX-2 단백질과 염증성 cytokine의 mRNA의 발현을 유도한다.⁵³⁾ 자극을 받지 않은 상태에서는 NF-κB subunit들은 세포질에서 IκB-α 단백질과 결합한 상태로 존재한다. LPS, cytokine, chemokine 등에 의해 자극을 받은 세포에서는 IκB-α의 인산화 및 소멸 반응이 발생하여 NF-κB subunit이 IκB-α와 분리된다. 분리된 NFκB subunit인 p65와 p50의 이합체에서 p65의 serine 276, 536 등 여러 잔기에서의 인산화 반응이 발생한 후 핵 내부로 이동하여 DNA와 결합한 뒤 다양한 염증 인자들의 생성을 유도한다.⁵⁴⁾ 따라서, 화합물 2가 IκB-α의 인산화 및 소멸 반응과 NF-κB p65 subunit의 인산화 반응에 미치는 영향을 통하여 NF-κB 경로의 조절의 관여하는지를 확인하였다. 화합물 2의 처리에 의해 RAW264.7 및 BV2 세포 모두에서 IκB-α의 인산화 및 소멸 반응이 모두 억제되었고, p65 subunit의 인산화 반응 역시 억제되었다(Fig. 6).

Fig. 6. The effect of compound 2 on the activation of NF-κB pathway in LPS-induced RAW264.7 macrophages (A) and BV2 microglial cells (B). Cells were pre-treated with indicated concentrations of compound 2 for 3 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 1 h. Western blot analyses were performed as described in Materials and methods. Representative blots of three independent experiments are shown.

MAPK 신호 경로는 serine/threonine protein kinase 계열로써, 주로 세포의 성장, 분화, 증식, 사멸 반응과, 스트레스 대응 반응, 염증, 면역 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁵⁵⁾ MAPK 경로에 관여하는 주요한 3가지 단백질로는 ERK, JNK, p38 MAPK가 있다.⁵⁶⁾ 기존의 여러 연구들에서 MAPK 신호 경로의 활성화가 염증 인자의 발현과 연관이 있으며, 천연물 유래의 물질을 처리함으로써 MAPK 신호 경로의 활성화를 억제할 수 있음이 입증되었다.^{57, 58)} 이에 따라, 화합물 2가 MAPK 경로의 조절에 관여하는지를 확인하고자 하였다. RAW264.7 세포에서는 p38과 JNK의 인산화 반응이 화합물 2에 의해서 억제되었다. BV2 세포에서는 ERK와 JNK의 인산화 반응이 유의적으로 나타났지만, p38의 인산화 반응은 억제는 되었으나 그 정도가 미미하였다(Fig. 7). Total p38, total ERK, total JNK의 발현 양에는 변화가 없음을 확인하였다.

Fig. 7. The effect of compound 2 on the activation of MAPK pathways in LPS-induced RAW264.7 macrophages (A) and BV2 microglial cells (B). Cells were pre-treated with indicated concentrations of compound 2 for 3 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 30 min. Western blot analyses were performed as described in Materials and methods. Representative blots of three independent experiments are shown.

염증 및 산화적 스트레스 반응이 발생하면 체내에서는 면역학적 반응을 통해 HO-1 단백질의 발현을 유도한다. HO1는 heme이 분해되는 반응에 효소로써 작용을 하는데, 이 반응에서 일산화탄소(CO), 빌리루빈으로 전환되는 빌리버딘, 철 이온이 생성되며, 이 물질들은 항산화 및 항염증 작용과 관련이 있다고 알려져 있다.⁵⁹⁾ 특히 일산화탄소는 염증 인자와 cytokine의 생성에 관여하여 염증 반응을 조절한다고 알려져 있다.⁶⁰⁾ 따라서, 화합물 2가 HO-1 단백질의 발현을 유도할 수 있는지 여부를 확인하였다. Western blot 분석 결과, 화합물 2를 12시간 동안 처리하였으나 RAW264.7및 BV2 세포 모두에서 HO-1 단백질을 발현하지 않았다 (Fig. 8A, B).

Fig. 8. The expression of HO-1 protein by compound 2 in RAW264.7 macrophages (A) and BV2 microglial cells (B). Cell were treated with compound 2 for 12 h. Western blot analyses were performed as described in Materials and methods. Representative blots of three independent experiments are shown.

구조-활성 관계(Structure-activity relationship, SAR)은 분자의 화학적 구조와 그 생물학적 활성 사이의 관계를 일컫는 말로써, 화학적 구조가 유사하더라도 특정 화학군들이 나타내는 차이로 인해 생리학적 활성이 다를 수 있음을 의미한다. 화합물 1은 8번 탄소와 9번 탄소가 이중 결합으로 결합되어 있고, 화합물 2에서는 단일 결합으로 결합되어 있으며, 하나의 proton이 8번 탄소에 결합되어 있는 형태로 확인되었다. 두 화합물의 화학적 구조는 유사하였으나, 생물학적 활성에는 큰 차이를 보였다. RAW264.7 및 BV2 세포 모두에서 가장 좋은 NO 억제 효과를 나타냈던 화합물 1은 두 세포 모두에서 HO-1 단백질의 발현을 유도하였다(결과표시하지 않음). 앞서 언급한 바와 같이, 화합물 1은 RAW264.7 세포에서 항염증 효과를 나타내고, BV2 세포에서 HO-1 발현을 통해 신경 보호 효과를 나타낸다고 보고되었다.^{9, 10)} 이와 같은 결과는 화합물 1이 HO-1 단백질의 발현과 그와 관련된 분자 기전의 활성화를 통해 대식세포 및 미세아교세포에서 항염증 효과를 나타내는 것이라 유추할 수 있다. 하지만, 화합물 2는 두 세포 모두에서 HO-1 단백질을 발현하지 못하였고, 이를 통해 화합물 2의 항염증 효과는 HO-1의 발현과는 독립적으로 발생하는 것이라고 할수 있다. 따라서, 이번 결과를 통해 유사한 구조를 가지는 화합물들이 특정 화학적 그룹에 의해 서로 다른 약리학적 활성을 나타낼 수 있음을 시사하고 있다.

결론

본 연구에서는 백출에서 분리한 atractylenolide II 성분(화합물 2)의 LPS로 염증 반응을 유도한 RAW264.7 대식세포 및 BV2 미세아교세포에서의 항염증 활성과 그 기전을 확인해보고자 하였다. 화합물 2는 RAW264.7 및 BV2 세포에서 LPS 자극으로 인한 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 억제함으로써 NO 및 PGE₂의 생성을 억제하였고, IL-1β, IL6, TNF-α 등 염증성 cytokine의 생성 역시 감소시켰다. 이와 같은 화합물 2의 항염증 효과는 NF-κB 및 MAPK 경로의 활성화의 억제에 의한 것으로 판단되는데, 특이한 것은 RAW264.7 세포에서는 p38과 JNK MAPK의 활성화를 억제하였지만, BV2 세포에서는 ERK 및 JNK MAPK의 활성화가 주로 억제되었다는 점이다. 이는 적용 세포에 따라서 약리적 활성에 차이가 있음을 시사하고 있다. 또한, 화합물 2가 두 가지 세포 모두에서 HO-1 단백질을 발현하지 않는다는 점에서, 화합물 2의 항염증 효과는 HO-1 발현과는 독립적으로 발생하는 것임을 확인하였다. 이와 같은 연구 결과는 atractylenolide II가 항염증 효과를 나타냄으로써 추후에 백출에서 유래한 성분들이 천연물 유래 신약 후보 물질이 될 수 있음을 보여주는 기초적인 실험 근거를 제시하고 있다.