넙치(Paralichthys olivaceus)와 강도다리(Platichthys stellatus)간 유도된 잡종 3배체의 난발생

Development of Allotriploid Embryos from Female Olive Flounder Paralichthys olivaceus Crossed with Male Starry Flounder Platichthys stellatus

Abstract

We investigated the characteristics and rate of development of allotriploid embryos derived from a cross between female olive flounder Paralichthys olivaceus and male starry flounder Platichthys stellatus. The allotriploidy was induced by cold shocking fertilized eggs three minutes post-fertilization at 3°C for 45 minutes. The average cellular DNA content of the allotriploid embryos was 2.06±0.03 pg/cell, which is equal to the sum of the cellular DNA content of a diploid olive flounder (1.42 pg/cell) and a haploid starry flounder (0.66 pg/haploid cell). The first cleavage, midblastula, gastrula and Kupffer's vesicle appearance stages of the allotriploid eggs began at 1.5, 8, 13 and 26 hours after cold shocking at 18°C, respectively. The developmental rate of allotriploid eggs was equivalent to that of diploid and triploid olive flounder eggs at 10, 14 and 18°C. However, the hatching times of allotriploid eggs, 7 h at 10°C, 5 h at 14°C and 4 h at 18°C, were earlier than those of diploid and triploid olive flounder.

서 론

넙치(Paralichthys olivaceus)는 한국, 일본 및 중국을 포함하는 동북아지방 및 중남미에서 양식대상종으로 각광받고 있으며, 우리나라는 2004년부터 국립수산과학원 육종연구센터에서 선발육종기법을 통하여 생산한 ‘킹넙치(KingNupchi)’를 어민에게 보급하고 있다(NFRDI, 2013).

넙치는 성장이 빠르고 맛이 좋은 장점을 가지고 있으나 비브리오병, 에드워드병 등 세균성 질병과 함께 특히, 스쿠티카섬모충(Philasterides dicentrarchi) 감염에 매우 취약하고(Jin et al., 2003), 동절기에 성장이 느려지며 저염분도의 해수에서 종묘 생산 및 사육이 어려운 문제점을 지니고 있다(Do et al., 2014). 강도다리(Platichthys stellatus)는 가자미목(Pleuronectiformes), 가자미과(Pleuronectidae)에 속하는 저서성 어류로, 한국을 비롯한 일본, 오호츠크해, 베링해에서 캘리포니아만에 이르는 북태평양의 전해역에 광범위하게 분포한다(Lim et al., 2007). 이들은 성장이 넙치에 비해 느린 단점을 지니고 있으나, 냉수성 어종으로 강한 내병성 및 광염성 등의 특징을 가지고 있어 우리나라에서 양식 생산량이 점차 증가되고 있다(Kim, 2012; Do et al., 2014).

어류에서 잡종 유도는 우량형질을 가진 두 종간 교배를 통해 단기간 내 최소한의 노력으로 산업성 획득형질인 잡종강세를 얻기 위해 시도된다(Kim et al., 1995). 이에 따라 국립수산과학원에서는 환경변화에 강하고 성장이 빠른 품종을 개발하기 위해 넙치와 강도다리 두 종간의 잡종을 유도하여 특허(Korean intellectual property office, 2006)를 출원한 바 있으나, 이들 잡종은 부화율이 대조군에 비해 20.0% 정도로 보고된 바 있다(Do et al. 2014). 그러나 이러한 잡종의 낮은 생존율은 잡종 3배체의 유도에 의해 회복되는 경향을 보이는 것으로 보고되고 있다(Piferrer et al., 2009).

이에 본 연구에서는 두 종간 잡종 3배체의 양식 대상종으로써 가능성을 알아보고자 넙치 암컷과 강도다리 수컷을 이용하여 잡종 3배체를 유도하였고 이들의 난발생을 넙치의 2배체 및 3배체와 비교 분석하였다.

 

재료 및 방법

실험어

본 연구에 대조군으로 사용된 넙치 2배체와 3배체는 국립수산과학원 육종연구센터에서 선발육종기법을 통하여 생산된 킹넙치(KingNupchi)의 난과 자성발생성 2배체 킹넙치 수컷의 정자를 사용하였다. 잡종 3배체 유도에 사용된 강도다리 정자는 거제도의 민간양식장과 부산시 남천동의 수산시장에서 구입한 어체중 400-600 g의 강도다리를 동 센터에서 1년간 사육한 후 이 중 6마리를 선별하여 이들의 정자를 사용하였다.

배수체 유도 및 분석

넙치의 3배체 및 잡종 3배체 유도에 사용된 난과 정자는 1회 처리시 암컷 6미로부터 복부압박법으로 확보된 난 중 난질이 우수한 4미의 난과 자성발생성 2배체 킹넙치 수컷 및 강도다리 수컷 3미로부터 채정한 정자를 모두 섞어 수정에 사용하였으며, 3반복으로 실험을 수행하였다. 제 2극체 방출 억제를 위해 Kim et al. (1994) 방법에 의거하여 수정 3분 후 3℃의 온도 조건하에서 45분간 저온 처리를 하였다.

배수체 분석은 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 DNA 함량을 측정하였다. 각 실험군의 단일세포(single cell)를 확보하기 위해 부화자어 3미를 균질기(homogenizer)로 조직을 파쇄한 뒤 nucleic extraction buffer (CyStain DNA 2 step; Partec Co., Münster, Germany)에서 반응을 수행하였고, DNA staining buffer (CyStain DNA 2 step; Partec Co., Münster, Germany)로 염색하였다. 염색된 시료들은 PA II flow cytometry (Partec Co., Münster, Germany)를 이용하여 DNA 함량을 분석하였다. 유도된 넙치 3배체 및 잡종 3배체의 DNA 함량을 측정하기 위해서 넙치 2배체 부화자어 및 성체 강도다리의 꼬리지느러미를 대조군으로 사용하였다.

난발생 관찰

잡종 3배체의 난발생은 18±1℃의 수온에서 발생을 유도하였고, 해부현미경(AZ100; Nikon Co., Japan)과 이에 부착된 디지털 카메라(DS-Ril; Nikon Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰과 촬영을 하였다. Kimmel et al. (1995) 및 Jung et al. (2015)의 난발생 단계를 기준으로 관찰하였으며, 저온처리가 끝난 시기를 0시(time 0)로 하여 수정란의 90% 이상이 동일한 단계에 도달하는 시기를 기준으로 각 발생단계별 소요 시간과 특징을 기록하였다. 수온별 넙치 2배체, 3배체 및 잡종 3배체의 수온별 난발생속도를 조사 하기 위해 각 실험군의 수정란들을 10, 14 및 18℃의 부화조에서 발생을 유도하였다.

 

결 과

배수체 분석

넙치 2배체(0.71 pg/haploid cell; Animal genome size database, 2016) 부화자어를 대조군으로 사용하여 강도다리 꼬리지느러미, 넙치 3배체 부화자어 및 넙치와 강도다리 잡종 3배체 부화자어의 DNA 함량을 분석한 결과는 Fig. 1과 같다. 강도다리 꼬리지느러미의 DNA 함량은 1.32±0.06 pg/cell, 넙치 3배체 부화자어는 2.14±0.03 pg/cell이었으며, 넙치와 강도다리 잡종 3배체 부화자어는 2.06±0.01 pg/cell으로 나타났다.

Fig. 1.Flow cytometric histograms of DNA contents of diploid (a) and triploid(c) of olive flounder Paralichthys olivaceus and hybrid (b) and allotriploid (d) of female olive flounder and male starry flounder Platichthys stellatus.

잡종 3배체 난발생 및 자어 발달

잡종 3배체의 난발생 과정은 Fig. 2와 같다. 수정란은 구형이며 분리부성란으로 난황과 난막은 무색투명하였다. 저온처리 후 1.5시간에 첫 번째 난할(cleavage)이 이루어져 배반(blastodisc)의 중앙부위가 수직으로 이등분되어 2세포기가 되었고(Fig. 2b), 난할이 계속되어 2시간 후 4세포기(Fig. 2c), 2.5시간 후 8세포기(Fig. 2d), 3.3시간 후 16세포기(Fig. 2e)가 되었다. 계속적인 난할이 일어나 저온처리 후 8시간에 높고 두꺼운 형태의 배반엽(blastoderm)을 형성하는 포배기 중기(mid-blastula)가 되었다(Fig. 2f). 저온처리 후 12시간에 난황 세포가 돔 형태가 되고 배반엽이 얇아지기 시작하였고(Fig. 2g), 13시간에 배환(germ ring)이 형성되었으며(Fig. 2h), 14시간에 배방패(embryonic shield)가 형성되었다(Fig. 2i). 배반엽이 식물극 방향으로 계속 확장되어 저온처리 후 18시간에 60% 피포(epiboly)가 형성되었고(Fig. 2k), 22시간에 90% 피포가 형성되었다(Fig. 2l). Kupffer’s vesicle은 저온처리 후 26시간부터 작은 크기로 관찰되기 시작하여 30시간에 최대 크기로 발생하였고, 35-36시간에 소멸되었으며(Fig. 2m-2o), Kupffer’s vesicle이 소멸된 후 꼬리가 형성되기 시작하여 저온처리 후 53시간에 부화하기 시작하였다(Fig. 2p, 2q).

Fig. 2.External morphology of the egg development stages (a-p) of the allotriploid of female olive flounder Paralichthys olivaceus and male starry flounder Platichthys stellatus, and yolk-sac larvae of the allotriploid (q-s) and triploid olive flounder (t-v). a: Blastodisc formed. b: 2 cell stage, 1.5 h. c: 4 cell stage, 2.0 h. d: 8 cell stage, 2.5 h. e: 16 cell stage, 3.3 h. f: midblastrula stage, 8 h. g: 30% epliboly stage, 12 h. h: germ ring stage, 13 h. i: embryonic shield stage, 14 h. j: 40-45% epiboly stage, 16 h. k: 60% epiboly stage, 18 h. l: 90-95% epiboly stage, 22 h. m: Kupffer's vesicle appearance, 26 h. n: Kupffer's vesicle stage, 30 h. o: Kupffer's vesicle disappearance, 35-36 h. p: pre-hatching, 53 h. q: hatched larva of allotriploid. r: yolk-sac larva of allotriploid, 1 day after hatching. s: yolk-sac larva of allotriploid, 2 days after hatching. t: hatched larva of triploid. u: yolk-sac larva of triploid, 1 day after hatching. v: yolk-sac larva of triploid, 2 days after hatching. Arrows: chromatophores. All scale bars indicate 200 μm.

잡종 3배체 부화 자어의 형태적 특징을 관찰하기 위해 넙치 3배체 부화 자어와 비교한 결과, 잡종 3배체는 넙치 3배체와 동일하게 입과 항문은 열려 있지 않았고, 막지느러미(primordial finfold)의 위쪽과 아래쪽에 색소포(chromatophores)가 관찰되었다(Fig. 2q, 2t). 잡종 3배체 자어의 미부 중앙부 막지느러미내 색소포는 점차 발달하여 부화 1일째 색소포는 그 크기 및 수가 증가하였고(Fig. 2r), 부화 2일째 막지느러미의 색소포는 더 넒은 부위까지 분화되어 색소포 띠를 형성하는 것으로 관찰되었다(Fig. 2s). 넙치 3배체 자어 역시 발생이 진행될수록 미부 중앙부의 막지느러미 내 색소포가 발달하여 색소포의 분포가 넓어지면서 색소포 띠를 형성하였으나(Fig. 2u, 2v), 이는 잡종 3배체의 색소포 분포 부위에 비해 좁은 것으로 관찰되었으며, 그 크기 및 진하기 역시 작고 엹은 것으로 관찰되었다.

수온별 난발생

잡종 3배체와 넙치 2배체 및 3배체의 수온별 난발생은 Table 1과 같다.

Table 1.Embryonic development of diploid olive flounder Paralichthys olivaceus, triploid olive flounder and allotriploid of female starry flounder Platichthys stellatus and male starry flounder at different water temperatures

잡종 3배체의 경우, 첫번째 난할이 이루어지는 2세포기까지 10℃는 저온처리 후 4시간, 14℃는 2시간, 18℃는 1.5시간이 소요되었고, 포배기 중기까지 10℃는 저온처리 후 15시간, 14℃는 10시간, 18℃는 8시간이 소요되었다. 배반엽이 난황을 감싸는 낭배기의 경우 10℃는 저온처리 후 34시간, 14℃는 17시간, 18℃는 13시간에 시작되었으며, Kupffer’s vesicle의 형성 및 소멸은 10℃는 저온처리 후 69시간 및 98시간, 14℃는 35시간 및 53시간, 18℃는 26시간 및 36시간에 관찰되었다. 넙치 3배체와 2배체 또한 3가지의 각 온도조건에서 잡종 3배체와 동일한 시기에 난할, 포배기, 낭배기, Kupffer’s vesicle 형성 및 소멸의 발생이 관찰되었다.

잡종 3배체의 최초 부화는 10℃는 저온처리 후 114시간, 14℃는 75시간, 18℃는 53시간에 시작되었다. 그러나 넙치 2배체와 3배체는 잡종 3배체 보다 각 온도 조건에 따라 최소 2시간에서 최대 7시간 늦게 부화하기 시작하여, 10℃는 121시간, 14℃는 80시간, 18℃는 55시간에 최초의 부화가 관찰되었다.

 

고 찰

생물은 고유한 DNA 양을 가지고 있어 이를 측정함으로써 단시간에 종 고유의 특성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다(Byrappa, 2003). 일반적으로 3배체는 모계 2n DNA 함량과 부계 n DNA 함량을 가지게 된다(He et al., 2013). 본 연구에서도 잡종 3배체는 넙치 2n DNA 함량과 강도다리 n DNA함량을 가지고 있는 것으로 확인되었으며, 넙치 3배체는 넙치 n DNA 함량의 약 3배의 DNA 함량을 가지고 있는 것으로 확인되었다.

저온처리 후 잡종 3배체 수정란을 18±1℃ 수온에서 난발생을 유도 관찰한 결과, 1.5시간 후에 난할기(cleavage period)가 시작되어 8시간 후에 중기 포배기(mid-blastula period), 13시간 후에 낭배기(gastrula period), 26시간 후에 Kupffer’s vesicle이 형성되는 것으로 관찰되었다(Fig 2a-2p). 이들 난할기에서 분할기에 이르는 잡종 3배체의 난발생은 넙치 3배체와 유사한 형태로 발생이 진행되었으며, 그 발생 시간 또한 동일한 것으로 확인되었다(Table 1). 강도다리와 넙치 잡종은 부화시기를 제외한 난발생 시기가 모계로 사용된 넙치와 동일하게 나타나는 것으로 보고된 바 있어(Do et al., 2014), 모계로 사용된 넙치 형질의 영향으로 넙치 3배체와 잡종 3배체가 동일한 시기에 발생하는 것으로 보여진다.

잡종 3배체 난발생 과정 중 초기 난할기에 이형적으로 할구(blastomere)가 형성되어 3 세포기가 관찰되었다. 그러나 이는 You et al. (2001)와 Zhu et al. (2006)가 넙치 3배체의 초기 난할기에 3 세포기 또는 5세포기의 이형적 할구가 형성되는 개체가 있음을 보고한 바 있어, 본 연구에서 관찰된 이형적인 난할 현상은 잡종 유도에 의한 결과가 아닌 3배체 유도과정에서 확인될 수 있는 기형적 발생인 것으로 판단된다.

잡종 3배체는 넙치 3배체와 유사한 형태 및 속도로 난발생이 진행되었으나, 부화 시간 및 부화자어의 형태에서 차이가 나는 것으로 확인되었다(Table 1, Fig. 2). 넙치 3배체는 18±1℃ 수온에서 55시간째에 최초 부화가 시작되었으나, 잡종 3배체는 53시간째에 최초의 부화가 관찰되어 잡종 3배체의 부화가 2시간이 빠른 것으로 확인되었다(Table 1). 이는 동일 수온조건에서 강도다리가 넙치보다 부화시기가 빠른 것으로 보고된 바 있어(Do et al., 2014), 잡종 3배체는 강도다리 형질의 영향으로 넙치 3배체보다 이른 시간에 부화한 것으로 판단된다.

잡종 3배체와 넙치 3배체 부화자어는 막지느러미 내 색소포의 위치 및 분포범위에서 뚜렷한 차이가 나는 것으로 관찰되었다. 잡종 3배체와 넙치 3배체 부화자어 모두 미부 중앙부 막지느러미 위쪽과 아래쪽에 색소포 띠가 관찰되었으나, 잡종 3배체가 넙치 3배체에 비하여 분포범위가 넓고 진한 것으로 확인되었다(Fig. 2q-2v). Byun et al. (2007)은 강도다리 자어의 색소포가 별모양 및 나뭇가지 모양으로 생성되어 점차 몸의 전면에 발달한다고 보고한 바 있다. 이에 잡종 3배체와 넙치 3배체의 색소포 분포 차이는 부계로 사용된 강도다리의 영향에 기인한 것으로 보여진다.

어류의 발생에서 수온은 성장 및 생존에 영향을 미치는 중요한 요인 중 하나로 각 어종은 생태적인 특징에 따라 적정수온을 가지게 되며, 적정 수온 범위 내에서 수온이 높아질수록 발생속도는 빨라지게 된다(Rana, 1990). 강도다리는 냉수성 어종으로 적정수온은 13-18℃이고(NFRDI, 2009), 넙치는 온수성 어종으로 적정 수온은 10-24℃인(NFRDI, 2006) 것으로 보고되고 있다. 이에 잡종 3배체의 적정 수온범위 및 수온별 난발생 속도를 확인하고자 대조군으로 넙치 2배체와 3배체를 사용하여 10, 14 및 18℃ 에서 발생을 비교하였다. 그 결과 3가지 수온 모두에서 잡종 3배체는 정상적으로 발생하는 것으로 확인되었고, 18℃ 발생결과와 동일하게 잡종 3배체는 10℃와 14℃에서도 난할기, 포배기, 낭배기 및 분할기에 이르는 난발생 단계에서 넙치 2배체 및 3배체와 동일한 속도로 발생하는 것으로 관찰되었다. 그러나 You et al. (2001)은 넙치 2배체의 발생이 난할기에 3배체보다 조금 빠른 것으로 확인되나, 발생이 진행될수록 동일한 속도로 발생되며 동일한 시기에 부화한다고 보고한 바 있다. 이는 3배체의 발생을 저온처리 전 수정 시기부터 관찰하여 초기 난할기에 3배체가 2배체보다 발생이 느리게 관찰된 것으로서 저온처리 직후를 발생 시작시점으로 관찰한 본 연구와는 발생 관찰 시작 시점 차이에 의해 동일한 관찰 결과를 다르게 분석한 것으로 판단된다. 그러나 무지개 송어 3배체를 비롯한 어류에서 유도된 3배체 난은 일반적으로 2배체에 비하여 발생이 빠르게 진행되어 부화시간이 단축되는 것으로 이미 보고된 바 있다(Thorgaard, 1986).

잡종 3배체의 부화는 18℃ 발생에서 관찰된 것과 동일하게 10℃ 및 14℃에서도 넙치 3배체보다 5시간 및 2시간 빨리 부화하는 것으로 관찰되어, 수온이 낮을수록 그 부화시간의 차이가 커지는 것으로 확인되었다(Table 1). 강도다리는 10.5℃에서 수정 후 110시간에 최초의 부화되는 것으로 보고된 바 있고(Orcutt, 1950), 본 연구 결과에서 10℃에서 넙치 2배체가 수정 121시간 후에 부화되는 것으로 확인됨으로써, 잡종 3배체는 친어로 사용된 강도다리와 넙치의 중간 형질을 띄게 되어 10℃에서 114시간에 부화한 것으로 판단된다.

일반적으로 잡종의 형질은 대부분 친어로 사용된 두 종의 중간 형질을 나타내는 것으로 보고되고 있다(Garrett, 2005). Yamashita et al. (2014)는 강도다리와 돌가자미(Kareius bicoloratus)의 잡종 유도시 두 종의 중간형질을 나타내는 것으로 확인한 바 있으며, Do et al.(2014)는 넙치와 강도다리 잡종 또한 친어로 사용된 두 종의 중간형질을 나타낸다고 보고한 바 있다. 반면에 잡종 3배체는 친어로 사용된 두 종의 중간 형질을 나타내지만 모계의 형질이 더 많이 나타나는 것으로 보고되고 있다. Hu et al. (2012)는 M. amblycephala와 Xenocypris davidi의 잡종 3배체를 유도한 결과 두 종의 중간 형질을 가지지만 모계의 특징에 가까운 것으로 보고한 바 있고, Park (1992)는 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus)와 미꾸라지(M. mizolepis) 잡종 3배체는 모계로 사용된 미꾸리에 가까운 중간 형질을 가지는 것으로 보고한 바 있다. 본 연구의 넙치와 강도다리 잡종 3배체는 수정란은 모계로 사용된 넙치의 형태를 가지지만, 부화자어는 부계로 사용된 강도다리에 가까운 중간형질을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 난발생 속도의 경우 넙치와 동일한 난발생 속도를 가지는 것으로 나타났으나, 최초 부화시간은 강도다리와 넙치의 중간 형질을 나타내는 것으로 확인되었다. 이에 잡종 3배체는 넙치와 강도다리의 중간 형질을 띄는 것으로 확인되지만, 기존 보고와 동일하게 모계에 가까운 중간 형질을 가지는지 여부를 확인하기 위해서는 자치어의 성장 및 성체의 형태 및 습성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.

넙치와 강도다리 잡종 3배체의 정상적인 발생 및 생존 가능성은 확인되었으나 산업적 가능성을 판단하기 위해서는 성장력, 생식력, 성비 및 친어로 사용된 두 종의 우량 형질 획득 유무 분석 등에 대한 추가적인 연구가 필요하며, 잡종 3배체의 생산력 증대를 위해 연중 산란이 가능한 넙치와 달리 3월-6월까지만 확보 가능한 강도다리 정자의 냉동보존 등의 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것이다.