Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

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Virulence Factors and Antimicrobial Resistance of Vibrio parahaemolyticus Isolated from Commercial Fisheries Products

시판수산물에서 분리한 Vibrio parahaemolyticus의 병원성 인자와 항균제 내성 현황

  • Lee, Ye Ji (Department of Aqualife Medicine, Chonnam National University) ;
  • Kim, Eunheui (Department of Aqualife Medicine, Chonnam National University)
  • 이예지 (전남대학교 수산생명의학과) ;
  • 김은희 (전남대학교 수산생명의학과)
  • Received : 2019.10.14
  • Accepted : 2019.12.18
  • Published : 2019.12.31
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Abstract

Vibrio parahaemolyticus causes food poisoning, mainly via marine fisheries products. We investigated the virulence factors and drug resistance of V. parahaemolyticus isolated from fisheries products purchased from the Yeosu Fisheries Market. The isolates were identified using a variety of biochemical tests and the detection of toxR and hns gene. The presence of the virulence factor-encoding genes tdh and trh in the isolates was also investigated by PCR. The resistance of the isolates to 13 antibacterial agents was tested using the disc-diffusion method and carriage of β-lactamase genes and class 1 integrons by ampicillin-resistant isolates was investigated by PCR. Four of seventeen isolates identified as V. parahaemolyticus by biochemical tests produced a species-specific PCR band. Those isolates showed >98% 16S rRNA gene sequence homology with V. parahaemolyticus and only one isolate harbored the tdh gene. All of the V. parahaemolyticus isolates were resistant to ampicillin and amoxicillin; moreover, VPA0477, a class A β-lactamase gene, and class 1 integrons were detected. Therefore, V. parahaemolyticus from fisheries products represents a low risk to human health. Also, V. parahaemolyticus is likely to develop multidrug resistance because it has class 1 integrons.

Keywords

서 론

V. parahaemolyticus는 호염성 균으로 전 세계 해역에 널리 분포하며 수산물 섭취를 통해 인체에 식중독을 일으키는 것으로 알려져 있다(Yeung and Boor, 2004). 1998년도에는 집계된 식중독 119건 가운데 V. parahaemolyticus에 의한 발생건수가 전체의 26.8%였으나(KFDA, 1999), 2014년에는 7건(2%), 2015년에는 330건 중 5건(1.5%)으로 지속적으로 감소하다 2016년도에 399건 중 22건(5.5%), 2017년에는 9건(2.6%)으로 약간 증가하는 추세를 보이고 있다(MFDS, 2018). V. parahaemolyticus의 병원성과 관련된 인자로는 내열성 용혈독(thermostable direct hemolysin, TDH) 및 내열성 용혈독 관련 용혈독(TDH-related hemolysin, TRH), type III secretionsystems (TTSS) 등이 있다(Makino et al., 2003; Yeung and Boor, 2004). 특히 TDH는 V. parahaemolyticus가 장 질환을 일으키는 중요 인자로서, Wagatsuma 혈액배지에서 β-용혈성(Kanagawa phenomenon positive, KP+)을 보이는 것과 관련이 있다(Miyamoto et al., 1969). 임상검체로부터 분리된 V. parahaemolyticus는 대부분 KP+ 활성을 보이는 반면, 비 임상균주에서는 1-2%만이 KP+로 알려져 있다(Sakazaki et al., 1968; Miyamoto et al., 1969; Nishibuchi and Kaper, 1995). 또한 바늘형 구조인 TTSS는 그람 음성 세균의 병원성 단백질을진핵 숙주 세포로 주입하는데 관여하는 것으로 TDH 생산균주에만 나타나며 의 인체 병원성과 관련이 있다고 보고있다(Makino et al., 2003). 그러므로 수산물에서 분리되는 비임상 V. parahaemolyticus 균주들에서 이러한 병원성 관련 인자를 확인하는 것은 분리 균주의 장염 유발가능성을 알아보는 척도가 될 수 있다.

더욱이 최근 항생제 내성균의 출현과 그의 빠른 확산으로 인해 세계 각국은 물론 우리나라 또한 그 위험성을 감지하고 체계적인 감시 시스템 구축을 통해 내성균 발생 및 내성 전이에 대응하고 있다. 2015년 세계보건기구(world health organization, WHO)는 글로벌 행동계획인 항생제 내성균 감시체계(globalantimicrobial resistance surveillance system, GLASS)을 제시하며 국가별 대책마련 및 국제 공조를 강력히 촉구하고 있다. 우리나라도 2016년 7월을 시작으로 임상 분야뿐 아니라 비임상분야인 축·수산물에 대한 항생제 내성균 모니터링을 지속적으로 실시하고 있다(KCDC, 2016). 의료관련 주요 항균제에 대해 내성을 지닌 비임상세균이 인체 유해세균과의 접촉을 통해 내성 유전자를 전이 시킴으로써 질병 치료에 어려움을 가져올가능성도 제기되고 있다(Barcelos et al., 2018). 실제 Liu et al.(2013)은 V. parahaemolyticus를 공여균으로 하여 내성 전이 실험을 한 결과 qnrVC, blaPER-1 및 4개의 gene cassette (aacA3, catB2, dfrA1, aadA1)를 가진 class 1 integron이 transconju-gant의 plasmid 상에서 발견되었다고 보고하였다.

따라서 본 연구에서는 시판 수산물에서 분리되는 V. parahaemolyticus 의 병독성인자 유무와 인체 유용 항균제에 대한 내성 현황을 알아봄으로써 분리 균의 인체건강위험도를 평가하고자 하였다.

 

재료 및 방법

세균 분리

세균 분리를 위해 사용된 수산물은 2017년 4월부터 12월까지 총 16회에 걸쳐 여수 인근 수산시장에서 무작위로 구입하였으며 구입 즉시 아이스박스에 담아 실험실로 운반하여 2시간 이내에 실험 시료를 제작하였다. 시험 균은 식품 공전의 V. parahae-molyticus (장염비브리오균) 미생물 시험 법에 따라(MFDS, 2016) 분리하였다. 수산물 검체 25 g에 alkaline peptone water (APW) 225 mL를 첨가하고 stomacher (LEDEmbo, Hansoltech, Seoul, Korea)로 마쇄한 후 35°C에서 24시간 증균배양하였다. 증균 시료는 thiosulfate citrate bile salts sucrose agar(TCBS, BD)에 접종하여 35°C에서 24시간 배양한 후 성장한청록색 집락을 선택하였다.

 

분리 균의 생화학적 특성 분석

분리 균들 중 그람 음성 간균이며 oxidase 양성이고, 호기적 또는 혐기적 조건에서 모두 glucose 분해가 가능하며 novobiocin에 감수성을 보이는 균주들을 Vibrio spp.로 간이 동정하였다.

이들을 식품공전의 시험법에 따라 triple sugar iron (TSI, BD)배지에 접종하여 24시간 배양 후 사면부가 적색, 고층부가 황색(K/A)인 결과를 보이며, 가스를 생성하지 않는 균을 다시 선택하여 lysine indole motility (LIM, BD) 배지에 접종하여 ly-sine decarboxylase 양성, indole 생성, 운동성 양성을 보이면 V.parahaemolyticus로 추정하였다(MFDS, 2016).

V. parahaemolyticus로 추정된 균들은 0, 3, 8, 10% NaCl을 첨가한 APW에 접종하여 내염성을 알아보았으며, API 20Ekit (Biomerieux, France)를 이용하여 VP (voges-proskauer), mannitol, arginine 및 ornithine, O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) test 결과를 확인하였다. 또한 V. parahaemolyticus로 추정된 균들을 tryptic soy agar (TSA) 배지에 접종하여 42°C에서 24시간 배양하여 균의 성장 여부를 확인하였으며 식품 공전의 V. parahaemolyticus양성 기준과 비교 하였다.

 

PCR에 의한 유전자 검출

분리균 동정을 위해, 시판되고 있는 V. parahaemolyticus 검출 kit (PowerChek, Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 polymerase chain reaction (PCR; MyGenie96, Bioneer, Daejeon, Korea)을 실시하였으며 375bp의 증폭 산물을 확인하였다. TSA 평판배지에서 24시간 배양한 균의 잘 분리된 1-2개의 집락으로 colony PCR을 실시하였다. 증폭 산물은 1.5-2% agarose gel에서 전기영동하여 0.5 ug/mL의 ethidium bromide (EtBr)로 염색 시킨 후 자외선 조사기(UVIvue, UVItec, UK)로 DNA band의 크기를 확인하였다. 결과 비교를 위한 표준 균주는 한국생명공학연구원의 생물자원센터에서 분양 받은 V. parahaemolyticus (KCTC 2471)를 사용하였다.

분리 균주의 16S rRNA gene sequence를 알아보기 위하여 PCR premix (Bioneer)와 16S rRNA universal primer (fD1, AGA GTT TGA TCC TGG CTA G; rP2, ACG GCT ACCTTG TTA CGA CTT)를 이용하여 PCR을 실시하였다(Weis-burg et al., 1991). 95°C에서 10분 동안 열 변성 후 95°C에서 30초, 45°C에서 30초, 72°C에서 30초의 cycle을 30회 반복하고 마지막으로 72°C에서 10분간 반응시킨 후 전기영동을 실시하여 1400 bp의 산물을 확인하였다. PCR 산물은 PCR purificationkit (AccuPrep, Bioneer)를 이용하여 정제한 후 sequencing을 의뢰하였다(SolGent Co., Daejeon, Korea). 얻어진 염기서열은 NCBI (National center for biotechnology information)의 BLAST search를 통해 상동성을 비교하였다.

V. parahaemolyticus 균 동정에 사용되는 toxR (Cholera toxin regulator)과 hns (Histone-like nucleoid structure) 유전자 그리고 병원성 관련 유전자인 tdh와 trh의 유무도 특이 primer를 이용한 PCR로 확인하였다(Table 1 and 2).

 

항균제 감수성 시험

분리 균주의 항균제 감수성 패턴은 디스크 확산법(NIFS, 2017)으로 조사하였으며 의료 관련 감염병 관리에 주요한 항균제 10종, ceftazidime (CAZ, Oxoid), cefotaxime (CTX, Ox-oid), imipenem (IPM, Oxoid), amoxicillin (AML, Oxoid), ampicillin (AMP, BD), amikacin (AK, Oxoid), gentamycin(CN, Oxoid), colistin (CT, Oxoid), ciprofloxacin (CIP, BD), nalidixic acid (NA, BD)와 양식장에서 사용빈도가 높은 약 제3종, erythromycin (E, BD), oxytetracycline (OT, Oxoid), tet-racycline (TE, BD)을 사용하였다(Table 6). TSA배지에 24시간 배양한 균주를 0.85% NaCl 용액으로 McFarland 0.5 탁도(1.5 × 108 CFU/mL)가 되도록 조정하였다. 탁도 조정된 균액을 0.5% NaCl이 첨가된 MHA (muller hinton agar, BD)에 멸균면봉으로 도말하고 항균제 디스크를 평판 위에 고착시켜 35° C에서 24시간 배양한 후 생성된 생장억제대의 직경을 측정하였다. 항균제에 대한 감수성 정도는 CLSI (clinical and laboratorystandards institute)의 Enterobacteriaceae와 V. cholerae 의 기준에 따라 판정하였다(CLSI document, 2013).

 

β-lactamase 유전자와 Class 1 integron 검출

Ampicillin에 대해 내성을 보이는 균주는 β-lactamase 유전자인 VPA0477과 blaCMY-2, blaPER-1, blaTEM 그리고 blaVEB-2를 target으로 하는 primer를 이용하여 PCR을 실시하여 전기영동한 후 특이 band 생성 여부를 확인하였다(Table 1 and 2). 또한 V. parahaemolyticus 분리 균주에 있는 β-lactamase 유전자의 group을 알아보기 위해 유전자 PCR 산물을 정제하여 se-quencing을 의뢰하여 얻어진 염기서열을 분석하였다. Class 1 integron 구조의 유무는 5'-conserved segment와 3'-conserved segment를 target으로 하는 primer를 사용하여 PCR로 확인하였다(Table 1 and 2).

 

Table 1. PCR primers used in this study and the size of products

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Table 2. PCR conditions for the detection of various genes

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결과 및 고찰

V. parahaemolyticus의 검출 특성

생화학적 특성에 근거한 검출

균 분리를 위해 채집한 수산물은 총 229개체이며, 이들로부터 138개의 sample을 제작하여 TCBS배지에서 청록색을 띄는 균집락 97개를 분리하였다(Table 3 and 4). 이들 중 Vibrio spp.는 49 균주(50.51%)였으며, 식품공전의 V. parahaemolyticus로 추정하는 기준을 충족하는 것은 17 균주(약 17.5%)였다(Table 5). 그러나 표준 균주와  V. parahaemolyticus로 추정된 17 분리균주는 8% 염분 내성, mannitol 분해 그리고 arginine 및 orni-thine 분해효소 생성 등 식품공전의  V. parahaemolyticus를 확정하는 추가 시험 결과에 차이를 보였다(Table 5). 그러므로 생화학적 특성에 근거하여 분리 균을 동정하고 출현 비율을 결정하는 것에 대한 보완필요성이 제기된다. 한편 TCBS에서 청록색을 형성하는 세균들 중에는 Vibrio spp.와 매우 유사한 생화학적 특성을 갖는 Morganella morganii가 높은 비율로 나타나므로  V. parahaemolyticus의 검출에 주의가 요구되었다.

 

Table 3. Fisheries products collected from fsh markets in Yeosu

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Table 4. Bacteria isolated from various fsheries products on TCBS medium 

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Table 5. Characterization to confrm Vibrio parahaemolyticus among 17 isolates

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특이 유전자 검출

V. parahaemolyticus 검출 kit를 이용한 PCR에서 표준 균주와 동일한 375 bp의 산물이 생성된 균주는 대하 유래의 SS 15-5, 우렁쉥이 유래의 SC19-5와 SC28-5, 그리고 바지락 유래의 MC23-1이였다(Table 5, Fig. 1). 이들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, 모두 V. parahaemolyticus와 98% 이상의 상동성을 보였다(Data not shown). 한편 V. parahaemolyticus의 분리 동정에 이용되는 toxR과 hns 유전자를 target으로 하는 primer로 PCR을 실시하였을 때에도 4 분리 균주와 표준균주(KCTC 2471)는 동일한 결과를 나타냈다(Fig. 2A, 2B). 따라서 생화학적 시험과 유전자 분석결과에 근거하여, V. parahaemolyticus는 4균주로 확정되었다. TCBS배지에서 청록색으로 나타난 집락에 대해서는 약 4.12%의 분리 비를 나타내지만 시료에서 검출되는 총 세균에 대해서 본다면 더 낮은 분리비로 계산될 것이다.V. parahaemolyticus 분리율을 보고한 다양한 연구들이 있으나(Lee et al., 2007; Ryu et al., 2010; Park et al., 2016; Kang et al., 2017) 비율의 단순한 수치 비교는 어렵다. 시료로 사용된 생물 종류와 각 지역의 해수 특성 및 채집 시기와 장소 등의 차이는 물론, 전체 시료 중V. parahaemolyticus 가 분리된 시료의 비율, 또는 시료 중의 총 세균 중 V. parahaemolyticus 의 출현 수를 계산하는 등 기준도 다양하다. 본 연구에서 식품공전의V. parahaemolyticus 분류 기준과 일치하는 분리 균은 없었으나 8% 염분 내성을 제외한 다른 모든 특성이 식품공전에서 제시한 결과와 동일한 분리 균은 5균주였다(1, 4, 5, 12 and 13 in Table 5). 그러나 이들 중 유전자구조를 검출하는 kit에서 양성 반응을 보인 균은 2균주 뿐이었다(5 and 13 in Table 5). 그러므로 식품공전의 기준에 따른 분류는 분리 비율을 실제보다 높게 나타나도록 하는 경향이 있다고 보아지며, 수산물에서 분리한 균주들 중 V. parahaemolyticus를 확인할 때,식품공전 시험법에 더하여 특이 유전자를 검출하는 PCR을 실시하는 단계가 추가로 필요할 것으로 사료된다.

 

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Fig. 1. Detection of Vibrio parahaemolyticus from 17 isolates by PCR using commercial detection kit. Lanes: M, 100 bp size mark-er; K, KCTC 2471 V. parahaemolyticus; 1, FSF 6-4; 2, SS 15-5; 3, SS 16-5; 4, RF 1-2; 5, SC 19-5; 6, MC 23-1; 7, FSF 9-4; 8, FSF11-4; 9, SS 26-3; 10, SS 27-5; 11, SL 15-5; 12, SL 16-3; 13, SC28-5; 14, SL 17-1; 15, SL 18-4; 16, SL 18-5; 17, SC 31-5. PCR, polymerase chain reaction; FSF, SS, RF, MC, SL, and SC refer totable 5.

 

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Fig. 2. PCR assay for the detection of various gene structures in Vibrio parahaemolyticus. toxR (A) and hns genes (B) for identifcation; tdh(C) and trh (D) of virulence gene ; VPA0477 (E) of β-lactamase gene; the class 1 integron structure (F). Lanes: M, 100 bp size marker; 1, KCTC 2471; 2-5, isolates: 2, SS15-5; 3, SC19-5; 4, MC23-1; 5, SC28-5; 6-7, Morganella morganii isolates. SS, SC, and MC refer table 5.

 

병독성 인자

병독성 인자인 tdh 유전자는V. parahaemolyticus 표준 균주와 바지락에서 분리된 MC 23-1 균주에서 약 500 bp 크기의 밴드로 나타났다(Fig. 2C). 이는 Nishibuchi and Kaper (1995)의 연구에서 제시한 269 bp와 달랐다. 이 PCR product의 염기서열을 분석한 결과 V. parahaemolyticus strain ATCC 17802와 FORC_006의 chromosome 2에 있는 유전자 구조(Accession No. CP014047.2 and CP009766.1)와 99% 이상의 상동성을 보였다. V. parahaemolyticus의 2번 염색체는 작은 염색체라고도 불리며, 이 염색체에는 tdh 를 포함한 여러 병원성 유전자를 지니고 있는 pathogenicity island가 존재하는 것으로 알려져 있다(Makino et al., 2003). 따라서 바지락 유래의 MC23-1은 인체에 대한 유해성이 있을 것으로 판단되었다. 그러나 tdh 유전자는 표준 균주를 제외한 분리 균주에서는 모두 검출되지 않았다(Fig. 2D). Lee and Park (2010)은 해수에서 분리한 V. parahaemolyticus 28 균주로 부터 tdh 와 trh 유전자가 모두 검출 되지 않았다고 보고하였으며, Oh et al. (2011)은 양식 어류에서 분리한 V. parahaemolyticus에서 tdh와 trh 유전자는 각각 전체의 5.5%와 0.5% 비율로 검출 되었다고 보고한 바가 있다. 또한 Park et al. (2016)은 패류 양식장에서 분리한 V. parahaemolyticus 의 병원성 유전자를 확인한 결과 총 121 균주 중 tdh 유전자는 2 균주, trh 유전자는 8 균주에서 검출되었다고 보고하였고, Kanget al. (2017)은 시판되는 패류에서 분리한 V. parahaemolyticus 중 tdh 유전자를 가지고 있는 균주는 전체 9.1%이고 trh 유전자는 검출되지 않았다고 보고하였다. 이와 같은 결과는 해수나 각종 수산물에서V. parahaemolyticus의 검출율이 높게 나왔다 할지라도 실제 사람에게 식중독을 일으킬 수 있는V. parahaemolyticus 는 훨씬 적다는 것을 의미한다 할 수 있으나, 계절과 시료의 종류 및 채집 장소에 따른 변동이 심하므로 지속적인 모니터링이 필요하다.

 

항균제 내성과 β-lactamase 유전자

V. parahaemolyticus 4 분리 균주들은 의료 관련 감염병 관리에 주요한 항균제들 중 AMP, AML과 CT를 제외한 모든 항균제에 대해 감수성을 보였다(Table 6). Penicillin 계통의 항균제에 대한 V. parahaemolyticus의 내성에 관해서는 많은 연구보고가 있다. Ryu et al. (2017)은 패류에서 분리한 V. parahae-molyticus의 AMP 내성율을 41.8%로 보고하였지만, Lee et al.(2007)과 Ryu et al. (2010)은 어패류에서 분리한 V. parahae-molyticus 균주의 AMP 내성을 각각 100%, 95.2%로 보고한 바 있다. 한편 본 연구의 분리 균에서 β-lactamase 유전자를 확인한 결과 VPA0477은 모든 균주에서 760 bp 크기의 특이 밴드로 나타났으나, blaPER-1과 blaTEM은 각각 2개의 비특이밴드로 나타났고 blaCMY-2,과 blaVEB-2는 검출되지 않았다(Fig. 2E, Table 7).

 

Table 6. Drug susceptibility of Vibrio parahaemolyticus isolated from fsheries products

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Table 7. PCR results for the detection of various β-lactamase genesin V. parahaemolyticus isolated from commercial fisheries products

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VPA0477 증폭 산물인 760 bp의 염기서열을 분석한 결과, blaCARB 유전자와 99% 이상의 상동성을 보였다. blaCARB는 carbenicillin계 약물을 가수분해하는 효소(Labia et al., 1981)인 class A β-lactamase에 속하는 CARB β-lactamase 유전자이다. 따라서 본 연구에서 분리된 V. parahaemolyticus는 모두 class A β-lactamase에 의하여 저항성을 나타내는 것으로 판단되었으며 이는 Lee and Park (2010)이 AMP 분해 유전자인β-lactamase와 상동성이 있는 유전자 VPA0477이 V. parahae-molyticus의 AMP 내성에 관여한다고 보고한 것과 일치하였다. 한편 blaPER-1유전자 PCR 결과 형성된 비특이 밴드들은 염기서열 분석에서 모두 V. parahaemolyticus 2번 염색체에 있는 유전자 구조와 99% 이상의 상동성이 있고, blaTEM의 비특이밴드들은 1번 염색체의 유전자 구조와 99% 이상의 상동성을 보였다(Data not shown). 따라서 이들이 본 분리 균의 항균제 내성과 어떤 관련이 있는지에 대해서는 추가 검토가 필요하다. 또한class 1 integron 구조가 V. parahaemolyticus 표준 균주(KCTC2471)와 4개의 분리 균주에서 모두 750 bp의 DNA 밴드로 검출되었는데(Fig. 2F) 이들의 구조 확인과 V. parahaemolyticus의 내성 전달과의 관련성에 대해서도 추가 연구가 필요하다. 아미노산 서열의 유사도에 근거한 β-lactamase 분류에서(Ambler, 1980; Bush and Jacoby. 2010), Class A β-lactamase는 β-lactam계 항균제의 target 부위인 DD-peptidase와 구조적 유사성을 가지며(Ghuysen, 1994), 활성 메커니즘에서 serin이 중심 활성 부위로 사용된다. 따라서 본 연구에서 분리한 V.parahaemolyticus의 β-lactamase는 활성을 위해 2가 양이온은 필요로 하지 않는 것으로 생각된다. 한편 Pazhani et al. (2014)은 임상 분리균인 V. parahaemolyticus를 대상으로 한 실험에서 AMP 내성인 균주 뿐 아니라감수성인 균주에서도 VPA0477 유전자가 검출되어, VPA0477과 AMP 내성과의 연관성에 의문을 제기한 바 있다. V. parahaemolyticus의 AMP 내성은 고도내성으로서 빈번히 발생하고 있는 실정이지만 아직까지 명확한 발생 기전은 밝혀지지 않고 여러 주장이 나오고 있는 상황으로 앞으로 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

이상의 결과들로부터 수산물에서 분리되는 V. parahaemolyticus에 의해 식중독을 일으킬 가능성은 분리 비율보다 낮다고 볼 수 있으며, AMP, AML, CT 이외의 의료용 약물에 대해서는 감수성 이었으므로 감염 시 항균제에 의한 치료가 비교적 용이할 것으로 생각되나 class 1 integron 구조가 확인됨으로써 다약제 내성으로 발전할 가능성이 높다고 판단된다.

References

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