Evaluation of Diacylglycerol as an Alternative to Dietary Fish Oil in Diets for Juvenile Olive Flounder Paralichthys olivaceus

넙치(Paralichthys olivaceus) 사료 내 어유(Fish oil) 대체원으로써의 diacylglycerol 이용성 평가

Abstract

The objective of this study was to investigate the utilization of diacylglycerol (DAG) as a new dietary ingredient replacing fish oil in feed for juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus. Fish oil based control diet (CON) was prepared and four other diets were formulated by replacing 50% of the fish oil in CON with one of five DAG: DAGL (1,3-lauryl glycerol) or DAGP (1,3-palmityl glycerol) in low or high concentrations (designated as DAGLL, DAGLH, DAGPL and DAGPH). Another diet was prepared replacing 100% of the fish oil in CON with a 1:1 mixture (DAGLP) of DAGL and DAGP. Olive flounder (13.4 g) were fed to apparent satiation, twice a day, for 12 weeks. Following the feeding trials, no significant differences were observed in growth performance, blood parameters and non-specific immune responses between CON and any of the DAG groups. Polyunsaturated fatty acid levels were not significantly affected by the inclusion of DAGs. Thus, DAGL or DAGP could be used to replace up to 50% of fish oil in fish feed without reducing growth performance, health or innate immunity. The replacement of up to 100% of dietary fish oil in olive flounder feed by DAGLP is also feasible.

서 론

세계 수산양식 산업은 지속적으로 성장하고 있으며, 이미 전 세계 수산물 소비량의 절반 이상을 차지하고 있다(FAO 2016). 양식 생산에 있어 사료는 60% 이상의 비중을 차지하는 중요한 요소이며, 그 수요는 수산양식 산업의 발전 속도 보다 빠르게 증가될 것으로 예상된다(Tacon and Metian, 2015). 어유는풍부한 필수지방산과 에너지를 가진 지질원으로서 양어사료에 널리 사용되고 있으며(Hertrampf and Piedad-Pascual, 2002),값비싼 단백질을 대체하기 위한 에너지원으로 이용된다. 특히DHA, EPA는 해산 어류의 성장과 사료효율에 직접적으로 영향을 미치는 필수 지방산이며, 면역기능 증강과 생리활성을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(NRC, 2011). 하지만 최근 환경오염과 기후변화에 의한 어획량 감소로 인해 어분 및 어유의 생산과 공급이 불안정해지고 있으며, 가격 또한 상승하고 있다. 지속 가능한 어유 대체원료의 발굴은 향후 수산양식 산업 발전의 필수 요소로 간주된다(Tacon and Metian, 2008). 식물성 유지를 이용한 어유 대체효과는 유지의 종류, 지방산 조성, 어종 및 성장단계에 따라 상이하게 나타난다(Emery et al., 2016). 대표적인 어유 대체원료인 대두유의 경우, 해산 어류의 사료 내 어유를 50%이상 대체할 수 있는 것으로 보고되고 있다(Izquierdo et al., 2005; Martínez-Llorens et al., 2007; Piedecausa et al., 2007; Peng et al., 2008). Diacylglycerol (DAG)은 두개의 지방산 사슬이 결합된 화합물로서 유화제 역할을 하는 식품첨가물로 주로 사용되며, 인위적으로 합성하여 생산된다(Jiao et al., 2019). 일반적으로 지질은 triacylglycerol (TAG) 형태(93-98%)로 섭취되며, lipase에 의해 2-monoacylglycerol (2-MAG)과 두 개의 지방산으로 분해되어 소장 융모를 통해 흡수된다(Birari and Bhutani, 2007). 흡수된 분해물은 중성지방형태로 재구성된 후 phospholipid 및 cholesterol과 결합하여 lipoprotein의 일종인 chylomicron 상태로 혈중으로 방출된다(Bach and Babyan, 1982). 반면 DAG의 약 70%를 차지하는 1, 3-DAG는 lipase에 의해 1- 또는 3-MAG로 분해되어 융모로흡수되며, 이때 TAG의 재구성은 2-MAG 없이는 쉽게 이루어지지 않는다(Ijiri et al., 2006; Takase, 2007). 따라서 혈중 지방산과 재결합하지 않고 간에 저장되는 대신 분해되어 에너지원으로 사용되는 특성을 가진다. 현재까지 양식사료 분야에서의 DAG와 관련된 연구는 전무한 실정이다.

넙치는 우리나라에서 가장 많이 생산되는 해산 양식 어종이다. 2018년도 넙치 생산량은 37,238톤으로 전체 양식생산량의 약 46.2%를 차지하고 있으며, 이 중 약 59.5%인 22,169톤이 제주도에서 생산되고 있다(KOSIS, 2018). 넙치는 육상수조식 양식장에서 유수식 시스템을 이용하여 양식되고 있으며, 양식에 사용되는 사료의 약 85%가 생사료 형태로 공급되고 있는 실정이다(KOSIS, 2018). 조만간 국내에서도 전면 배합사료로의 전환이 실현될 경우, 양어용 배합사료 사용량은 매우 큰 폭으로 상승할 것으로 예상된다. 양어사료의 품질과 가격 안정화는 물론, 지속가능한 양식산업을 위해서는 어분 대체원료뿐만 아니라 새로운 어유 대체원료 개발이 시급한 실정이다. 따라서, 이 연구는 우리나라 주요 양식 어종인 넙치를 대상으로 새로운 원료 소재인 합성 DAG (1,3-lauriyl-glycerol or 1,3-palmityl-glycerol)의 어유 대체 가능성을 평가하기 위해 수행되었다.

 

재료 및 방법

실험사료

실험에 사용된 DAG는 ㈜시너젠에서 제공되었다. 사료공급실험은 총 4종류의 DAG (DAGLL, 저순도 1,3-lauryl glycerol; DAGLH, 고순도 1,3-lauryl glycerol; DAGPL, 저순도 1,3-pal-mityl glycerol; DAGPH, 고순도 1,3-palmityl glycerol)를 사용하여 진행하였다. 사료공급실험 디자인은 어유가 첨가된 대조구(CON)와 4종류의 DAG로 대조구의 어유를 각각 50% 대체한 4개의 실험구(DAGLL, DAGLH, DAGPL, DAGPH)와 DAGLL과 DAGPL을 1:1 (v:v)로 혼합하여 대조구 어유를 100% 대체한 1개의 실험구(DAGLP)로 총 6가지가 설정되었다. 실험사료 제작에 사용된 사료 조성표와 실험사료의 일반성분 및 지방산조성은 Table 1, 2에 나타내었다. 실험사료는 우선 사료원료들을 혼합기에 넣어 완전히 섞은 다음, 어유와 DAG를 첨가하였다. 고체상태의 DAG는 비커에 옮겨 약 60°C의 증류수에서 중탕하여 액체 형태로 만들어 첨가하였다. 그 후, 사료 원료 총량의 30%에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기로 혼합, 반죽하였다. 혼합, 반죽물은 소형 초파기(SMC-12, Kuposlice, Busan, Korea)를 이용하여 알맞은 크기로 성형하였다. 실험사료는 12 h동안 건조기에서 25°C로 건조시킨 후, 사료공급 전까지 -20°C에 보관하면서 사용하였다.

 

Table 1. Dietary formulation and proximate composition of the experimental diets for juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus

 

Table 2. Fatty acid composition of the experimental diets (% total fatty acids) Fatty acid

 

실험어 및 사육관리

실험에 사용된 넙치 치어는 제주도 내 종묘배양장에서 구입하여 제주대학교 해양과학연구소로 운송되었다. 실험어류는 2주 동안 시판 배합사료를 공급하면서 실험 환경에 적응할 수 있도록 순치 되었다. 예비사육 후 넙치(초기평균무게, 13.4± 0.1g)는 총 18개의 150 L 원형 PP수조에 각 수조 당 40마리씩 무작위로 배치되었다. 사육수는 모래여과해수를 사용하여 2-3 L/min의 유수량이 공급되도록 조절하였고, 모든 실험수조에 용존산소 유지를 위하여 에어스톤을 설치하였다. 사육수온은 자연수온(15-21° C)에 의존하였으며 광주기는 형광등을 이용하여 12 h light/12 h dark로 유지되었다. 실험사료 공급은 1일 2회(08:00, 18:00) 만복공급을 하였으며 사료공급실험은 총 12주간 진행되었다.

어체 측정 및 혈액 분석

사료공급실험 종료 후, 실험어의 무게, 개체 수, 사료공급량을 조사하여 증체율, 일간성장률, 사료전환효율, 단백질이용효율, 사료섭취량을 산출하였다. 최종무게 측정 후, 수조당 6마리의 어류를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol (200 ppm)용액으로 마취 시킨 후 6마리 중 3마리에서 헤파린 처리된 주사기를 이용하여 꼬리 미병부에서 채혈을 하였다. 채혈된 전혈은 hematocrit, hemoglobin 및 대식세포활성(nitrobluetetrazolium, NBT) 분석에 이용되었다. 분석 후, 남은 혈액은 alanineaminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) 분석을 위해 원심분리기를 이용하여 5,000 g로 10분간 원심분리 후, 혈장(plasma)을 분리하였다. 나머지 3마리 어류의 혈액은헤파린이 처리되지 않은 주사기를 이용하여 채혈되었으며 채혈된 전혈은 상온에서 60분 방치시킨 후 원심분리기로(5,000g) 혈청을 분리하여 면역관련 분석에 사용되었다. Hematocrit은 microhematocrit technique 방법으로 분석하였으며, hemoglobin, AST, ALT 함량은 자동 생화학 분석기(Express plus system, Bayer, USA)를 이용하여 측정하였다. 대식세포 활성(NBT)은 Anderson and Siwicki (1995)의 방법을 기초로 분석되었다. 혈청 내 MPO 활성은 Kumari and Sahoo (2005)의 방법으로 그리고 lysozyme 활성은 Hultmark et al. (1980)의 방법을 기초로 분석되었다.

일반성분 및 지방산 분석

실험사료의 일반성분분석은 AOAC (1995) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(125°C, 3 h), 조회분은 직접회화법(550 °C, 6 h), 조단백질은 자동조단백질분석기(Kejltec system 2300, Sweden)로 분석하였으며, 지방은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 Soxhlet 추출장치(Soxhlet heater system C-SH6, Korea)를 이용하여 분석하였다. 실험사료와 전어체에서의 지방산 분석은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 지방을 추출하여 Metcalfe and Schmitz (1961) 방법으로 methylation한 후 gaschromatography (Agilent technologies, 6890N, USA)를 이용하여 분석하였다.

통계학적 분석

실험사료의 배치는 완전확률계획법(Completely randomized design)을 실시하고, 성장 및 분석결과는 SPSS (Version 12.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석된다. 데이터 값의 유의차는 Tukey's test (P≤0.05)로 비교되었다. 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었다. 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석하였다.

 

결과 및 고찰

성장 관련 결과는 Table 3에 나타내었다. 생존율은 모든 실험구에서 85% 이상의 양호한 생존율을 보여 사육환경 및 질병 등의 외부적 영향 없이 사료공급실험이 원활히 진행된 것을 확인할 수 있었다. 증체율, 일간성장률, 사료전환효율, 단백질이용효율 분석결과, DAG로 어유를 50% 대체한 DAGLL, DAGLH, DAGPL, DAGPH 실험구와 대조구간에 유의적인 차이가 없었으며, 어유를 100% 대체한 DAGLP 실험구도 대조구와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 모든 실험구에서 넙치의 성장과 사료효율에 차이가 없었던 것은 실험사료의 필수지방산 함량이 넙치의 요구량에 충족되었기 때문인 것으로 판단된다(Kim and Lee, 2019). 넙치의 필수지방산(n-3 HUFA) 요구량은 0.8-1.4%로 알려져 있으며(NRC 2011), 다른 어종을 대상으로 한 연구에서도 필수지방산 요구량이 충족된 사료 공급시 사료 내 지질의 종류가 성장과 사료계수에 영향을 주지 않는 것으로 보고되었다(Bell et al., 2003; Peiedecausa et al., 2007;Aminikhoei et al., 2013). 사료 내 필수지방산 함량이 대상어종의 요구량을 충족할 경우, 경제적인 배합사료 제조를 위해 상대적으로 저렴한 지질 원료들을 사용하여도 무방할 것으로 판단된다(Kim and Lee 2019).

 

Table 3. Growth performance of juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus (mean initial body weight 13.4±0.1 g) fed the six experimental
diets for 12 weeks

 

혈액분석 결과는 Table 4에 나타내었다. Hematocit은 21.6-25.4%, hemogloibin은 1.44-2.06g/dL, AST는 38.7-46.3 U/L, ALT는 10.1-12.0 U/L로 나타났으며, 모든 실험구 간에 유의적인 차이가 없었다. Hematocrit은 혈액 내 적혈구가 차지하는 비중을 백분율로 나타낸 것으로 hemoglobin, AST, ALT와 함께 어류의 일반적인 건강도를 가늠하는 간접 지표로 사용된다(Kristoffersson et al., 1974). 혈액 내 AST와 ALT는 체내 아미노산의 대사에 관여하는 효소로써, 어류의 간 또는 심장이 손상을 입을 경우 혈중으로 방출되어 수치가 증가하게 된다. 혈액분석 결과, 모든 실험구 간에 유의적인 차이가 없는 것으로 보아DAG를 이용한 어유 대체에 따른 넙치의 건강에도 아무런 이상이 없을 것으로 판단된다.

 

Table 4. Blood parameters of juvenile olive founder Paralichthys olivaceus fed the six experimental diets for 12 weeks

 

비특이적 면역분석 결과는 Table 5에 나타내었다. NBT activity는 0.60-0.68, MPO는 1.07-1.47, lysozyme은 54.7-72.0 μg/mL로 나타났으며, 마찬가지로 모든 실험구 간에 유의적인 차이가 없었다. NBT activity는 호중구의 호흡폭발동안의 oxidative radical 생성량을 측정하여 대식세포의 활성을 확인하는 방법이다(Kumari and Sahoo, 2005). MPO는 과산화효소로써 hypochlorous acid를 만들어 병원체를 사멸시키는 기능을 하며, lysozyme은 세균 세포벽의 peptideglycan의 β-1,4-glucoside 결합을 가수분해하여 세균의 세포벽을 파괴하는 기능을 한다(Kim et al., 2011). 비특이적 면역분석 결과, 모든 실험구 간에 유의적인 차이가 없는 것으로 보아 DAG를 이용한 어유 대체에 따른 비특이적 면역에도 전혀 이상이 없을 것으로 사료된다.

 

Table 5. Non-specific immune responses of juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus fed the six experimental diets for 12 weeks

 

전어체 지방산 분석결과는 Table 6에 나타내었다. 1,3-lauryl glycerol이 첨가된 DAGLL, DAGLH, DAGLP 실험구에서 lauric acid가 축척된 것을 확인할 수 있었다. Lauric acid는 12개의 탄소 축을 가진 포화 중쇄지방산(medium-chain fatty acid)으로 다양한 세균에 항균 효과를 갖는 것으로 보고되고 있다(Jensen, 2002; Nair et al., 2004a, 2004b; Thormar et al., 2006; Park et al., 2007). Lauric acid의 항균 활성 기작은 세균의 전자전달계와 인산화 작용을 방해함으로서 에너지 생성을 저해시켜 세균을 사멸시키는 것으로 추정되고 있다(Wieckowski and Wojtczak, 1998; Desbois and Smith, 2010). DAGLL, DAGLH, DAGLP 실험어의 체내에서 lauric acid가 축척된 것으로 보아 세균성 질병에 대한 저항 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되며, 이와 관련된 추가 연구가 요구된다. DHA, EPA, 고도불포화지방산(PUFA) 함량은 DAG가 첨가된 실험구가 대조구에 비해 다소 감소하는 경향을 보였으나, 실험구 간에 유의적인 차이는 없었다. 이러한 결과는 사료 내 DHA, EPA, 고도불포화지방산 함량과 유사한 경향을 나타낸다. 일반적으로 어체 지방산 조성은 공급되는 사료의 지방산 조성에 영향을 받으며, 이는 여러 어종을 대상으로 선행된 연구를 통해 알려져 있다(Montero et al., 2005; Martínez-Llorens et al., 2007;Fountoulaki et al., 2009). 또한 대상 어종의 필수지방산 요구량이 충족된 사료를 섭취한 어류의 일반성분은 사료의 지질원에 영향을 받지 않는다고 보고되고 있다(Ng et al., 2003; Kim et al., 2010; Aminikhoei et al., 2013).

 

Table 6. Fatty acid composition (% of total fatty acids) of the whole body in juvenile olive founder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 12 weeks

 

따라서 DAG는 넙치 배합사료 내 6% 가량의 어유를 100%까지 대체할 수 있으며, 이러한 대체 수준은 넙치의 일반적인 건강도, 면역활성 및 필수 지방산 대사에 악 영향을 전혀 미치지 않는 것으로 판단된다. 추후 DAG의 대사 특성을 고려한 단백질절약 효과 및 DAG에 함유된 lauric acid의 질병 저항 효과에 관한 연구가 추가적으로 요구된다.

 

사 사

이 연구는 ㈜시너젠의 연구비 지원으로 수행된 연구이며 연구비 지원에 감사드립니다.