Bioactive effects of a Herbal Formula KDC16-2 Consisting Portulaca oleracea L. Extracts

마치현 추출물 함유 제제 KDC16-2의 생리 활성 효과

Abstract

Portulaca oleracea L. (PL) has been used in traditional medicine herb for treatment of various diseases, such as diarrhea, dysentery, and skin inflammation. Previous studies have shown that the PL regulates the inflammation by inhibition of pro-inflammatory cytokines. Although PL might have improvement effects of intestinal function and bioactive effects, there are not enough studies to demonstrate. This study investigated the effects of KDC16-2 on the improvement of intestinal function and anti-inflammatory effects in vivo and in vitro. The improvement effect of intestinal function was measured fecal amount, water content and intestinal transit rate in KDC16-2 treated ICR mice. As results, compared with the control group, the KDC16-2 group showed a significant increase in wet fecal weight, dry fecal weight and fecal water content. The intestinal transit rate of KDC16-2 group was significantly increased. Based on the results, KDC16-2 is considered to have effects on improving intestinal function. The effect of anti-inflammatory demonstrated by using dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis mice. The mice were administered 3% DSS along with KDC16-2 (100, 300 mg/kg) for 14 days. DSS-induced colitis mice were significantly ameliorated in KDC16-2 treated group, including body weight loss, colon length shortening, tight junction protein of colon and histological colon injury. The levels of inflammatory mediators (IgG2a, IgA, C-reactive protein and Myeloperoxidase) and pro-inflammatory cytokines (tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$, Interleukin (IL)-6) which are involved in inflammatory responses were increased in the DSS-treated group as compared to those in the control group, and the levels were significantly decreased in the KDC16-2 groups. In addition, we investigated the impact of KDC16-2 on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory responses in J774A.1 cells. KDC16-2 inhibited production of prostaglandin E2 (PGE2) and reactive oxygen species (ROS). These results suggested that the KDC16-2 could effectively alleviate the dysfunction of intestinal and inflammatory mediators. Thus, these KDC16-2 can be potentially used as health functional food of intestinal.

최근 경제발전과 함께 서구화된 생활과 음식이 도입되면서 현대인들은 식이섬유가 적고 당이 많으며 동물성 지방 함량이 높은 식단 섭취가 증가하였다.^1,2) 이러한 식생활의 변화로 배변활동 장애를 호소하는 인구가 증가하고, 장 관련 질환인 과민성 대장증후군, 장염, 대장암 등의 발병률이 증가하고 있다. 이런 배변활동 장애와 장 관련 질환을 예방하고 장의 건강을 증진시키기 위해 천연물 제제를 이용한 각종 기능성 식품 소재 및 약제의 개발이 활발하게 연구되고 있다.^3-5)

신체 소화기계의 하나인 장은 기본적인 기능인 소화, 흡수, 배설 이외에도 외부 물질, 항원, 미생물 등 혈류로 유입되는 외부요소로부터 방어하는 면역적인 기능을 한다.⁶⁾ 이러한 과정에서 장의 다양한 원인 혹은 유발인자의 노출은 장점막에 염증성 사이토카인 분비와 염증 매개 단백질의 발현을 증가시켜 염증 및 면역반응을 초래하고 비정상적으로 지속 증폭되어 만성적인 조직 손상을 일으킨다.^7,8) 또한, 장의 1차적인 면역체계로는 장 장벽을 가지고 있으며, 장벽은 여러 단백질로 구성되어 있는 밀착연접 단백질(tight junction protein)에 의해 단단함이 유지되는데 장 내에 유해물질에 의한 자극이나 손상이 가해지면 tight junction의 결합이 느슨해져 세포 사이에 틈이 생기게 되며 투과성이 증가되고방어 능력이 상실하게 된다.^8,9) 장 세포간 결합이 약화되어 투과성이 증가되면 그 틈으로 유해물질이 장내로 침투하게 되고 이는 염증으로 이어져 장 건강을 더욱 악화시키며, 오랜 기간 지속되는 만성적인 장관 염증 반응으로 인해 합병증이 유발될 수 있어 환자의 삶의 질을 떨어뜨린다.^10,11)

마치현(馬齒莧, Portulaca oleracea Linne)은 피자식물문쌍떡잎식물강 쇠비름과 쇠비름속에 속하는 한해살이풀로쇠비름, 돼지풀, 마치초 등으로도 불린다. 인도에서 기원한마치현은 전세계로 전파되어 우리나라에서도 자생하고 있으며 생육환경은 양지 혹은 반그늘의 언덕이나 편평한 곳에서 자란다.¹²⁾ 예로부터 마치현은 민간요법으로 사용되어 왔으며 갈증해소, 부기완화, 지사, 해열, 장염, 혈변, 설사 등의 치료에 쓰였고, ‘본초강목’과 ‘동의보감’ 등에는 충독및 사독 등의 해독제로도 사용되었으며, 아라비아 반도에서는 방부제, 항괴혈병제제, 진경제, 이뇨제, 구충제 등으로도 사용되었다. ^13,14) 마치현의 주요성분으로 syringaresinol, coumarin, flavonoids, L-noradrenaline, dopamine, dopa, 등을 포함하고, 그 외 organic acid, glutamic acid, aspartic acid, alanine, succinic acid 등을 함유한다고 알려져 있으며, 잎, 줄기 및 전초에는 γ-linolenic acid와 같은 ω-3계 지방산의 높은 함량과, 비타민 B1, B2 및 malic acid등의 영양 성분을 함유한다고 알려져 있고, 최근 연구에 의하면 창상 치유, 항염, 항산화, 항비만, 항바이러스 등에 효과가 있다고 보고된 바 있다.^15,16)

이와 같이 마치현의 여러 생리활성 효과들의 연구결과가 보고되었으나 마치현의 배변활동 개선 및 장 건강에 대한 효과는 보고된 바가 없었다.16) 따라서, 본 연구는 마치현을함유한 제제인 KDC16-2의 새로운 기능성 식품 개발 가능성을 배변활동 개선 동물 실험 및 대장 염증 유발 동물 실험과 대식세포를 이용한 생리활성 효과를 통해 확인하여 보고하고자 한다.

 

재료 및 방법

 

실험재료

본 실험에 사용한 마치현은 농업회사법인인(유)매화농장에서 재배되었으며, 2016년 10월에 생산, 채집된 마치현 시료는 한국생명공학연구원 노문철 박사의 감별을 거쳐 실험에 사용하였다. 표본(KRIB-KR2016-003)은 한국생명공학연구원 면역조절소재연구센터에 보관 중이다. 시료의 제조 −본 실험에 사용된 마치현 70% 주정(에탄올) 건조엑스(KDC16-2)는 GMP 인증기관인 (재)전남생물산업진흥원 식품산업연구센터에 의뢰하여 제조 생산하였다. 마치현 원재료는 스팀으로 열을 가한 후 건조하였으며, 건조된 마치현 100 kg은 중량대비 12-13배의 70% 주정을 첨가하고, 70oC에서 4시간동안 추출하였다. 이 추출물은 10 & micro;m필터로 여과하여 고형물을 제거하였으며, 45-55oC에서 10 brix 이상이 되도록 농축하였다. 이 농축액은 150 µm 백필터를 이용하여 여과한 후 덱스트린과 일정 비율(brix 기준 고형분 1:1)로 혼합하고 90oC에서 20분 동안 살균하였다. 살균된 혼합액은 100 µm 백필터를 이용하여 여과한 후 180-200oC 조건에서 분무건조(입자 60 mesh 이상) 및 여과망과자석봉을 이용한 이물질 제거 과정 진행 후 최종적으로 본 실험에 사용된 마치현 70% 주정 건조엑스(KDC16-2)로 25 kg을 얻어 사용하였다.

실험동물 및 사육조건

마우스는 4주령 된 수컷 ICR 마우스와 7주령 된 수컷 ICR 마우스(오리엔트 바이오 구입)를 사용하였으며, 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 SPF 동물 사육실에서 1주일 동안 적응 후 실험에 사용하였다. 실험을 위하여 마우스는 일정한 온도(23±3oC), 습도(55± 15%) 및 조사량(7:00시부터 19:00시까지) 조건하에서 사육하였다.

배변활동 개선실험 

4주령 된 수컷 ICR 마우스를 임의 배치에 의해 정상대조군(control), 60, 200 및 600 mg/kg 투여군(총 4군)으로 군당 5마리씩 나누어 실험하였다. 7일간KDC16-2를 용량별로 1일 1회 경구 투여한 후, 3일간 대사케이지에서 매일 1일 동안 배설되는 대변을 수집하였다. 실험동물의 배변활동 후 수집한 변의 습중량을 측정하고, 60oC 에서 24시간 건조시킨 후 건조중량을 측정하여 변의 수분함량을 계산하였으며, 변의 수분함량은 아래의 식을 통해 계산하여 그래프로 나타내었다.

수분함량(%) = (습중량 −건중량)/습중량 × 100

소화관 운동능 실험

4주령 된 수컷 ICR 마우스를 임의 배치에 의해 정상대조군(control), 60, 200 및 600 mg/kg 투여군(총 4군)으로 군당 5마리씩 나누어 실험하였고, 18일간KDC16-2를 용량별로 1일 1회 경구 투여한 후, 마우스 희생 전 16시간동안 마우스를 절식하였다. 소장의 운동능을 확인할 수 있는 10% 황산바륨을 10 mg/kg 농도로 경구 투여하여 30분간 관찰하였다. 30분 후 마우스를 희생한 후 위의 유문부에서 직장부까지 장을 적출하여 황산바륨의 최선단부를 측정하였으며, 소화관 운동능은 아래의 식에 따라 계산하여 그래프로 나타내었다.

소화관 이동률(%)=B/A×100

A: 소화관 전체 길이

B: 황산바륨의 최선단부까지 이동거리

Dextran Sodium Sulfate(DSS) 유도 대장 염증 동물실험

실험 시작 전 7일간의 적응기를 가진 7주령 된 수컷ICR 마우스를 이용하여 정상 대조군(control), 3% DSS 대장 염증 유발군, 염증성 대장염 치료제로 사용되고 있는 sulfasalazine(SUL, 50 mg/kg) 투여군, 100, 300 mg/kg KDC16-2 투여군(총 5군)으로 나누고, sulfasalazine 투여군과 KDC16-2 투여군은 3% DSS 음수 2일 전부터 DSS 음수 시작 후 14일 동안 sulfasalazine 50 mg/kg, KDC16-2 그룹은 100, 300 mg/kg의 용량으로 1일 1회 경구 투여하였다. 시험 기간 중에는 마우스 체중을 측정하였으며, 실험 종료 후에는 마우스를 희생한 후 장, 혈액을 채취하여 분석에 이용하였다.

효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)

대장 염증 유발 동물 모델에서 혈액 내 염증매개 인자의 분비 억제 효과를 확인하기 위하여, 시판중인 키트인 IgG2a(BD Biosciences, San Diego, CA, USA), IgA(Raybiotech, Norcross, GA, USA), Tumor necrosis factor(TNF)-α, Interleukin(IL)-6, C-reactive protein(CRP), Myeloperoxidase(MPO), prostaglandin E2 (PGE2) (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 농도를 산출하였다. 구체적으로, 항원이 부착되어 있는 웰에 채취한 혈청과 농도별로 희석한 표준시료를 200 µl를 넣어 방치하였고, 120분 후 세척액으로 3회 세척 후 1차 항체를 100 µl씩 첨가하였다. 잘 혼합하여 60분간 방치한 후 세척액으로 3회 세척한 후 2차 항체와 효소 시약을 섞은 혼합시약을 100 & micro; l씩 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 혼합물을 버리고 세척액으로 4회 세척 후 기질 용액을 100 µl씩 넣고 빛을 차단한 실온 상태에서 20분간 반응 후 정지시약(2N H2SO4)을 50 µl씩 넣어주어 반응을 정지하고, 450 nm에서의 흡광도를 microplate ELISA reader(Thermo Scientific, Waltham, MA)로 측정하였다.

조직병리 및 면역 염색

마우스 희생 후 장을 분리하여 일부를 고정액 4% 포름알데하이드에 고정시킨 뒤 파라핀으로 포매하고 박절한 다음 hematoxylin & eosin(H&E) 염색과 inducible nitric oxide synthase(iNOS), nuclear factor (NF)-κ B의 antibody(Cell signaling, Beverly, MA, USA)를 사용한 면역염색을 통하여 염색표본을 제작하여 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)

장조직 내의 유전자 발현을 측정하기 위해 마우스 희생 후, 조직 파쇄기를 이용하여 장조직을 분쇄하였고, RNA 분리 키트(RNA iso Plus reagent, Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 조직으로부터 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA의 흡광도를 측정하여 정량 한 후, 2 µg RNA로 cDNA 를 합성하였고, 각 튜브 당 2µl의 cDNA, 1 µl의 센스 및 안티센스 프라이머 용액(0.4 μM, Table I), 12.5 µl의 SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 및 9.5 & micro; l의 PCR-grade water를 함께 혼합하여 총 25 µl로 반응시켰다. 유전자의 발현 정도는 CFX96 touch(Bio-rad, Hercules, CA, USA) 소프트웨어를 사용해 측정하였다.

세포배양

마우스 대식세포인 J774A.1(ATCC® TIB-67™)세포는 10% non-heat-inactivated FBS와 1% penicillin- streptomycin이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle Medium, Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지에서 37oC, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다.

세포 내 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 측정

J774A.1 세포를 96웰 형광용 플레이트에 5×104 cells/ well로 분주 후, 활성산소종(ROS)을 염색할 수 있는 CM-H2DCFDA 형광시약을 5 μM 농도로 37oC에서 30분간 염색하였다. 염색 후 PBS로 세척하여 세포에 KDC16-2를 농도별로 1시간 전처리한 뒤 Lipopolysaccharide(LPS, 100 ng/ ml)로 자극하여 24시간 동안 배양하였고, 24시간 후 LPS에 의한 ROS 생성능 변화를 495 nm excitation, 525 nm emission 파장에서 형광분석기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)로 측정하여 분석하였다. 통계처리 −본 실험에서 얻은 결과를 3회 이상 반복 측정하여 평균(mean)±표준편차(SD)로 나타내었다. 또한 Prism5(GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 Student’s t-test로 분석하여 P<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다.

Table I. Real-time PCR primer sequence Name Forward(Sense) Reverse(Antisense)

 

결과 및 고찰

 

배변활동 개선 및 장 기능 개선에 미치는 영향

마치현추출물을 함유한 제제인 KDC16-2의 배변활동 개선 효과를 확인하기 위하여 변 중량 및 수분함량과 소화관 운동능을 확인하였다. 배변활동 개선 실험에서 변의 양이 많아지면장의 연동운동이 촉진되고, 배출시간이 감소함으로 배변활동이 개선되었음을 반영한다.³⁾ 따라서 본 실험에서는 실험동물의 배변활동 후 변을 채취하여 습중량을 측정하고, 24시간 동안 60oC에서 건조시킨 후 건조중량을 측정한 다음변의 수분함량을 계산하여 나타내었다(Fig. 1). 그 결과, KDC16-2를 투여한 군에서 변의 습중량과 건중량이 모두 60 mg/kg 투여군부터 농도 의존적으로 증가한 것을 확인하였고, 변의 수분 함량은 600 mg/kg 투여군에서 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 따라서 KDC16-2 투여군에서 농도 의존적으로 변의 습중량과 건중량, 수분함량이 증가하는 것을 확인하여 KDC16-2 섭취 시 배변활동 개선 효과가 있음을 실험적으로 증명하였다.

 

Fig. 1. Effect of KDC16-2 on fecal amount and water content. (A) Wet fecal weight (B) Dry fecal weight (C) Fecal water content. Data are expressed as the means ± SD of at least three independent experiments. *P < 0.05 compared to the control groups.

 

또한, 장내 연동은 장내 추진력 증가, 변의 이동시간 감소, 배변촉진 등을 일으켜 장 기능을 개선시키는 것으로 알려져 있으며⁵⁾ 이를 실험적으로 증명하기 위해 마우스를 이용하여 소화관 운동능을 측정하였다(Fig. 2). 소화관 운동능마우스 실험은 소화관 이동률에 대한 실험으로 마우스를 대조군과 실험군으로 나누고 대조군에는 생리식염수를 실험군에게는 KDC16-2를 60, 200, 600 mg/kg 농도로 18일간 1일 1회 경구 투여하였고, 소장의 운동능을 확인할 수 있는 10% 황산바륨(10 mg/kg)을 사용하여 위의 유문부에서 직장부까지 장을 적출하여 이동한 황산바륨의 최선단부를 측정하였다. 소화관 운동능 마우스 실험 결과, KDC16-2를 투여한 그룹에서 200 mg/kg 농도에서부터 농도 의존적으로 소화관 전체 길이가 길어지고, 소화관 이동률은 600 mg/kg 농도에서 유의적으로 증가하였다. 결론적으로, KDC16-2를 투여 시 농도 의존적으로 소화관 전체길이가 증가하고, 소화관 운동능도 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 KDC16-2가 장 기능 개선 효과가 있다고 판단된다.

 

Fig. 2. Effect of KDC16-2 on intestine length and intestinal transit rate. (A) Intestine length (B) Intestinal transit rate. Data are expressed as the means ± SD of at least three independent experiments. *P < 0.05 compared to the control groups.

 

대장 염증 유발 동물 실험에 미치는 영향

마치현 추출물을 함유한 제제인 KDC16-2의 동물 모델에서 효능 검증을 위해 가장 널리 사용되고 있는 DSS에 의한 대장 염증 유발 동물 모델을 사용하였다. DSS는 직접적으로 basal crypts의 장 상피세포에 독성을 가지며, 점막 장벽에 손상을 주어 염증성 대장염을 유도한다고 알려져 있다.⁷⁾ DSS에 의한 대장 염증 유발 동물 모델 실험 결과, DSS 유도에 의한 급격한 체중저하, 폐사 등의 임상증상이 KDC16-2의 100 mg/kg, 300 mg/kg 투여군에서 모두 완화되는 것을 확인하였고, DSS에 의해 줄어든 장 길이도 회복되는 것을 확인하였다. 또한, positive 약물로 사용된 sulfasalazine(SUL) 투여 군만큼 우수한 효능을 나타내었다(Fig. 3).

 

Fig. 3. Effect of KDC16-2 on change of body weight and colonic length in DSS-induced mice. (A) Change of body weight was measured during the experiment. (B) Representative photographs of colons from each group of mice compare the length of colon. (C) Change of colonic length was measured after the experiment. Data are expressed as the means ± SD of at least three inde- pendent experiments. *P < 0.05 compared to the DSS groups. CON: Control, DSS: Dextran sodium sulfate, SUL: Sulfasalazine.

 

DSS에 의한 대장 염증 유발 동물의 염증반응을 확인하기 위해 혈액 내 면역글로불린과 염증성 사이토카인의 분비량, C-Reactive Protein(CRP)과 Myeloperoxidase(MPO)의 활성 정도를 확인하였다(Fig. 4). ELISA를 통한 혈액 내 면역글로불린 분비량을 확인한 결과, DSS에 의해 증가한 혈중 IgG2a, IgA 농도가 KDC16-2 투여로 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α는 장조직의 호중구를 끌어 모으는데 중요한 역할을 하며, 육아종 형성 등을 통해 염증성 장질환의 기전에 관여한다.¹⁷⁾

 

Fig. 4. Effect of KDC16-2 on levels of inflammatory mediators in the serum. After the end of the experiment, blood was collected via cardiac puncture, and serum was isolated. Levels of inflammatory mediators as (A) IgG2a, (B) IgA, (C) TNF-α, (D) IL-6, (E) CRP and (F) MPO was assessed in serum using ELISA. Data are expressed as the means ± SD of at least three independent experiments. *P < 0.05 compared to the DSS groups. CON: Control, DSS: Dextran sodium sulfate, SUL: Sulfasalazine.

 

또한, IL-6는 염증성 장 질환에서 증가한다고 알려진 사이토카인으로 염증성 매개체로 작용하며 면역 세포를 활성화하는 등 장 내 염증 반응을 촉진한다고 알려져 있다.¹⁸⁾ 따라서, TNF-α와 IL-6의 분비량 변화에 의해 장 손상 개선 효과를 평가할 수 있다. 본 연구의 대장 염증 유발 동물 모델에서 TNF-α와 IL-6의 혈중 농도를 확인해 본 결과, 3% DSS에 의해 분비량이 증가되었다가 SUL 투여군 및 KDC16-2 투여군에서 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 체내 염증반응 여부를 확인할 수 있는 CRP와 MPO 활성 정도를 혈액에서 확인하기 위해 ELISA를 수행한 결과, DSS에 의해 증가된 CRP와 MPO의 활성이 KDC16-2 투여로 감소되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 KDC16-2는 면역글로불린, 염증성 사이토카인 분비를 감소시키고, CRP와 MPO 활성을 억제시켜 장관면역의 과도한 염증반응을 완화하는 효능이 있음을 검증하였다.

Fig. 5에 나타낸 것과 같이 DSS에 의한 대장 염증 유발 동물의 장조직 손상정도와 병변 확인을 위해 결장 조직을H&E 염색을 통해 확인한 결과, DSS 유발군에서 관찰되는 장 점막층 및 근육층의 염증세포 침윤, 장 융모 및 장샘 소실 등의 증상이 KDC16-2 투여군에서 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 장조직에서 발현되는 염증 관련 인자들을 면역염색을 통해 확인함으로써 염증반응의 정도를 평가하였다. 장조직 내 염증 관련 인자로서 NO를 생산하는 효소인 iNOS는 염증반응 동안에 대식세포의 세포기능을 조절하는데 주요한 역할을 하고, TNF-α, IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인의 자극에 의해서 증가되어 과도한 NO 생성을 통해 만성적인 염증반응을 유발한다고 알려져 있다.¹³⁾ 또한, 염증성 사이토카인 분비 시 전사인자로 작용하는 NF-κB는 세포 내 염증 관련 신호 전달 기전에 의해 활성화되어 핵 내의 target gene에 binding 하여 염증 관련 인자들을 생성한다. ¹⁹⁾ 따라서 장조직 내 iNOS와 NF-κB 활성을 지연시키는 것은 염증 반응을 억제함으로써 장 손상을 개선하는 데 효과가 있다고 판단할 수 있다. iNOS와 NF-κB 단백질 발현 정도를 마우스 장조직에서 면역염색을 통해 확인한 결과, DSS에 의해 증가한 iNOS와 NF-κB 단백질 발현 정도가 KDC16-2 투여로 감소하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 KDC16-2가 장조직 손상이나 병변 뿐만 아니라 iNOS와 NF-κB의 발현 억제로 장 기능 개선 효과와 장관면역의 과도한 염증반응을 완화하는 효능이 있음을 검증하였다.

 

Fig. 5. Effect of KDC16-2 on epithelial damage and expressions of iNOS and NF-κB in colon. After the experiment, paraffin sections of colon tissues were stained with hematoxylin and eosin. The colon tissue sections were stained with antibodies against iNOS and NF-κB. Representative histological features are shown. CON: Control, DSS: Dextran sodium sulfate, SUL: Sulfasalazine.

 

DSS에 의한 대장 염증 유발 시 점막 장벽 온전성 확인을 위해 밀착연접 단백질인 zonula occludens (ZO)-1, occludin및 장점막에서 분비되어 장 상피를 보호하는 기능을 가진점액물질인 뮤신을 암호화하는 MUC2의 유전자 발현을 장조직 내 유전자 발현 Real-time PCR을 통해 확인하였다(Fig. 6). DSS에 의한 대장 염증 유발 동물의 장조직 PCR 실험결과, DSS에 의해 감소되었던 밀착연접 단백질인 ZO-1, occludin 유전자와 뮤신 분비 유전자인 MUC2의 발현이 KDC16-2 투여군에서 유의적으로 증가하여 장벽 온전성이 회복되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 KDC16-2가 점막 장벽 기능을 향상시킬 수 있음을 증명하였다.

 

Fig. 6. Effect of KDC16-2 on expression of (A) ZO-1, (B) occludin and (C) MUC2 in colons. Expression levels of ZO-1, occludin and MUC2 were determined by PCR in colon tissue. Data are expressed as the means ± SD of at least three independent experiments. *P < 0.05 compared to the DSS groups. CON: Control, DSS: Dextran sodium sulfate, SUL: Sulfasalazine.

 

LPS에 의해 유도된 대식세포에서 ROS와 PEG2에 대한 영향

Fig. 7에서 나타낸 것과 같이 대식세포의 oxidative burst 확인 실험은 식균세포가 침입한 박테리아 등을 분해할 때 발생시키는 세포 내 활성산소종(ROS)를 측정하는 것으로 KDC16-2를 농도별로 1시간 전처리한 뒤 LPS(100 ng/ ml)로 자극하여 확인해 본 결과, LPS 자극에 의해 증가된 ROS가 KDC16-2 처리로 인해 농도 의존적으로 감소되며50 μg/ml 농도에서부터 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 대식세포와 같은 면역 세포가 활성화되어 사이토카인이 분비되면 프로스타글란딘 합성 효소군에 의해 prostaglandin E2(PGE2)가 생성되며, 이는 궤양성 대장염을 포함한 장의 염증 반응에 있어 장 점막 손상을 유발하는 물질로 알려져 있다.²⁰⁾ PGE2 분비능을 확인하기 위해 KDC16-2를 농도별로 1시간 전처리한 뒤 LPS(100 ng/ml)로 자극하여 확인해 본 결과, LPS 자극에 의해 증가된 PGE2가KDC16-2 처리에 의해 농도 의존적으로 감소되며 100 μg/ ml 농도에서는 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 KDC16-2가 산화적 스트레스 및 염증관련 효소 활성을 억제할 수 있음을 증명하였다.

 

Fig. 7. Effect of KDC16-2 on LPS induced-ROS and PEG2 production in macrophage. J774A.1 cells were treated with KDC16-2 for 1 hr and treated with LPS (100 ng/ml) for 24 hrs. Productions of inflammatory mediators such as (A) ROS and (B) PGE2 was determined by ELISA. Data are expressed as the means ± SD of at least three independent experiments. *P < 0.05 compared to the LPS-induced control.

결론

 

본 연구는 마치현 추출물을 함유한 제제인 KDC16-2의장 건강 관련 생리활성을 확인하기 위해 배변활동 개선 실험과 대장 염증 유발 동물 실험을 확인하였고, 마우스 대식세포를 이용한 LPS 유도 항염증 실험을 확인하였다. 그 결과, KDC16-2는 소화관 운동능을 증가시켜 장내 추진력 증가, 변의 이동시간 감소, 배변촉진 등 장내 연동을 촉진하여 변의 양 및 수분함량을 증가시켜 배변활동이 개선되었음을 확인하였다. 또한, 면역반응에 의해 증가한 대식세포의 ROS와 PGE2 분비를 감소시켰고, 장관 염증반응 시 증가한 면역글로불린과 염증성 사이토카인 분비, CRP, MPO, iNOS, NF-κB 등 인자들의 활성을 조절하여 염증반응을 억제하였으며, 밀착연접 단백질인 ZO-1, occludin과 뮤신 유전자 MUC2의 발현을 조절하여 점막 장벽 온전성을 유지함으로써 장기능 개선 효과를 가지는 것으로 사료되며, 장 건강 기능성 소재로써의 가능성이 충분하다고 판단된다.