Inhibitory Effects of Euchrestaflavone B on Thrombus Formation via Regulation of Cyclic Nucleotides in Collagen-induced Platelets

콜라겐 유도의 혈소판에서 사이클릭 뉴클레오티드의 조절을 통한 Euchrestaflavone B의 혈전 형성 억제 효과

Abstract

Euchrestaflavanone B (EFB) is a flavonoid that can be found in root bark, particularly in Cudrania tricuspidata (C. tricuspidata). The extract of C. tricuspidata is widespread throughout Asia and used in traditional medicine. In a previous study, we found anti-platelet effects of substances isolated from C. tricuspidata on collagen-induced human platelets. However, the C. tricuspidata still contains numerous substances, thus, we have searched new candidate, EFB isolated from C. tricuspidata for anti-platelet effect. Our results showed that EFA inhibited collagen-induced platelet aggregation and glycoprotein IIb/IIIa (αIIb/β3)-mediated signaling events, including platelet adhesion, granule secretion, thromboxane A2 production and clot retraction. These results suggest that EFA has inhibitory effects on human platelet activities and thrombus formation and has potential value as a natural substance for preventing platelet-induced thrombosis.

인체 혈소판은 손상된 혈관의 지혈작용에 관여하는 세포이며, 동시에 혈전증, 심근경색 그리고 죽상 동맥경화와 같은 순환장애를 유발시킬 수도 있는 세포로 잘 알려져 있다. 혈소판은 직접적으로 심혈관계 질환에 영향을 줄 수 있는 세포이기 때문에 이를 억제하기 위한 약물 또한 많이 개발되어 있고 지속적인 연구가 활발하게 진행되고 있다. 하지만 심혈관계 질환에 대한 사망률은 감소하지 않고 있다.¹⁾ 혈관의 손상부위에 노출된 collagen은 순환 혈소판을 활성화시키고, phospholipase C의 작용에 의해 혈소판 막의 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate는 inositol-1,4,5-triphosphate(IP₃)와 diacylglycerol로 가수분해된다. 분해되어 세포질로 유리된 IP₃ 는 저장된 Ca²⁺을 세포질로 방출한다. 세포질내 Ca²⁺은 Ca²⁺/calmodulin dependent kinase의 작용을 유발하여 myosin light chain을 인산화 하고 granule release를 일으킨다.²⁾ 혈소판의 활성화는 혈소판 막의 glycoprotein IIb/IIIa(αIIb/β3)의 구조를 변환시키고, 이러한 변화는 αIIb/β3가 각종 adhesive protein과의 결합을 가능하게 하여 outside-in signaling pathway를 유도한다.^{3, 4)} 또한 혈소판 세포질에 존재하는 효소인 cytosolic phospholipase A₂(cPLA₂)는 Ca²⁺과 결합하여 활성화되고 세포질에서 혈소판 막으로 이동하여 arachidonic acid를 세포질로 유리한다.⁵⁾ 이 후 arachidonic acid는 thromboxane A₂(TXA₂) 합성 효소의 작용에 의해 생성되어 강력한 agonist로 작용한다.^{6, 7)}

꾸지뽕나무(Curdrania tricuspidata)는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하는 낙엽활엽 소교목으로 우리나라, 일본, 중국 등지에 자생하는 식물이며, 다수의 xanthones과 flavonoids를 포함하고 있는 것으로 보고되었다.⁸⁾ 꾸지뽕나무의 생리활성 작용으로는 항염증, 항산화, 항암, 항당뇨, 간 손상 보호 효과 등이 보고되었으며, ⁸⁾ 콜라겐 유발 인간 혈소판 응집에 대한 steppotenin과 isoderone의 억제 효과가 보고 되었다.^{9, 10)} 따라서 우리는 C. tricuspidata에 포함된 다양한 xanthones중 Euchrestaflavanone B (EFB)를 사용하여 항 혈소판효과와 억제기전을 규명하였다.

재료 및 방법

실험재료

Euchrestaflavanone B(EFB)은 ChemFaces에서 구입하였다(Wuhan, China), collagen은 Chrono-Log 사(Havertown, PA, USA)에서, Lactate dehydrogenase cytotoxicity assay kit, U46619, Thromboxane B₂(TXB₂) cyclic adenosine monophosphate(cAMP) kit와 cyclic guanosine monophosphate(cGMP) kit는 Cayman Chemical 사(Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입하였다. 그 밖의 시약들은 Sigma Aldrich 사(Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Western blotting용 antibody들과 lysis buffer는 Cell Signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하였고, Polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane와 Enhanced chemiluminesence solution(ECL)는 GE Healthcare(Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다. Fibrinogen Alexa Fluor 488-conjugate는 Invitrogen Molecular Probes(Eugene, OR, USA)에서 구입하였다.

사람 세척혈소판

Acid-citrate-dextrose solution(0.8% citric acid, 2.2%sodium citrate, 2.45% glucose)로 항 응고처리 된 human platelet-rich plasma(PRP)를 한국적십자 혈액원(Suwon, Korea)으로부터 제공받았다. 미량의 적혈구를 제거하기 위해 PRP를 125g에서 10분간 원심분리 한 후, 1, 300g에서 10분간 원심 분리하여 platelet pellets을 얻었다. 이것을 washing buffer로 두 번 세척하고. 세척된 혈소판을 suspension buffer로 재구성하여 최종 10⁸/mL 농도가 되게하였다. 모든 과정은 낮은 온도에서 일어날 수 있는 혈소판 응집을 피하기 위하여 25°C에서 수행하였다. 이 실험은 The Korea National Institute for Bioethics Policy Public Institutional Review Board(Seoul, Korea)의 승인을 받아 수행되었다(P01-201812-31-007).

혈소판응집반응 측정

EFB는 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 0.1%의 최종농도로 사용하였다. 세척 혈소판(2.5×10⁸/mL)에 여러 농도의 EFB(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 응집을 유도하고 5분간 측정하였다. 응집은 1, 000 rpm stirring speed에서 aggregometer로 측정하였고(Chrono-Log, Havertown, PA, USA), 응집능은 빛 투과도의 증가된 정도로 산출하였다. Suspension buffer를 투과도 0%의 기준 값으로 사용하였다.

세포독성평가

세척 혈소판(2.5×10⁸/mL)에 여러 농도의 EFB(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37°C에서 5분간 전 처리한 후, 12, 000g로 15분간 원심 분리하여 세포 debris를 제거한 상층을 lactate dehydrogenase(LDH) cytotoxicity assay kit(Cayman Chemical)로 측정하였다. 0.1% Triton X- 100으로 혈소판을 완전히 용해한 값은 양성대조군으로 서 100%로 기준을 정하고 EFB의 값을 %로 제시하였다.

세포 내 Ca²⁺ 동원 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸/mL)에 5μM의 Fura 2-AM을 처리하고 37°C에서 60분간 전 처리하였다. 그 후 1, 300g에서 10분간 원심분리 하고 suspending buffer에 다시 부유하여 혈소판을 준비하였다. 세척 혈소판에 여러 농도의 EFB(50, 100, 150, 200μM)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5μg/mL collagen으로 자극하여 5분간 반응시켰으며 Grynkiewicz,¹¹⁾의 방법을 사용하여 spectrofluorometer(Hitachi F-2700, Tokyo, Japan)로 분석하였다.

Thromboxane A₂ 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸/mL)에 여러 농도의 EFB(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 5분간 응집반응을 수행하였다. 그 후 250 μL ice-cold 5mM EDTA와 0.2 mM indomethacin을 처리하여 TXA₂의 합성을 정지하였다. 이 후 TXB₂ ELISA kit(Cayman Chemical)를 사용하여 TXA₂의 안정 대사체인 TXB₂를 분석하였다.

Fibrinogen Binding 활성 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸/mL)에 여러 농도의 EFB(50, 100, 150, 200μM)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5μg/mL collagen으로 5분간 응집반응을 수행하였다. 그 후 250 μL ice-cold PBS(pH 7.4)와 10μL의 fibrinogen(alexa Fluor 488-conjugated)를 더한 후 4°C에서 60분간 전 처리하였다. 이 후 0.5% paraformaldehyde로 고정하고 flow cytometry(BD Biosciences, SanDiego, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

Western Blot을 이용한 인산화 분석

세척 혈소판(2.5×10⁸/mL)에 여러 농도의 EFB(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 5분간 응집반응을 수행하고 동량의 lysis buffer를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 혈소판 lysate는 BCA protein assay kit(Pierce Biotechnology, IL, USA)를 사용하여 단백질을 정량 한 후 8% SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

Cyclicnucleotides 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸/mL)에 여러 농도의 EFB(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 5분간 응집반응을 수행하였다. 그 후 1M HCl을 첨가하여 반응을 정지하고, cAMP ELISA kit를 사용하여 ELISA reader(TECAN, Salzburg, Austria)로 분석하였다.

통계분석

측정된 모든 실험결과들은 mean ± SD로 처리하여 analysis of variance(ANOVA)로 분석하였다. 그룹간의 평균에 유의적인 차이가 있을 경우, Newman-Keuls method로 비교하여 각 그룹 간에 표기하였다. p<0.05 일 때 유의적인 의미가 있는 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰

Euchrestaflavanone B가 혈소판 응집과 세포독성에 미치는 효과

C. tricuspidata 추출물은 최근 혈소판에 미치는 효과에 대한 연구 또한 최근에 수행되어 보고된 바 있다.¹²⁾ 따라서 본 연구에서는 C. tricuspidata 추출물 유래 성분인 EFB(Fig. 1)의 항 혈소판 효과와 그 억제기전을 명확히 규명하고자 하였다. EFB의 혈소판억제 활성을 확인하기 위하여, collagen을 agonist로 사용하였다. Collagen으로 유도한 인체 혈소판에 EFB(50, 100, 150, 200 μM)을 처리한 결과 농도 의존적인 억제양상을 확인하였다(Fig. 2A). EFB의 half maximal inhibitory concentration은 105.5 μM을 나타냈다(Fig. 2B). 혈소판에 대한 EFB의 세포 독성을 평가하기 위하여 lactate dehydrogenase(LDH) leakage를 수행하였다, 인체 혈소판에 EFB(50, 100, 150, 200 μM)를 처리하여 LDH leakage를 분석한 결과 유의성을 나타내지 않았다(Fig. 2C).

Fig. 1. Chemical structure of euchrestaflavanone B.

Fig. 2. Effects of euchrestaflavanone B on platelet aggregation and cytotoxicity. (A) Effect of euchrestaflavanone B on colla- gen-induced human platelet aggregation. (B) Half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) value of euchrestaflavanone B in collagen-induced human platelet aggregation. (C) Effect of euchrestaflavanone B on cytotoxicity. Platelet aggregation and cytotoxicity were carried out as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± stan- dard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus collagen-stim- ulated human platelets. NS, not significant.

Euchrestaflavanone B가 Ca²⁺ 동원과 Serotonin의 방출에 미치는 효과

Ca²⁺은 혈소판 활성에 필수적인 secondary messenger로 작용하게 때문에, EFB가 세포내 [Ca²⁺]_i의 조절에 미치는 영향을 확인하였다. Collagen으로 자극한 인체 혈소판의 Ca2+ 농도는 112.2±1.1nM에서 642.3±5.4nM로 강하게 증가하였고, EFB(50, 100, 150, 200μM)을 처리한 결과 농도 의존적인 억제양상을 나타냈다(Fig. 3A). 세포 내 Ca²⁺의 농도는 ER membrane에 존재하는 inositol-1, 4, 5-trisphosphate receptor type I(IP₃RI)의 인산화에 의해 조절되는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 EFB가 IP₃RI의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 EFB는 농도 의존적인 인산화의 증가를 나타냈다(Fig. 3B). 이 밖에도, 세포 내부의 증가된 Ca²⁺은 혈소판의 방출에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈소판의 δ-granule에 존재하는 serotonin을 분석하여, EFB가 억제한 세포 내 Ca²⁺농도가 방출에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, EFB(50, 100, 150, 200μM)처리한 혈소판은 collagen자극한 인체 혈소판에서 농도 의존적이 억제 효과를 나타냈다(Fig. 3C).

Fig. 3. Effects of euchrestaflavanone B on [Ca²⁺]_i mobilization, IP₃RI phosphorylation, and serotonin release (A) Effect of euchrestaflavanone B on collagen-induced [Ca²⁺]_i mobilization. (B) Effect of euchrestaflavanone B on collagen-induced IP₃RI (Ser¹⁷⁵⁶) phosphorylation. (C) Effects of euchrestaflavanone B on collagen-induced serotonin release. [Ca²⁺]_i mobilization, serotonin release and Western blot were performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets.

Euchrestaflavanone B가 Thromboxane A₂의 방출과 cPLA₂, p38의 인산화에 미치는 효과

다음으로, collagen으로 자극한 혈소판에 EFB(50, 100, 150, 200μM)를 처리하여 thromboxane A₂(TXA₂)의 합성에 미치는 영향을 평가하였다. Collagen으로 자극한 인체혈소판의 TXA₂ 생성량은 75.2±2.1nM로 강하게 증가하였고 EFB(50, 100, 150, 200μM)를 처리한 결과, 농도 의존적인 억제양상을 나타냈다(Fig. 4A). EFB가 억제하는 TXA₂ 생성에 대한 정확한 기전을 확인하기 위하여 TXA₂의 생성과 관련된 신호전달 분자인 cPLA₂의 활성을 분석하였다. cPLA₂는 세포질에 존재하다가 혈소판의 활성으로 증가된 Ca²⁺과 결합한 후 세포막으로 이동하고 이 후 Ser⁵⁰⁵위치가 인산화 되어 효소활성을 갖는다.¹³⁾ 그리고 cPLA₂는 세포막의 인지질을 가수분해하여 arachidonic acid를 세포질로 유리한다. 따라서, EFB가 TXA₂의 생성과 관련된 신호전달 분자인 cPLA2에 미치는 영향을 확인하기 위해서 cPLA₂의 인산화를 분석하였다. Collagen으로 자극한 인체 혈소판은 cPLA₂의 Ser⁵⁰⁵위치를 인산화시켰고, EFB는 농도 의존적인 억제 양상을 나타냈다(Fig. 4B). 이 밖에도, p38 mitogen-activated protein kinase(p38)는 인산화를 통해서 혈소판의 활성을 돕는 것으로 알려져있으며, cPLA₂의 Ser⁵⁰⁵위치를 인산화 하는 것으로 알려져있다.¹⁴⁾ Collagen으로 자극한 인체 혈소판은 p38을 인산화시켰지만, EFB에 의해 강하게 억제되었다(Fig. 4C). 따라서 EFB가 억제하는 TXA₂ 생성효과는 cPLA₂와 p38의 인산화 억제작용을 통한 효과임을 확인하였다.

Fig. 4. Effects of euchrestaflavanone B on TXA₂ generation and cPLA₂-, p38-phosphorylation. (A) Effects of euchrestaflavanone B on collagen-induced TXA₂ generation. (B) Effect of euchrestaflavanone B on collagen-induced cPLA₂ (Ser⁵⁰⁵) phosphorylation. (C) Effect of euchrestaflavanone B on collagen-induced p38 phosphorylation. Measurement of TXA2 generation and Western blot was performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets.

Euchrestaflavanone B가 fibrinogen binding과 VASP, 맛의 인산화에 미치는 효과

αIIb/β3는 혈소판 내부의 신 호전달 기전을 통해 발현되는 혈소판 막 integrin으로, 인접한 혈소판과 혈중 단백질인 fibrinogen을 매개로 결합하게 해주는 binding molecule이다. EFB가 αIIb/β3의 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 fibrinogen binding효과를 분석하였다. Collagen의 자극은 αIIb/β3와 fibrinogen과의 결합을 강하게 촉진시켰다(Fig. 5A), 하지만 EFB(50, 100, 150, 200μM)를 처리한 결과 농도 의존적인 억제활성이 나타났다(Fig. 5A, 5B). 혈소판의 αIIb/β3 활성과 관련 있는 조절인자로는 vasodilator stimulated phosphoprotein(VASP)가 잘 알려져 있다.¹⁴⁾ VASP는 인체 혈소판에서 αIIb/β3의 활성을 이끄는 단백질이지만, cyclic nucleotide인 cAMP와 cGMP에 의해서 Ser¹⁵⁷과 Ser²³⁹가 인산화 되어 αIIb/β3의 활성을 억제한다.^{15, 16)} 따라서, collagen으로 자극한 인체 혈소판에 EFB(50, 100, 150, 200μM)를 처리하여 VASP의 인산화를 분석한 결과, VASP Ser¹⁵⁷에서 인산화의 증가를 확인하였다(Fig. 5C). 이 밖에도, αIIb/β3의 활성을 조절하는 인자로 Akt(protein kinase B)가 잘 알려져 있으며, collagen의 자극에 의해 인산화 되고 혈소판의 활성을 돕는 작용을 한다.¹⁷⁾ 따라서, EFB가 Akt의 인산화에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 EFB(50, 100, 150, 200 μM)는 Akt의 인산화를 억제하였다(Fig. 5D).

Fig. 5. Effects of euchrestaflavanone B on fibrinogen binding and VASP-, Akt-phosphorylation (A) The flow cytometry histograms on fibrinogen binding. (B) Effect of euchrestaflavanone B on collagen-induced fibrinogen binding (%). (C) Effect of euchresta-flavanone B on collagen-induced VASP (Ser¹⁵⁷) phosphorylation. (D) Effect of euchrestaflavanone B on collagen-induced Akt(Ser⁴⁷³) phosphorylation. Measurement of fibrinogen binding and Western blot was carried out as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets.

Euchrestaflavanone B가 Clot Retraction과 Cyclic Nucleotides에 미치는 효과

Cyclic adenosine monophosphate(cAMP)와 cyclic guanosine monophosphate(cGMP)는 혈소판 억제 분자로 잘 알려져 있다. 혈관 내피세포에서 분비되는 혈소판억제분자인 nitric oxide와 prostaglandin I₂는 순환하는 혈소판에 작용하여 cAMP 및 cGMP의 농도를 증가시킨다. 증가한 cAMP와 cGMP는 vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP)을 인산화 하여 αIIb/β3 활성을 억제한다.¹⁸⁾ 따라서, collagen으로 자극한 인체 혈소판에 EFB(50, 100, 150, 200μM)를 처리하여 cAMP와 cGMP의 농도를 분석한 결과, EFB는 cAMP와 cGMP의 농도를 증가시켰다(Fig. 6A, 6B).

Fig. 6. Effects of euchrestaflavanone B on cyclic nucleotides and clot retraction (A) Effect of euchrestaflavanone B on cAMP production. (B) Effect of euchrestaflavanone B on cGMP production. (C) Photographs of fibrin clot (D) Effects of euchrestaflavanone B on thrombin-retracted fibrin clot (%). Measurement of cAMP/cGMP, clot retraction was performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation(n=4). *p<0.05 versus the collagen-stimulated human platelets. ^#p<0.05 versus the unstimulated human PRP, ^†p<0.05 versus the thrombin-stimulated human PRP.

지혈부위의 자극을 받은 혈소판은 IIb/β3를 매개로 인접한 혈소판들과 지혈 마개를 형성하게 되고 이후 수축작용이 발생하여 지혈 부위를 견고하게 지탱해 준다. 이전 결과에서, EFB는 세포 내 Ca²⁺동원과 αIIb/β3의 활성을 억제하였으므로, 최종 혈전형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, thrombin을 사용한 clot retraction test를 수행하였다. 그 결과 EFB(50, 100, 150, 200 μM)는 농도 의존적으로 clot retraction반응을 억제하는 효과를 나타냈다(Fig. 6A). EFB가 억제하는 clot retraction의 결과는 EFB가 증가시킨 cAMP와 cGMP의 결과로 사료되며, cAMP와 cGMP dependent kinase인 protein kinase A, protein kinase G의 substrate인 IP₃RI와 VASP의 인산화 결과에서도 알 수 있다. EFB는 IP₃RI와 VASP를 인산화 시켜 세포 내 Ca²⁺동원과 αIIb/β3의 활성을 억제하였고 따라서, 이러한 효과는 EFB가 증가시킨 cyclic nucleotides의 효과임을 확인하였다.

결론

Euchrestaflavanone B(EFB)은 collagen이 유도한 platelet aggregation을 강력하게 억제하였고, 세포내 Ca²⁺동원과 TXA₂의 형성, 그리고 αIIb/β3의 활성을 억제하였다. 이 결과들은 이와 관련된 신호전달 분자인 IP₃RI, cPLA₂, p38, VASP(Ser¹⁵⁷) 및 Akt의 인산화 조절을 통해서 발생한 다는 것을 확인하였고, cAMP와 cGMP의 증가로 인한 αIIb/β3의 비활성화는 clot retraction효과를 저해하여 항 혈전효과를 나타냈다. 이전 실험에서 효과를 확인한 steppogenin과 isoderrone과는 유사한 억제효과를 나타냈지만 세부적인 신호전달기전에서 차이점을 나타냈다. Steppogenin은 ERK의 인산화를 억제하여 Ca²⁺ influ x에 영향을 미쳤지만, EFB는 효과를 나타내지 않았고, EFB는 Akt의 인산화를 억제하여 steppogenin 및 isoderrone보다 강한 αIIb/β3 저해활성을 나타냈다. 그 결과로 fibrinogen binding assay와 clot retraction결과를 도출할 수 있었다. 따라서, EFB는 C. tricuspidata 유래 성분 중에서도 platelet aggregation과 thrombus formation에 강한 억제효과를 나타내는 물질로 치료 및 예방약물로서 잠재적 가치가 있다고 여겨진다.