Anti-obesity Effect of Vegetable Formula on Obese Mice in High Fat Diet

고지방식이 비만 마우스에 대한 야채 조성물의 항비만 효과

Abstract

This study was conducted to investigate the cholesterol and Triglyceride (TG) lowering and anti-obesity effects of water extract of vegetable formula (onion 25%, carrot 20%, Cabbage 20%, Sweet Pumpkins 20%, Chinese plum 5%, turmeric 5%, morus leaves 5%, SLS) in mice fed high fat-diet. ICR mice were divided into 3 groups; a normal diet group (ND), a high-fat diet group (HFD), a high-fat diet and SLS with 300 mg/kg treated group (HFD+SLS). Body fat gain was increased by high-fat diet and HFD+SLS group showed a definite weight loss. The total cholesterol level in the HFD+SLS group was 328.4 mg/dl which was 27.4% lower than that in the HFD group and the cholesterol-lowering effect of SLS was confirmed. The HFD + SLS group showed 118.1 mg/dl and the triglyceride level in the serum was decreased by 88.7% compared to the HFD group and SLS significantly decreased blood triglyceride levels. RT-PCR showed that the expression of PPAR-${\gamma}$ and the target gene SCD-1 was inhibited in a dose-dependent manner in the SLS-treated group. These results suggest that the SLS water extract may have a cholesterol and triglyceride-lowering effect and inhibit the expression of PPAR-${\gamma}$ and SCD-1 to have an anti-obesity effect.

비만은 과량의 에너지 섭취 또는 에너지 소비저하로 인한 열량대사의 불균형으로 대사성질환의 원인이 되고 있으며, 전 세계적으로 증가하는 추세다. 대사성 질환인 비만은 유전적, 영양학적인 요인과 환경적, 사회적 요인 등 다양한 원인들이 관여하며, 과도한 에너지섭취로 인해 대사활동 후 소비되고 남은 것이 지방조직에 중성지방으로 축적되어 발생하게 된다. 지방조직이 필요 이상으로 과도하게 축적되면 생리적 및 생화학적 기능에 영향을 미쳐 대사성 질환을 야기한다.^1,2) 혈중 지질농도의 증가와 체내 과도한 지방의 축적은 고혈압과 같은 심혈관 질환을 포함하여 당뇨병과 같은 대사성 질환을 유발하는 원인이 된다.³⁾ 피하조직에 축적된 복부비만은 당 및 지질대사에 장애를 초래하는 인슐린비의존형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증 등의 대사성질환의 발병을 유도하고 사망률을 증가시킨다고 보고되고 있다.⁴⁾ 현재 비만 치료를 위하여 생활습관을 교정하는 방법인 식이요법이나 운동요법, 행동요법과 약물치료 및 수술적 치료법 등이 시행되고 있으며,⁵⁾ 비만을 해결하기 위해 사용되는 식욕억제제와 지방 소화 억제제 등의 약물은 메스꺼움, 설사와 심혈관 질환 등 다양한 부작용을 유발하여 사용에 한계가 있다.^6,7) 비만은 고지방식이, 고탄수화물 등과 같은 식이습관과 관계가 깊은 질환으로, 채소와 과일 섭취와 관련된 역학조사들이 진행되어 왔으며,⁸⁾ 최근에는 메타분석을 활용한 연구에서 비만과 같은 대사증후군에 야채 섭취로 인한 심혈관 질환 및 대사성질환 억제를 보고하였다.⁹⁾ 특히 flavonoid 성분인 quercitrin, rutin성분을 함유 하고 양파(Allium cepa)는¹⁰⁾ 항산화 활성 및 항암작용 그리고 혈압강하 및 동맥경화 예방 등 인체에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보고되고 있으며¹¹⁾, 또한 황 화합물인 allyl propyldisulfide 및 diallyl disulfide와 같은 성분은 지방대사에 밀접한 관련이 있는 것으로 보고 되고 있다.¹²⁾

뽕잎(Morus alba)은 신농본초경(神農本草經)과 본초강목(本草綱目) 등에 다양한 효과가 기록되어 있으며,¹³⁾ 뽕잎의 성인병 예방 효과가 밝혀지면서 기능성 식품의 재료로서 각광받고 있다. 기능성 성분인 rutin, quercetin, isoquercitrin과 같은 flavonoid계 물질이 다량 함유되어 있어 중성지방이나 콜레스테롤 저하, 항고혈압, 항 당뇨 등 다양한 임상 효능을 지니고 있다.^14,15) 이에 본 연구는 일상에서 쉽게 섭취하는 양파, 당근, 양배추, 단호박, 매실, 강황, 뽕잎추출물로 이루어진 야채조성물을 고지방식이 비만 생쥐에게 투여한 후 비만 생쥐의 체중, 혈중 지질 농도의 변화와 지방분화 관련 유전자의 변화를 살펴보고 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다. 

 

재료 및 방법

 

실험재료

실험에 사용된 양파, 당근, 양배추, 단호박, 매실, 강황, 뽕잎은 유기농 원료를 시중에서 구입하여 세척 후 50°C 열풍 건조기에서 48시간 건조한 후 시료로 사용하였다.

추출 및 분획

각 재료 중 양파, 당근, 양배추, 단호박 각 200 g, 매실 100 g, 강황, 뽕잎 각 50 g을 정확히 칭량한 후 각 재료의 10배에 해당하는 정제수를 가하여 약 2시간 추출한 후 여과 및 감압 농축하여 야채조성물(slim line soup, SLS)를 얻어 이를 - 80°C 냉동 보관 후 시료로 사용하였다(Table I).

 

Table Ⅰ. Composition of SLS

 

Murine 3T3-L1의 Cell Viability Assay

3T3-L1 세포에 대한 SLS의 독성은 Desai등의 방법¹⁶⁾에 준하여 측정하였다. 이는 Mitochondrial Dehydrogenases에 의하여 MTS가 Formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로 96 well plate에 분화를 유도한 1.0×10₅ Cell/well의 3T3-L1을 분주하고 18시간 동안 배양한 후 SLS를 50 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/mL 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 20 ul 의 MTS Solution을 첨가한 후 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 4시간 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 

실험동물

실험동물은 생후 4주령 수컷 흰쥐(ICR mouse)를 ㈜ 오리엔트바이오(Sungnam, Korea)에서 구입하여 1주일동안 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물은 온도 20.5∼21.5℃, 상대습도 49.9∼54.2%, 환기 횟수 10∼15 회/시간, 조명시간 12시간(am 8시30분∼pm 8시30분), 조도 200∼300 Lux의 동물 사육실 에서 사육하였으며, 매일 환경을 점검하여 일정한 조건을 유지하였다. 시험기간 중 wirecage (500×300×200 mm, 대종기기)에 5마리씩 넣어 사육하였으며 사료와 음용수는 자유 급식 하였으며, 남부대학교 동물실험윤리 규정(승인번호 201408 )을 따랐다. 실험동물은 일반사료를 식이하는 정상식이군(ND; n=10), 65% 지방 함유사료를 식이하는 고지방식이군(HFD; n=10), 65% 지방 함유사료와 SLS투여군(HFD+SLS; n=10), 3군으로 구분하였으며 모두 5주 동안 실시하였다. SLS의 투여는 1일 1회 일정한 시간(pm 6:30)에 구강을 통해 투여하였다. 체중은 1주일 간격으로 디지털계량기를 사용하여 측정하였다. 본 실험에 사용한 고지방식이는 60%의 지방을 함유하는 D12492사료를 중앙실험동물(Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea)에서 구입하였으며 성분조성은 Table Ⅱ와 같다.

 

Table Ⅱ. Composition of high fat diet (HFD) 

 

채혈 및 조직 적출

채혈은 실험 종료 후 각각 에테르를 이용하여 마취한 후 복부 대정맥에서 채혈을 하였으며, 동시에 간 우엽의 일정한 부위를 적출 하였다. 혈액은 3,000 rpm으로 10분간 원심분리 하여 혈청을 분리하고 -80°C에 동결보존 후 사용하였다.

혈청 지질 함량 검사

분리한 혈청에서 총 콜레스테롤과 중성지방은 시판되는 주)아산제약의 총콜레스테롤 측정용 시액(AM 202-K, 아산제약)과 중성지방 측정용 시액 (AM 157S-K, 아산제약)을 이용하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 

간조직의 형태학적 관찰

실험동물에서 적출한 간 조직을 10% neutral buffered formalin을 사용하여 고정하고 탈수 후 파라핀 블록을 제작하여 두께 4 ㎛의 절편으로 제작하였다. 이후 xylene을 사용하여 파라핀을 제거시키고, 알코올로 친수화 시킨 다음 슬라이드를 만들고, hematoxylin & eosin(H&E)로 염색 후 광학현미경(Axiovert 135, Carl Zeiss, Germany)으로 x100에서 관찰하였다.

RNA 추출 및 RT-PCR

지방분화에 관여하는 전사인자인 peroxisome proliferator activated receptor-γ(PPAR-γ)와 표적유전자인 stearoyl-CoA desaturase-1(SCD-1)에 대한 SLS의 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 먼저 분화 유도된 3T3-L1세포를 60 mm dish에 4.0×10⁶cells이 되도록 분주하고 18시간 동안 배양하였다. SLS를 50 ug/mL, 500 ug/mL 전처리하고 LPS 10 ug/mL 처리 후 6시간 동안 배양하였다. 세포를 수거하여 4℃에서 2,000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 Easy Blue®시약(iNtRON Biotechnology, Korea)을 이용하여 Total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 QuantiTect® Reverse Transcription Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 cDNA 1 ㎍에  Primers (sense, anti-sense) 1 ㎕ 및 10 × buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 1 U Tag Polymerase를 혼합한 후 denaturation을 위해 94℃에서 45초, annealing을 위해 55∼60℃에서 45초 그리고 extension을 위해 72℃에서 60초 조건으로 30 cycles을 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조구로β-actin을 사용하였다. 이후 증폭된 DNA산물을 1.5% Agarose Gel를 사용하여 100 Volt에서 30 분간 전기 영동하여 UV에서 관찰하였다. 유전자 증폭을 위해 사용된 primer는 Table Ⅲ과 같다.

 

Table Ⅲ. Characteristics of specific primers used for RT-PCR analysis

 

통계처리

모든 실험 결과는 Sigma Plot(Ver. 8.0, SPSS Inc, USA)을 이용하여 분석하였으며, 분석결과는 mean±SE로 나타내었다. 대조군과 실험군의 차이를 검증하고자 t-test를 실시하였고, 집단 간 평균차 검증은 one-way ANOVA을 적용하였다.  각 분석 시 유의수준은 p<0.05인 경우 유의성을 인정하였다. 

 

결과 

Murine 3T3-L1의 Cell Viability Assay

3T3-L1 세포에 대한 SLS의 독성을 보기위해 Cell Viability Assay를 실시하였다. 그 결과 대조군은 101±8%, 50 ug/mL 104±3%, 250 ug/mL 102±7%, 500 ug/mL 99±8%로 모든 농도에서 3T3-L1 세포에 대한 SLS의 안전성을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

 

 

 

Fig. 1. Effects of SLS on the Cell Viability of 3T3-L1. 3T3-L1 were treated with SLS for 1hr. Cell viability was determined by MTS Assay. Result of three independent experiments were averaged mean value of three independent experiments (SD=bars) and are shown as percentage cell viability compared with the viability of untreated control cells.

 

흰쥐의 체중증가 억제 효과

5주 동안 일반사료를 식이한 ND군의 실험 시작 전 평균 체중은 33.2 g, 실험 종료 시 평균 체중은 41.4 g로 124% 증가 하였으며, 60% 지방 함유 사료를 식이한 HFD군의 시작체중은 32.4 g, 종료체중은 45.8 g로 141.3% 증가하였으며, 이는 ND군에 비하여 17.4% 증가 했으며, HFD+SLS군은 시작체중 32.5 g, 종료체중 38,8 g로 HFD군에 비하여 15.2% 체중감소가 있었으며, ND군에 비하여 6.3%가 감소되었다(Fig. 2,3). 

Fig. 2. Gross appearance of whole body ND : normal diet for 5 weeks; HFD : high fat diet for 5 weeks; HFD + SLS :high fat diet with slim line soup for 5 weeks

 

 

Fig. 3. Comparison of body weight changes between groups after 5 weeks of administration of ND, HFD,HFD+SLS. Data are shown as mean±standard errors of the mean(SEM)(n=10). *P＜0.05 vs. HFD. ND : normal diet for 5 weeks; HFD : high fat diet for 5 weeks; HFD + SLS :high fat diet with slim line soup for 5 weeks

 

흰쥐의 혈중 총 콜레스테롤에 대한 효과

5주 동안 일반사료를 식이한 ND군의 평균 혈중 총 콜레스테롤은 158.2 mg/㎗ 60% 지방 함유 사료를 식이한 HFD군의 평균 혈중 총 콜레스테롤은 452.5 mg/㎗ 286% 증가하였으며, HFD+SLS군의 평균 혈중 총 콜레스테롤은 328.4 mg/㎗로 HFD군에 비하여 27.4% 감소를 나타내었다(Fig. 4). 

 

Fig. 4.  Comparison of serum total cholesterol levels between groups after 5 weeks of administration of ND, HFD, HFD+SLS. Data are shown as means±SEM(n=10). *P＜0.05 vs. HFD. ND : normal diet for 5 weeks; HFD : high fat diet for 5 weeks; HFD + SLS :high fat diet with slim line soup for 5 weeks

 

중성지방 저하 효과

5주 동안 일반사료를 식이한 ND군의 평균 혈중 중성지방 수치는 160.6 mg/㎗, 60% 지방 함유 사료를 식이한 HFD군의 평균 혈중 중성지방 수치는 1048.7 mg/㎗로 653% 증가하였으며, HFD+SLS군의 평균 혈중 중성지방 수치는 118.1 mg/㎗로 HFD군에 비하여 88.7% 수치가 감소하였다(Fig. 5).

 

 

Fig. 5. Comparison of serum triglyceride levels between groups after 5 weeks of administration of ND, HFD, HFD+SLS. Data are shown as means±SEMn=10). *P＜0.05 vs. HFD group. ND : normal diet for 5 weeks; HFD : high fat diet for 5 weeks; HFD + SLS :high fat diet with slim line soup for 5 weeks

 

간 조직의 형태학적 관찰

간조직 슬라이드를 현미경(X100)으로 관찰한 결과 60% 지방 함유 사료를 식이한 HFD군은 약간의 지방간이 보였으나, HFD+SLS군의 간 조직에서는 간의 이상증후를 발견할 수 없었다(Fig. 6).

 

 

Fig. 6. Comparison of hepatic lipid accumulation between groups using H&E staining. ND : normal diet for 5 weeks; HFD : high fat diet for 5 weeks; HFD + SLS :high fat diet with slim line soup for 5 weeks

 

비만 유발 유전자의 발현 억제 효과

지방분화에 관여하는 전사인자인 peroxisome proliferator activated receptor-γ(PPAR-γ)와 표적유전자인 stearoryl-CoA desaturase-1(SCD-1)에 대한 SLS의 유전자 발현 억제 효과를 살펴보기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과, SLS를 처리한 군에서 농도 의존적으로 전사인자인 PPAR-γ와 표적유전자인 SCD-1의 발현이 억제되었다(Fig. 7).

 

 

Fig. 7. Inhibitory Effects of SLS on PPAR-γ, SCD-1 Expression in 3T3-L1. Results of the experiments were the mean values of three independent experiments and asterisks indicate the significant differences (* : p<0.05 compared to control). Quantification of PPAR-γ, SCD-1 mRNA expression was measured by densitometric analysis. The values were expressed as a percentage of maximal band intensity in culture treated with control. Data are Mean±S.E.M. of PPAR-γ / β-actin, SCD-1/ β-actin.

  

고찰

 

비만은 만성질환으로 개인의 삶의 질 저하와 사회경제적으로 비용    부담이 증가하고 있다. 또한 만성 대사성질환인 다양한 심혈관 질환과 당뇨 등의 합병증과 밀접한 상관관계가 있다. 비만은 과식, 잘못된 식습관, 운동부족, 인슐린 저항성 등 다양한 원인이 있으며 이를 해결하기 위해 다양한 약물을 사용하고 있다. 체중감량을 위해 장기간 사용이 허가된 지방분해효소제와 단기간 사용이 허가된 식욕억제제가 있으나 치료효과에 비해 부작용이 더 많아 사용에 어려움이 많다. 이에 일상에서 쉽게 섭취하는 양파, 당근, 양배추, 단호박, 매실, 강황, 뽕잎추출물로 이루어진 야채조성물을 고지방식이 비만 생쥐에게 투여한 후 비만 생쥐의 체중, 혈중 지질 농도의 변화와 지방분화 관련 유전자의 변화를 살펴보았다. 

  각 실험군별 체중의 변화를 살펴본 결과 60% 지방 함유 사료를 식이한 HFD군이 현저하게 체중이 증가함을 나타내었으나, HFD+SLS군은 체중증가를 유의하게 억제함을 알 수 있었다. 또한 각 식이 그룹별 체중의 변화가 유의하게 있었으며 외관상으로도 확연한 차이를 보여주었다. 혈중 지질 함량의 경우 5주 동안 일반사료를 식이한 ND군의 평균 혈중 총 콜레스테롤 수치보다 60% 지방 함유 사료를 식이한 HFD군의 평균 혈중 총 콜레스테롤은 증가하였으며, HFD+SLS군의 평균 혈중 총 콜레스테롤 수치는 60% 지방 함유 사료 식이한 HFD군에 비하여 혈중 총 콜레스테롤 수치가 유의하게 감소하여 SLS의 총 콜레스테롤 수치의 유의한 감소가 확인되었다. 또한 중성지방의 수치는 일반사료를 식이한 ND군의 평균 혈중 중성지방 수치와 60% 지방 함유 사료 식이한 HFD군의 평균 혈중 중성지방 수치보다 HFD+SLS군의 평균 혈중 중성지방 수치가 유의하게 감소하였고, 특히 일반사료를 식이한 ND군에 비해 HFD+SLS군의 혈중 중성지방 수치의 유의한 감소를 보여 주었다. 이는 SLS에 사용된 야채조성물들의 생리활성 물질들의 영향으로 사료되며 특히 양파는 체내 지방수준 저하에 효과적인 allyl propyl disulfide 및 diallyl disulfide 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며,¹⁷⁾ 페놀성화합물이 다량으로 함유되어 있다. 특히 높은 안토시아닌의 함량이 특징인 당근(Daucus carota L.)은 베타카로틴(β-carotene)이 풍부하며, 혈중지질 개선에 영향을 미치며 지방 세포에서 생성되는 adipokine의 일종인 leptin의 수치를 낮추는 것으로 보고되고 있다.¹⁸⁾ 양배추는 십자화과 재소로 혈중지질의 감소효과가 있다.¹⁹⁾ 고지방식이에 의하여 비만이 유도되면 비대해진 지방 세포는 인슐린으로 자극하여도 당 수송과 당대사가 저하되어 말초조직의 인슐린 저항성 및 고 인슐린혈증이 동반되며,^20,21) 고 인슐린혈증에 의해 HMG-CoA 환원효소가 활성화되어 고 콜레스테롤혈증이 발생된다.²²⁾ 또한, 높은 지방용해 활성에 의해 간으로의 유리지방산 유입을 증가시킨다. 유입된 유리지방산은 중성지방으로 에스테르화 되고,²³⁾ 이 결과 혈중 중성지방 농도가 증가하고, 고지혈증이 발생한다. 증가한 중성지방이 간으로 운반되면 지방간이 형성된다.²⁴⁾ 지방간의 형성과 간조직의 괴사 등의 변화를 보기위해 간 조직을 적출하여 간의 조직의 형태학적 변화를 관찰하였다. 60% 지방 함유 사료를 식이한 HFD군에서 지방간이 약간 나타났으나, HFD+SLS군의 간에서는 지방조직의 감소와 지방 침착 등의 소견을 확인할 수 없어 SLS의 간에 대한 안전성을 확인할 수 있었다.

  지방세포 분화시 많은 유전자가 관여하는데 대표적인 전사인자인 peroxisome proliferator activated receptor-γ(PPAR-γ)와 표적유전자인 stearoryl-CoA desaturase-1(SCD-1)에 대한 SLS의 유전자 발현 억제 효과를 살펴보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 60% 지방 함유 사료 식이한 HFD군은 PPAR-γ, SCD-1의 발현이 증가 되었으나 60% 지방 함유 사료 식이 HFD군과 SLS를 함께 투여한 군에서 전사인자인 PPAR-γ와 표적유전자인 SCD-1의 발현이 유의하게 억제되었다. 이 결과로  SLS를 투여한 비만 마우스의 체중과 혈중 지질의 농도 억제효과는 지방분화에 관여하는 전사인자와 표적유전자의 발현을 억제함으로서 지방 분화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었으며, SLS가 항비만 효과가 있음을 알 수 있었다

 

결론

 

본 연구는 양파, 당근, 양배추, 단호박, 매실, 강황, 뽕잎추출물로 구성된  SLS를 60% 고지방식이에 의해 비만이 유도된 마우스에 투여하고 체중변화, 총콜레스테롤, 중성지방, 비만관련유전자 발현 및 간조직의 지방세포의 변화를 관찰하였다. Murine 3T3-L1 세포에서 SLS는 세포독성을 보이지 않았으며, 고지방식이에 의해 증가된 체중, 혈청내 총 콜레스테롤, 중성지방의 증가를 유의하게 억제하였다. 또한 고지방식이에 의해 증가된 비만 관련 유전자인 PPAR-γ와 SCD-1의 발현을 유의하게 억제하였다. 이상의 결과로 본 연구에 사용된 야채조성 추출물인 SLS는 비만 관련 질환 예방 및 혈중 총콜레스테롤 및 중성지방 저하를 위한 건강식품으로 개발이 가능할 것으로 사료된다.