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일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물의 RAW 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 iNOS 및 염증성 사이토카인 발현 저해를 통한 항염증 효과 비교

Anti-inflammatory effects of seed ethanolic extracts of the common buckwheat and tartary buckwheat are mediated through the suppression of inducible nitric oxide synthase and pro-inflammatory cytokines in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells

  • Kim, Su Jeong (Highland Agriculture Research Institute, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration) ;
  • Sohn, Hwang Bae (Highland Agriculture Research Institute, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration) ;
  • Lee, Kyung-Tae (Department of Pharmaceutical Biochemistry, College of Pharmacy, Kyung Hee University) ;
  • Shin, Ji-Sun (Department of Pharmaceutical Biochemistry, College of Pharmacy, Kyung Hee University) ;
  • Kim, Suyeon (Department of Pharmaceutical Biochemistry, College of Pharmacy, Kyung Hee University) ;
  • Nam, Jung Hwan (Highland Agriculture Research Institute, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration) ;
  • Hong, Su Young (Highland Agriculture Research Institute, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration) ;
  • Suh, Jong Taek (Highland Agriculture Research Institute, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration) ;
  • Chang, Dong Chil (Highland Agriculture Research Institute, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration) ;
  • Kim, Yul Ho (Highland Agriculture Research Institute, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration)
  • 투고 : 2019.09.25
  • 심사 : 2019.11.03
  • 발행 : 2019.12.31
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초록

메밀은 전 세계적으로 알곡, 싹, 차 등 다양한 형태로 이용되고 있으며, 주요재배종으로는 일반메밀과 쓴메밀이 있다. 본 연구는 일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물을 대상으로 항산화 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 루틴 함량은 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물보다 65-78배 높았으며, 퀘세틴은 쓴메밀 추출물에서만 검출되었다. 플라보노이드 및 폴리페놀 함량도 쓴메밀 추출물이 1.8-2.0배 높았다. 쓴메밀 추출물은 6.25-400 ㎍/mL 범위의 농도로 세포독성을 평가하였을 때 세포독성은 관찰되지 않았다. 또한, 세포 내 NO 생성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 염증성 NO 생성과 관련된 유전자 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과, 쓴메밀 추출물에서만 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 감소되었다. 염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNF-α와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성억제 효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성억제 효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다. 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인한 결과, 일반메밀과 쓴메밀 추출물에 의한 mRNA 발현이 감소되었으며, 쓴메밀 추출물의 억제효과가 더욱 우수하였다. 이러한 결과들을 고려하면 루틴 함량과 항염증 효과와는 밀접한 관계가 있으며, 루틴 함량이 높은 쓴메밀이 항염증 식의약 소재 개발에 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.

The ethanolic seed extracts of the common buckwheat (CB) and tartary buckwheat (TB) were examined for their anti-oxidant and anti-inflammatory effects on lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. In this study, it was observed that the rutin content of TB extracts was 65-78 times higher than the CB extracts, while quercetin was only detected in the TB extracts. In addition, TB extracts were observed to have 1.8-2.0 times higher flavonoid and polyphenolic content than the CB extracts. Cytotoxicity was not observed when both the buckwheat extracts were evaluated at concentrations in the range of 6.25-400 ㎍/mL. The treatment with TB extracts significantly suppressed the LPS-induced nitric oxide (NO) production and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression at the protein and mRNA levels. The TB extracts more potently inhibited the LPS-induced production of tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6 than the CB extracts. The mRNA levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 were also significantly inhibited both by the TB and CB extracts in a pattern similar to their production.

키워드

서 론

메밀은 마디풀과(Poygonaceae)에 속하는 일년생 식물로, 한국, 중국, 캐나다, 이탈리아 등 세계 여러 지역에서 재배되고 있는 식량 또는 경관용 작물이다. 메밀은 생육기간이 60-80일로 짧고 토양과 재배지역에 대한 적응성이 높아 작부체계상 유용한 작물로 활용되고 있다(Campbell, 1997; Kreft 등, 1994). 메밀의 대표적인 재배종으로는 일반메밀(단메밀, common buckwheat, sweet buckwheat, Fagopyrum esculentum Moench)과 쓴메밀(달단메밀, bitter buckwheat, tartary buckwheat, Fagopyrum tataricum L. Gaertn)이 있다(Kim과 Kim, 2018; Park, 2006). 일반메밀은 중국 윈난성 지역이 원산지로 작물 또는 밀원식물로 5세기 중엽 이전부터 오랫동안 재배되어 왔으며, 쓴메밀은 중국 쓰촨성, 티베트, 카슈미르와 파키스탄 북부 지역에서 야생종으로 주로 발견되며 재배역사도 비교적 짧다(Campbell, 1997).

메밀은 쓰임새가 다양하여 종실은 메밀가루 또는 국수로 이용되며, 어린순은 메밀싹으로 주로 메밀국수, 비빔밥, 메밀묵과 함께 요리된다(Kim 등, 2017a). 또한 껍질을 제거한 후 메밀쌀을로스팅한 후 차로도 이용된다(Yoon 등, 2006).

메밀의 종실에는 여러가지 생리활성을 나타내는 루틴(rutin), 퀘세틴(quercetin) 등의 플라보노이드 물질과 카테킨(catechins), 트리터페노이드(triterpenoids)과 같은 페놀화합류들이 존재하고 있다. 이러한 성분은 항산화(Kang, 2014; Kim 등 2007), 항당뇨(Lee 등, 2012), 위 질환 효능(Kim, 2016), 항진균 및 항균활성(Hwang 등, 2006), 고혈압 및 심혈관질환 개선(Park, 2006), 모세혈관 건강 향상(Jeong 등, 2011), 미백개선(Han 등, 2014), 비만 예방(Yoon 등, 2012), 항암 및 항염증(Yoon 등, 2012) 등에 효과가 있는 것으로 보고되었다.

주요 메밀 재배종인 일반메밀과 쓴메밀의 기능성 성분에 대한 비교 연구에서 쓴메밀의 총 페놀 함량은 일반메밀보다 약 2배, 플라보노이드의 함량은 약 2.7배 가량 높다고 하였다(Park, 2006), 일반메밀에 비해 특히 쓴메밀의 루틴 함량이 59배 정도 높다(Yoon 등, 2012).

루틴 성분은 quercetin-3-rutinoside 또는 sophorin이라 불리며 퀘세틴(quercetin)에 루티노스(rutinose)가 결합된 물질로서 강력한 항산화능, 항염증, 항암 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kang, 2015; Lee, 2008). 또한, 루틴은 알츠하이머를 유발시킨 마우스(mouse)에서 인지능력 향상에 도움을 주고 학습과 기억능력에도 긍정적인 영향을 주었다(Choi, 2013). 게다가 퀘세틴은 사람 구강암세포 성장을 억제시키는데 효과적이라고 보고되었다(Kim, 2011).

이미 잘 알려진 항산화물질로는 butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), tert-butylhydroquinone (TBHQ) 그리고 propylgallate (PG)와 같은 합성 항산화제와 폴리페놀, 플라보노이드, 카로티노이드, 아스코르브산, 토코페롤, 인지질 등의 천연 항산화제가 있으나(Lee 등, 2010; Kang 등, 2014), 최근에는 합성 항산화제의 사용을 기피하는 추세이며 이에 따라많은 연구자들은 안전성과 부작용에 대한 각종 질병의 예방 및 치료가 동시에 가능한 천연 항산화제 개발에 초점을 두고 연구가 이루어지고 있다(Halliwell 등, 1992; Lee 등, 2007; Lee 등, 2010). 천연 항산화제는 대부분 천연자원 유래의 항산화성 화합물로 줄기, 잎, 뿌리, 꽃, 열매, 씨앗 등의 많은 부분에 존재한다. 천연 항산화제는 주로 페놀화합물로서 free radical 및 활성산소종의 생성억제나 활성을 저해하여 항산화 물질로서의 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Kang 2012; Kim 등, 2001).

염증반응이란 외부로부터 물리적, 화학적 자극이나 세균 감염에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나로 손상된 조직을 재생시키는 기전이다(Willough by, 1975). 염증이 만성으로 진행되면 조직을 손상하여 암으로의 진행을 유도하게 된다(Kim 등, 2015). 염증반응에 관여하는 주요 세포는 대식세포(macrophage)로 알려져 있으며, 자극이나 면역세포가 분비하는 사이토카인(cytokine) 등에 의해 활성화되어, 염증성 사이토카인, NO, prostaglandin E2 (PGE2), histamine, serotonine, bradykinin, hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE) 및 leukotriene를 생성함으로써 통증, 부종 및 열 등의 염증을 유발한다(Lee 등, 2016). 염증반응의 조절에는 비정상적인 자극에 다양한 면역세포가 관여하지만, 그 중 대식세포는 monocyte의 형태로 모든 조직 내에 분포하고 있어, 이상 자극에 즉각적으로 반응함으로써 염증을 유도하고 확대시키는 중요한 역할을 담당한다. 기존 연구에서 대식세포는 염증 유발물질 LPS에 의해 iNOS/NO의 생성이 증가되고 염증성 cytokine인 TNF-α, IL-1& beta;,IL-6 분비가 증가된다고 보고 되었으며 세포내 신호전달 경로도 구명되었다(Hinz과 Brune 2002; Yi 등, 2008).

메밀은 한국에서 구황작물로 재배되었으며, 최근 막국수, 메밀전병, 메밀묵 등의 가공식품으로 이용되고 있다(Lee와 Seo, 2019). 한국은 경제성장 이후 식생활의 서구화로 인한 만성퇴행성 질환 발병률과 사망률 증가에 따른 건강식에 대한 요구로 메밀에 대한 생산과 소비가 증가되고 있다(Cui 등, 2008). 따라서 본 연구에서는 메밀 추출물을 이용하여 LPS로 염증을 유도하고 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 효과와 염증 관련 mRNA의 발현에 미치는 영향을 연구하여 일반 메밀과 쓴메밀의 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 또한 일반메밀에 비해 쓴메밀에 높은 함량으로 존재하는 루틴의 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 효과를 통해 루틴 함량과 일반메밀과 쓴메밀의 항염증 효과 간에 상관성이 있는지를 평가하였다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용된 재료는 일반메밀(‘양절메밀’)과 쓴메밀(‘대관3-7호’) 2종으로 강원도 평창군 대관령면(북위 37.40°, 동경 128.45° ,800 m)에 위치한 실험포장에서 2018년 7월에 파종하여 10월에 수확하고 20±5°C 조건에서 한달간 자연건조한 종자를 사용하였다(Fig. 1). 건조된 종자를 분쇄기(Grinder SFM-555 SP, Shinil Co., Seoul, Korea)에서 마쇄하고 40 mesh체로 거른 후 분말을 분석에 사용하였다. 분말 시료 50 g을 측정하여 −70°C의 초저온냉동고에 보관한 후 동결건조기에서 다시 건조하였다. 동결건조한 분말시료에 100배 가량의 80% 에탄올을 첨가하고 속슬렛 추출기(Soxhlet heater DH-43, Jisico Sci., Seoul, Korea)를 활용하여 80& deg;C 항온수조에서 2시간 환류냉각추출(reflux extraction) 하여 유용 성분을 추출하였다. 추출물은 여과지(No. 6, Whatman, Maidstone, UK) 1장을 깔고 진공펌프(Vacuum Pump, GAST)로 여과한 후 볼륨 플라스크로 옮겨 100 mL로 정용하였다. 추출시료는 40°C 에서 rotary evaporator (EYELA N-1000, EYELA Co., Tokyo, Japan)로 감압농축 과정을 거친 후에 −70°C 초저온에서 급속으로 동결 건조하였다. 건조된 추출물 시료의 무게를 평량하는 방법으로 추출 수율을 계산하고 일정 농도로 희석한 후 사용하였다.

Fig. 1. Seed of common buckwheat and tartary buckwheat.

실험 시약

본 연구에 사용한 표준물질은 순도 99%의 루틴(Extrasynthese, Genay, France)과 퀘세틴(Extrasynthese, Genay, France) 2종을 사용하였으며, 분석에 사용된 시약으로는 HPLC 순도의 아세토니트릴과 메탄올(Tedia Co. Cincinnati, OH, USA)과 포름산(formic acid, Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 증류수는 초순수증류수제조기(Milli-Q system, Millipore, Bed ford, MO, USA)에서 정제한 초순수 물을 사용하였다.

루틴 및 퀘세틴 분석

추출 시료는 초고속액체크로마토그래프(Ultra Performance Liquid Chromatograph, UPLC) 분석을 위해 멤브레인 필터(PTFE 13 mm 0.20 μm, PALL Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA)로 다시 여과한 후 분석전까지 −20°C 냉동고에 보관하였다.

UPLC분석은 Kim 등(2017b)의 방법으로 플라보노이드 정량 분석을 위해 UV detector를 장착한 UPLC (Acquity UPLC I-Class, Waters Corporation, Milford, MA, USA) 기기와 분석 칼럼(Acquity UPLC CSH C18, 2.1 mm i,d, 100 mm length, 1.7 μm particle size, Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 사용하였다. 이동상으로는 용매 A (1% formic acid in water, v/v)와 용매 B (0.1% formic acid in acetonitrile, v/v)를 사용하여 유속은 0.25 mL/min으로 일정하게 흘려주었다. 용매 이송은 gradient 방식으로, 용매 B를 7%의 농도로 처음 시작하여 2분에서 11분까지 17%로 증가시켰다. 이후 11분에서 13분까지 25%로 증가시킨 후 19분까지 그 농도를 유지시켰다. 이 후 용매 B를 19분에서 21분까지 25%에서 7%로 감소시켰으며 23분까지 2분간 7%의 농도로 안정화시켰다. 기기내 칼럼 온도는 30°C로 설정하였고, 샘플 온도는 20°C로 각각 설정하였다. 관측에 사용된 검출 파장(detection wavelength)은 259 nm이고, 시료주입량은 1 µL로 하였다. 본 분석에 사용된 표준물질 루틴과 퀘세틴의 피크와 추출물 샘플의 각 피크는 표준물질의 머무름 시간(retention time, RT)과 비교하여 크로마토그램으로 나타내었다(Fig. 2). 표준물질의 루틴과 퀘세틴RT는 각각 9.23와 18.51 min이었다. 루틴과 퀘세틴 함량(mg/100 g, 동결건조한 종실 기준)을 표준물질의 UPLC 피크 면적을 이용하여 계산하였다. 루틴과 퀘세틴 검량선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별로 UPLC로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값을 계산하였다.

Fig. 2. UPLC profiles of rutin and quercetin in a standard mixture solution (green line) and extracts from tartary buckwheat seeds (black line) obtained through reflux extraction.

항산화 활성 분석

시료의 항산화 활성 측정을 위해 루틴 분석과 동일한 방법으로 추출 및 여과하여 −20°C 냉동고에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 항산화 분석은 UV/VIS absorbance를 장착한 Multimode microplate reader (Cytation 5 cell imaging multimode reader, Biotek instruments Inc. Winooski, VT, USA) 기기로 측정하였다. Multi-mode microplate reader로 분석한 결과는 각 이미지로 저장하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Anti-oxidant imaging profiles of (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (DPPH) radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, flavonoid, and polyphenol content in gradation from standard solution obtained by multi-mode microplate readers.

DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich) radical 소거법은 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 환원되어 보라색이탈색에 의해 나타내는 정도를 지표로 하여 항산화능을 측정하는 원리를 이용하였다(Lee 등, 2016; Choi 등, 2006). DPPH radical 소거 활성은 96 well plate에 표준물질과 샘플 추출물 50 μL를 첨가한 후 0.2 mM DPPH 용액(99.9% ethanol에 용해) 200 μL를 첨가한 후 실온에서 30분간 반응 후 520 nm 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거 활성은 시료 100 g당 mg TE (Trolox equivalent antioxidant capacity)로 표현하였다. DPPH 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.00, 0.023, 0.034, 0.045, 0.056, 0.083 mg/mL)로 6반복으로 multi-mode microplate reader로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r=0.9974)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y= −15.511x+1.4871)을 계산하였다.

ABTS (2,2'-Azino-bis-3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid, SigmaAldrich) radical 소거 활성은 추출물의 항산화 성분에 의해 ABTS+가 소거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 원리를 이용하였다(Lee 등, 2016). ABTS 7.4 mM과 potassium persulphate 2.6 mM을 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS 양이온을 형성시킨 후 이 용액을 735 nm에서 흡광도값이 1.4-1.5가 되도록 몰흡광계수(ε =3.6× 104 M−1·cm−1)를 이용하여 메탄올로 희석하였다. ABTS radical 소거 활성은 96 well plate에 표준물질과 샘플 추출물 50 & mu;L를 넣고, 희석된 ABTS 용액 200 μL를 첨가한 후 실온에서 60분간 반응 후 734 nm 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 시료 100 g당 mg TE로 표현하였다. ABTS 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.00, 0.023, 0.034, 0.045, 0.056, 0.083 mg/mL)로 6반복으로 multi-mode microplate reader로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r=0.9997)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y= −13.918x+1.3175)을 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 주황색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다(Lee 등, 2016). 96 well plate에 표준물질과 샘플 추출물50 μL에 증류수 100 μL와 5% NaNO2 15 μL를 넣은 다음, 5분 후 10% AlCl3(H2O)6 30 μL를 가하여 6분 반응시키면 표준물질이 노란색으로 변하게 된다. 이 때 1 N NaOH 100 μL를 첨가하고, 11분 후 표준물질이 주황색으로 변한 반응액의 흡광도 값을 510 nm에서 측정하였다(Dewanto 등, 2002). 표준물질인 rutin (SigmaAldrich)을 사용하여 검량선을 작성하였고, 시료 100 g당 mg rutin equivalent (RE, dry basis)로 나타내었다. 플라보노이드 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.00, 0.025, 0.050, 0.100, 0.200, 0.400 mg/mL)로 6반복으로 multi-mode microplate reader로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r=0.9997)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y=1.7424x+0.038)을 계산하였다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu phenol reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과, 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다(Dewanto 등 2002; Folin와 Denis, 1912). 총 폴리페놀 함량은 96 well plate에 표준물질과 샘플 추출물 50 μL와 2% Na2CO3 용액 200 μL를 가한 후 실온에서 3분간 반응시킨 후 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich) 20 & mu;L를 가하였다. 30분 후, 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였고, 표준물질인 gallic acid (Sigma-Aldrich)를 사용하여 검량선을 작성하였고, 시료 100 g당 mg gallic acid equivalent (GAE, dry basis)로 나타내었다. 폴리페놀 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.00, 0.025, 0.050, 0.100, 0.200, 0.400 mg/mL)로 6반복으로 multi-mode microplate reader로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r=0.9963)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y=1.776x+0.0565)을 계산하였다.

세포 배양

마우스의 대식세포인 RAW 264.7는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양을 받아 실험에 이용하였다. RAW 264.7 세포주는 배양용기에 Dulbecco’s modified Eagle’s minimum essential medium (DMEM, Life Technologies Inc., Brand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone TM, GE healthcare life sciences, Chicago, IL, USA), 100 U/mL penicillin (HycloneTM, GE healthcare life sciences) 및 100 μg/mL streptomycine (HycloneTM, GE healthcare life sciences)을 첨가한 배양액을 이용하여 배양기에서 37°C와 5% CO2c를 유지하며 배양하였다. 메밀 시료 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich)에 녹여 세포에 처리하였다. NO 및 염증성 사이토카인을 확인하기 위해 LPS 1 μg/mL (Sigma Aldrich Co.)를 처리하여 RAW 264.7 대식세포에서 염증반응을 유도하였다.

세포독성 측정

시료의 세포독성은 MTT assay 방법으로 확인하였다. 세포를 96 well plate에 1×105 cells/mL로 분주하여 24시간 배양하였고 시료를 6.25-400 μg/mL 농도로 처리하였다. 그 후 24시간 배양 후 MTT solution [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich)]을 첨가하였다. 37°C, 5% CO2 배양기에서 2시간 배양한 후, 상층액을 suction하고, 형성된 formazan에 DMSO (Sigma-Aldrich)를 200 μL 첨가하고 실온에서 30분 동안 흔들면서(shaking) 녹인 다음 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도(optical density, O.D.)를 측정하였다.

NO 생성량 측정

NO 생성량은 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess reaction assay를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포는 배지를 이용하여 2× 105cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 분주하고, 24시간 후 시료를 농도별로 처리하였다. 1시간 후 세포에 1 μg/mL의 LPS를 처리하고 24시간 재 배양한 후, 배양액을 수거하였다. 배양액 상층액을 동량의 Griess reagent (Promega Co., Madison, WI, USA)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내의 NO의 생성량은 표준물질인 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다. NO의 positive control로는 LNIL (40 μM)을 사용하였다.

염증성 사이토카인(Cytokine) 분비량 측정

RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 후 생성된 염증 관련 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비량을 측정하였다. RAW 264.7 세포를 24 well plate에 2×105 cells/mL로 24시간 배양하여 세포를 안정화시킨 뒤에 시료를 농도별로 전처리한 뒤 1시간 후에 LPS를 1 μg/mL이 되도록 처리하였다. 24시간 배양한 후 상층액을 취하여 enzyme immunoassay (EIA) kits (BD Bio-science, Sand Diego, CA, USA)를 이용하여 kit에 제시된 실험방법대로 수행하였다.

Western Blot 분석

시료를 100, 200, 400 μg/mL로 1시간 전처리 후, LPS를 1 μg/ mL이 되도록 처리하여 24시간 배양한 RAW 264.7 세포를 1× phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어 낸 뒤, lysis buffer [50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 5 mM phenyl-metylsulfonylfluride (PMSF), 1 μg/mL aprotinin, 1% Triton X-100, and 0.1% NP-40]인 PROPREP protein extraction solution(Intron Biotechnology, Sungnam, Korea)에 용해하였다. 세포 용해액을 4°C에서 30분 반응 후, 15,000 rpm에서 30분 원심 분리하여 세포막 성분을 제거하고, 상등액만 회수하였다. 단백질의 정량은 Bradford protein assays (BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 595 nm의 흡광도로 측정하였고, 이에 대한 standard로는 bovine serum albumin (BSA)를 사용하였다. 단백질 정량 후 sample buffer에 넣고 5분간 끓인 뒤SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)을 이용하여 전개하였다. 전개된 gel을 PVDF membrane에 transfer한 후, 비특이적인 단백질에 대해 5% 탈지분유(non-fat milk block solution)에서 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, membrane에 각각의 1차 항체를 첨가하여 4°C에서 over night시켰다. 이후 Tween 20/TBS 로 10분간 3번씩 세척하고, 2차 항체로는 anti-rabbit 또는 antimouse IgG-horseradish peroxidase (HRP)를 사용하여 반응시켰다. 이어서 단백질은 enhanced chemiluminescence (ECL) solution (American Pharmacia Biotech, NY, USA)을 감광시켜 ChemiDocTM Imaging Systems (Bio-Rad)을 이용하여 발현을 확인하였다.

Quantitative real-time RT-PCR에 의한 mRNA 분석

배양된 RAW 264.7 세포에 1 mL EasyBlue reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)로 세포를 분리한 후, 200 μL chloroform을 첨가하여 15,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액 500 μL를 분취 한 후 동량의 isopropanol을 첨가한 뒤,15,000 rpm으로 5분 동안 4°C에서 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고, 1 mL DEPC-EtOH을 첨가하여 세척한 뒤 원심분리를 실시하여 상층액을 완전히 제거하였다. DEPC-DW를 첨가하여 RNA 를 녹이고 Nanodrop을 이용하여 RNA 농도를 측정하였다. TOPscriptTM cDNA synthesis kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 타깃 mRNA 발현을 평가하기 위해, real-time PCR은 SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc. Shiga, Japan)을 이용하여 한 후 SYBR Thermal Cycler Dice Real-Time PCR System (Takara Bio Inc.)에서 수행하였다. 실험에 사용한 각 mRNA의 primer는 Table 1에 나타냈다.

Table 1. Primer sequences for real-time RT-PCR of mRNA gene expression

통계분석

모든 실험 결과의 측정값은 반복 실시한 결과를 평균±표준편차(mean & plusmn; SD)로 나타내었고, 각 평균치간 차이에 대한 유의성은 Graphpad prism software t-test와 one way ANOVA 분석을 수행하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p-value로 검정하였다.

결과 및 고찰

루틴과 퀘세틴 함량

일반메밀과 쓴메밀 종실 에탄올 추출물의 루틴과 퀘세틴 함량은 Table 2에 나타내었다. 쓴메밀의 루틴 함량은 85.1-1,386.1 mg/100 g로 일반메밀의 루틴 함량보다 65-78배 높았다(Table 2). 퀘세틴 성분은 쓴메밀에서만 검출(19.6-286.4 mg/100 g) 되었다. 쓴메밀은 루틴 함량이 일반메밀에 비해 59-100배 높아 식의약 소재로 활용하기 위한 다양한 연구가 시도되고 있다고 하였는데(Yoon 등, 2006; Yoon 등, 2012), 본 연구에서도 쓴메밀 추출물의 루틴 함량이 일반메밀 추출물에 비해 월등히 높은 것으로 나타나 기존의 연구결과와 일치하는 경향을 보였다.

Table 2. Statistical data of the rutin and quercetin contents in the ethanol extracts obtained from common buckwheat and tartary buckwheat

항산화 활성

Fig. 4에서는 일반메밀과 쓴메밀 종실 에탄올 추출물의 항산화 활성을 나타내었다. 항산화 활성은 DPPH 및 ABTS radical 소거활성법으로 평가하였다. DPPH radical 소거 활성(400 μg/mL)은 일반 메밀 추출물이 223-1,138 mg TE/100 g, 쓴메밀 추출물은 292-2,317 mg TE/100 g로 나타났다(Fig. 4A). 또한, 일반메밀 추출물의 ABTS radical 소거 활성(400 μg/mL)은 910 mg TE/100 g과 쓴메밀 추출물은 1,076 mg TE/100 g인 것으로 분석되어(Fig. 4B), 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물보다 DPPH radical 소거능은 2.0배, ABTS radical 소거능은 1.2배 높았다.

Fig 4. Anti-oxidant content of ethanol extracts obtained from common buckwheat (CB) and tartary buckwheat (TB).

천연물의 항산화 활성은 활성 radical에 전자를 공여하고, 식품 중의 지방질 산화를 억제하는 특성을 가지고 있다. 또한, 인체 내에서의 활성 radical 소거작용은 인체의 질병과 노화를 방지한다는 데 역할을 한다고 하였다(Kim 등 2001). 이러한 항산화 활성의 중요성을 고려할 때 항산화 활성이 우수한 쓴메밀은 질병예방 및 노화방지를 위한 다양한 식의약 재료로 활용가치가 높을 것으로 기대된다.

쓴메밀 추출물은 일반메밀 추출물에 비해 플라보노이드 및 폴리페놀 함량에서도 각각 최대 2.0배(1,655 mg/100 g)와 1.8배(1,370 mg/100 g) 많은 것으로 나타났다(Fig. 4C-D). 천연물에 존재하는 폴리페놀계 화합물들은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대분자들과 결합하는 성질을 가지고 있어 항산화, 항암, 항당뇨, 심혈관 질환 및 골다공증 예방 등의 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Sakihama 등, 2002; Scalbert 등, 2005).

메밀의 다양한 기능성 효과는 이미 기존의 많은 연구(Campbell, 1997; Kim과 Kim, 2018; Lee, 2008)에서 확인되었으며, 이러한 효과는 루틴 등 플라보노이드 성분 및 폴리페놀 성분의 함량과 관련이 있다고 하였다(Park, 2006; Yoon 등, 2012). 쓴메밀의 경우 재배역사가 짧아 일반메밀에 비해 기능성 효과에 대한 활용 가능한 정보는 제한적이다. 따라서 본 연구에서 수행된 일반메밀 추출물과 쓴메밀 추출물의 항염증 비교연구는 기능성 성분의 함량과 생리활성 효과 간의 상관관계를 확인할 수 있는 기회를 제공해 줄 것으로 기대된다.

세포독성 평가

항염증 평가에 사용된 RAW 264.7 세포를 대상으로 메밀 추출물의 세포독성을 MTT assay로 측정하였다. 일반메밀과 쓴메밀 추출물을 대상으로 6.25-400 μg/mL의 다양한 농도범위에서 세포독성을 평가하였을 때, 세포의 생존율은 모든 처리 농도에서 100% 이상인 것으로 조사되어 세포독성이 없는 것으로 확인되었다(Fig. 5).

Fig. 5. The effects of ethanol extracts of CB or TB on cell cytotoxicity in RAW 264.7 cells.

NO 생성 억제 효과

체내에 존재하는 NO는 적절한 수준에서 혈소판 억제, 면역조절, 신경전달, 혈관확장 등의 역할을 하지만 과도한 NO 생성량은 염증성 질환을 유발할 수 있고, 피부손상 및 노화의 주요 원인이 된다(Kim 등, 2015; Nathan, 1992). 그러므로 적절한 농도의 NO를 유지하는 것이 건강을 위해 매우 중요하다.

일반메밀과 쓴메밀 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 먼저 LPS를 처리하여 RAW 264.7 세포에 염증을 유도하고 NO를과다 생성하는 조건을 만들었다. 여기에 메밀 추출물을 처리하여 NO 생성 억제 효과를 평가하였다(Fig. 6). LPS (1 μg/mL) 단독처리군은 처리하지 않은 군에 비해 생성된 NO의 양에서 약 10배 이상의 증가를 보여 염증반응이 충분히 활성화된 것을 확인하였다. 일반메밀과 쓴메밀 추출물의 각 시료를 100, 200 및 400 & mu;g/mL 농도로 처리한 뒤, NO 생성 억제 효과를 평가하였다. 일반 메밀 추출물의 경우 모든 농도에서 유의적인 NO 생성 억제 효과가 나타나지 않았으나, 쓴메밀 추출물에서는 NO 생성량이 LPS 처리군와 비교하였을 때 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다.쓴메밀 추출물 100 μg/mL 처리에서는 통계적 유의성이 없었으나, 200 μg/mL과 400 μg/mL 농도에서는 통계적 유의성을 보였으며, 400 μg/mL 농도에서 LPS군 대비 10.86±4.31% 감소하였다. 쓴메밀 추출물에 의한 NO 생성 감소는 루틴(100 μM) 처리군(7.27± 2.18%)과 비슷하였다. 본 연구결과는 Choi(2013)가 쓴메밀의 생리활성 성분인 루틴을 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 유의하게 NO 생성이 감소하였다는 연구결과와 일치하였으며, Kang 등(2014)이 다시마 추출물 100 μg/mL 처리에서 약 28%의 NO 생성 억제 효과를 보였다는 연구결과와 유사하였다.

Fig. 6. The effects of CB or TB on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine) 생성 억제 효과

염증성 사이토카인은 염증 면역 반응에서 필연적으로 동반되는 물질로서 발병조건에서 그 발현이 증가하며, 피부염증 및 암 등의 발생에 중요한 역할을 한다. 대표적인 물질로는 TNF-α, IL1β 및 IL-6가 있다(Kim 등, 2015).

LPS가 처리된 RAW 264.7 세포에서는 종양괴사 인자인 TNFα가 생성되며, 분비된 TNF-α와 LPS에 의해 IL-1β와 IL-6의 생성이 연속적으로 유도된다. 이러한 염증유발 물질에 의해 NO 생성과 국소 염증이 발생하여 염증반응이 지속된다(Beutler과 Cerami, 1989). 따라서 면역반응과 염증 초기단계에서 중요한 역할을 하는 염증성 사이토카인의 생성을 억제함으로써 염증반응의 조절 가능성을 높일 수 있다고 하였다(Kim 등, 2015). 메밀 추출물의 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 구명하기 위해 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포에 메밀 추출물을 농도별로 처리하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성량을 ELISA 방법으로 측정하였다. TNF-α와 IL-1β 생성은 일반메밀과 쓴메밀 추출물 처리에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 7). 특히, 일반 메밀 추출물(TNF-α IC50: >400 μg/mL; IL-1β IC50: 271.24 μg/ mL)에 비해 쓴메밀 추출물(TNF-α IC50: 118.31 μg/mL: IL-1& beta; IC50: <100 μg/mL)의 억제 효과가 현저했다. IL-6 생성은 쓴메밀 추출물(IC50: 239.07 μg/mL)처리에 의해 유의적으로 감소되는 것을 확인하였으나, 일반메밀 추출물에서는 생성 억제 효과가 거의 나타나지 않았다(Fig. 7). TNF-α는 초기 염증반응의 주요 매개자로 세포를 활성화시켜 자가 면역 반응을 유도하며(Chen 등, 2015), IL-1& beta;는 염증성 매개물질은 감염 초기에 생체 방어 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Higuchi 등, 1990), IL-6은 세포의 활성화를 통해 염증매개 물질을 발현시켜 후천성 면역을 개시하는 물질이다(Kim 등, 2016). 이러한 사이토카인들의 발현을 조절할 수 있는 생리활성 물질의 탐색은 다양한 질병의 예방 측면에서 매우 중요하다고 할 수 있다. 그러나 체내에서 과잉 생산될 경우악성 종양이나 자가 면역질환 및 감염성 질환 등의 여러 가지 질환을 유발할 수 있다(Hibi 등, 1996; Hirano 등, 1994). 쓴메밀 추출물은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 억제하는 효과가 있어 초기 염증 뿐만 아니라 후천성 면역과 관련된 염증의 억제에도 효과가 있을 것으로 기대된다.

Fig. 7. Inhibitory effects of CB or TB on the production of inflammatory cytokines in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

대조약물로 사용된 루틴(100 μM) 처리에서도 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성이 50% 이상 저해되는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 루틴이 사이토카인 관련 염증 억제에 직접적인 효과가 있음을 시사한다. 또한, 루틴 함량이 높은 쓴메밀 추출물에서 사이토카인 억제 활성이 강하게 나타난 연구결과를 설명할 수 있는 근거가 될 수 있다.

iNOS 단백질과 mRNA 발현에 대한 영향

체내에 염증반응이 일어나게 되면 관련 세포에서 iNOS의 발현이 증가하여 다량의 NO가 생성되며, 이로 인해 유전자 변이, 신경 및 조직 손상이 유발된다. 또한, 혈관투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진시킨다.

메밀 추출물을 대상으로 매개인자인 iNOS 단백질 발현 정도를 확인하였다. 쓴메밀 추출물에서는 LPS에 의한 iNOS 단백질 발현이 감소하였으나, 일반 메밀 추출물은 LPS 처리군과 비교하여 단백질 발현에서 변화가 없거나 오히려 증가하는 것이 확인되었다(Fig. 8). 또한 쓴메밀 추출물에 의한 iNOS 단백질 감소가 유전자 전사 억제를 통해 나타나는 것인지 확인하기 위해 iNOS mRNA발현에 대한 영향을 측정하였다. 쓴메밀 추출물은 농도가 높아짐에 따라 iNOS mRNA를 유의적으로 감소시켰으나, 일반 메밀 추출물은 농도 의존적인 iNOS mRNA 발현 저해를 보이지 않았다. 따라서 쓴메밀 추출물은 iNOS mRNA발현 억제를 통해 iNOS 단백질에 의한 NO 생성을 억제하는 것으로 판단된다. 이러한 결과는 앞선 실험에서 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물에 비해 NO 저해 효과가 우수한 결과와 일치한다.

Fig. 8. The effects of CB and TB on protein and mRNA expression of iNOS in LPS-stimulated RAW 264.7 cells (A and B) Total cellular proteins were prepared from cells treated with stimulated with LPS (1 µg/mL) for 24h with or without CB (100, 200, or 400 µg/mL) or TB (100, 200, or 400 µg/mL).

염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) mRNA 발현에 대한 영향

메밀 추출물에 의한 염증성 사이토카인 즉, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성 억제가 유전자의 발현 단계에서 조절되는지를 확인하기 위해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현을 조사하였다(Fig. 9). 일반메밀 추출물의 경우 TNF-α와 IL-1β의 mRNA 발현은 감소되었으나, IL-6의 mRNA는 유의적인 감소를 보이지 않았다. 반면, 쓴메밀 추출물에서는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현이 모두 농도의존적으로 저해되는 것을 확인하였다(Fig. 9). 따라서 일반메밀과 쓴메밀 추출물의 염증성 사이토카인 생성량 억제효과는 관련 유전자의 발현을 저해함으로써 나타나는 것으로 판단된다. 또한 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물에 비해 TNF-α, IL1β 및 IL-6의 mRNA를 현저히 감소시킴으로써 더 우수한 항염증 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

Fig. 9. The effects of CB and TB on mRNA expressions of TNF-α, IL-1β, or IL-6 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

요 약

메밀은 전 세계적으로 알곡, 싹, 차 등 다양한 형태로 이용되고 있으며, 주요재배종으로는 일반메밀과 쓴메밀이 있다. 본 연구는 일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물을 대상으로 항산화 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 루틴 함량은 쓴메밀 추출물이 일반 메밀 추출물보다 65-78배 높았으며, 퀘세틴은 쓴메밀 추출물에서만 검출되었다. 플라보노이드 및 폴리페놀 함량도 쓴메밀 추출물이 1.8-2.0배 높았다. 쓴메밀 추출물은 6.25-400 μg/mL 범위의 농도로 세포독성을 평가하였을 때 세포독성은 관찰되지 않았다. 또한, 세포 내 NO 생성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 염증성 NO 생성과 관련된 유전자 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과, 쓴메밀 추출물에서만 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 감소되었다. 염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNFα와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성 억제효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성 억제효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다. 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인한 결과, 일반메밀과 쓴메밀 추출물에 의한 mRNA 발현이 감소되었으며, 쓴메밀 추출물의 억제효과가 더욱 우수하였다. 이러한 결과들을 고려하면 루틴 함량과 항염증 효과와는 밀접한 관계가 있으며, 루틴 함량이 높은쓴메밀이 항염증 식의약 소재 개발에 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.

감사의글

본 논문은 농촌진흥청 작물시험연구사업(과제번호: PJ01189403)에 의해 이루어진 것이며 이에 감사드립니다.

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