Cloning and Characterization of Phosphomannomutase/Phosphoglucomutase (pmm/pgm) Gene of Vibrio anguillarum Related to Synthesis of LPS

Lipopolysaccharide 생합성에 관여하는 Vibrio anguillarum의 phosphomannomutase/phosphoglucomutase 유전자 cloning과 특성

Abstract

The phosphomannomutase/phosphoglucomutase gene (pmm/pgm) of Vibrio anguillarum (the causative agent of fish vibriosis) was cloned, and the open reading frame corresponded to a protein with 446 amino acids. The pmm/pgm gene showed a significant degree of sequence homology with the previously reported genes from V. mimicus, V. vulnificus, V. splendidus, and V. harveyi, with 92.3%, 91.4%, 89.9%, and 89.9% amino acid identity, respectively. By reverse transcriptase-polymerase chain reaction, we found that the pmm/pgm gene was upregulated under cold stress condition. The PMM/PGM protein is known to catalyze the interconversion between mannose-1-phosphate and mannose-6-phosphate or glucose-1-phosphate and glucose-6-phosphate, which are important intermediates for lipopolysaccharide (LPS) biosynthesis. To confirm the role of PMM/PGM in the LPS biosynthetic pathway, we constructed a knock out mutant by homologous recombination. The respective LPSs were isolated from the V. anguillarum wild-type and mutant strains, and changes were compared by subjecting them to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Based on the different patterns of the LPSs, we expect the pmm/pgm gene to have an important role in LPS biosynthesis. The pmm/pgm-deficient mutant of V. anguillarum will contribute to further studies about the role of LPS in V. anguillarum pathogenesis.

수해양성 병원성 미생물로 알려진 Vibrio anguillarum으로부터 mannose-1-phosphate를 mannose-6-phosphate, glucose-1-phosphate를 glucose-6-phosphate로 가역적으로 변환시키는 phosphomannomutase/phosphoglucomutase (pmm/pgm)의 유전자를 sequencing하여 1338 bp의 open reading frame (ORF)을 밝혔다. 이는 446개의 아미노산을 포함하며 47,625 Da을 가지고 있다. 보고된 다른 Vibrio sp.의 pmm/pgm 유전자와 상동성을 비교하였을 때 V. mimicus V. vulnificus, V. splendidus, V. harveyi와 92.3%, 91.4%, 89.9%, 89.9%에 해당하는 상동성을 지니고 있었다. 증폭된 목적 유전자를 pET-28a(+) vector에 연결하여 대장균에서 단백질의 대량발현을 유도하였으며 이는 주로 soluble한 상태로 나왔다. Soluble fraction을 Ni-NTA column chromatography로 정제하여 약 50 kDa의 단백질을 얻었고 이는 주로 mannose-1-phosphate를 이용하는 효소로 확인되었으며 Mg²⁺ 이온이 존재할 때 효소의 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구의 유전자는 낮은 온도의 stress하에서 발현이 증가됨을 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)을 통해 확인하였고, 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의한 돌연변이 균주 제작을 통해 PMM/PGM protein과 lipopolysaccharide (LPS)의 생합성과의 관계를 규명하였다. V. anguillarum wild type과 mutant로부터 LPS를 분리하였고 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)후 silver staining을 통해 LPS의 high molecular weight (HMW) 부분인 O-antigen에서의 변화를 확인하였다. 또한 V. anguillarum wild type과 mutant의 growth와 viability를 확인한 결과 mutant가 wild type보다 정지기까지 더 낮은 생육을 보였으며 viability가 감소함을 확인하였다. 본 연구를 통하여 V. anguillarum의 pmm/pgm 유전자가 미생물의 생육과 LPS 생합성에 관여하고 있음을 알 수 있었다.

서 론

Vibrio anguillarum은 해수에서 살아가고 있는 굴, 대합 등의 패류와 갑각류 및 어류에 vibriosis라고 불리우는 치명적인 출혈성 패혈증을 일으키는 원인균으로 알려져 있다[1, 10]. 특히 전세계적으로 양식어류에 감염 시 치명적인 경제적 손실을 일으키기도 하는 것으로 보고되고 있다[4, 5]. 인체에 피해를 주는 대표적인 비브리오 균들인 V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulificus의 감염경로 및 감염기작은 덜 알려져 있다. V. anguillarum이 자연 환경으로부터 감염체로 들어가게 되면 숙주생물의 면역체계, 온도, pH 등의 생육하기에 매우 어려운 조건에 노출되게 된다[4]. Gram 음성 세균이 환경스트레스에 가장 먼저 반응하게 되는 부분은 lipopolysaccharide (LPS)로서 숙주체내에서 감염과정 중 면역체계로부터의 방어, 내독소, 조직에의 흡착성 증대 등을 포함한 감염경로의 초기 단계부터 LPS가 밀접하게 관여하고 있는 것으로 알려져 있다[2, 6, 11, 13−17, 20, 21, 28]. V. anguillarum의 LPS도 outermembrane의 주요성분으로서 다른 gram 음성 세균처럼 친수성 carbohydrate 부분과 소수성 lipid A로 구성되어 있다[22, 23]. Carbohydrate는 core 영역과 O-antigen polysaccharide를 함유하고 있으며 polysaccharide의 형태와 길이는 생육조건에 따라 변화하고 있는 것으로 보고되고 있다[3, 26].

LPS의 생합성 과정에 중요한 역할을 하는 효소로는 phosphomannomutase/phosphoglucomutase (PMM/PGM)가 보고되고 있다[24]. PMM/PGM은 glucose-6-phosphate (G-6-P)를 glucose-1-phosphate (G-1-P) 또는 mannose-6-phosphate (M-6-P)를 mannose-1-phosphate (M-1-P)로 전환시키는 효소로써 UDP-glucose나 GDP-mannose의 생합성에 필수적이다[9, 19] (Fig. 1). G-1-P는 glucose 또는 galactose의 분해 과정 중에 생성되는 중간대사 산물로서뿐만 아니라 LPS의 core 영역의 생합성에 필요한 sugar nucleotide들의 전구체로 알려져 있다. G-6-P는 phosphoglucose isomerase (PGI)에 의해 fructose-6-phosphate (F-6-P)를 생성하게 되며 F-6-P는 phosphomannose isomerase (PMI)에 의해 mannose-6-phosphate (M-6-P)를 생성한다. M-6-P는 Pseudomonas aeruginosa처럼 alginate를 생성하는 균에서 alginate 생합성에 사용되는 매우 중요한 전구체로 알려져 있다. 지금까지 다수의 세균에서 PMM/PGM에 대한 보고가 있었으며 본 연구실에서는 Vibrio에서는 처음으로 V. furnissii에서 pmm/pgm 유전자에 대해 보고한 바 있다[8]. 본 연구에서는 어패류 병원성 Vibrio균인 V. anguillarum의 pmm/pgm유전자를 분리하여 염기서열을 밝히고 대장균에서 재조합 단백질을 정제하여 효소 특성을 측정하였으며 염색체 상에서 pmm/pgm 유전자를 deletion시켜 pmm/pgm 유전자가 LPS 생합성에 어떠한 영향을 주고 있는지를 살펴보았다.

Fig. 1.Biosynthetic pathway of the formation of LPS. GK: glucose kinase; G-6-P: Glucose-6-phosphate; G-1-P: Glucose-1-phosphate; UDP-Glu: UDP-glucose; PGI: Phosphoglucose isomerase; PMI: Phosphomannose isomerase; F-6-P: Fructose-6-phosphate; M-6-P: Mannose-6-phosphate; M-1-P: Mannose-1-phosphate; GDP-man: GDP-mannose.

 

재료 및 방법

균주 및 배양 조건

본 연구의 돌연변이 균주 제작을 위한 parent strain으로 V. anguillarum O1 wild type strain을 사용하였으며 cloning host strain의 Escherichia coli 균주로 DH5α,BL21(DE3), SM10λpir를 사용하였다(Table 1). pET-28a(+)는 cloning vector로 사용하였고 suicide vector인 pNQ705는 knock out mutant 제작을 위한 vector로 사용하였다. V. anguillarum O1 wild type의 경우 Brain Heart Infusion (BHI) 배지(Difco)에 접종하여 25℃에서 배양하였고 E.coli DH5α와 BL21(DE3) strain은 Luria-Bertani (LB) 배지에 접종하여 37℃에서 배양하였으며 E. coli SM10λpir는 kanamycin (100 μg/ml), pNQ705, pET-28a(+)는 chloramphenicol (10 μg/ml)를 첨가하여 37℃에서 배양하였다.

Table 1.Strains and plasmids used in this study.

pmm/pgm 유전자 분리

V. anguillarum O1의 pmm/pgm 유전자의 증폭을 위하여 V. vulnificus CMCP6, V. fischeri MJ11의 pmm/pgm 유전자들의 서열을 비교하여 유사도가 높은 부분을 이용하여 universal primer (forward: 5'- CTT GGC TGG GCT GCA GGW CRW GTW TTA G -3', reverse: 5'- GCA GYA KTC TTT CAC TGC WTS YGC -3')를 제작하였다. 제작된 universal primer를 이용하여 다음과 같은 조건에서 thermal cycler (2720 Thermal cycler; Applied Biosystems, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조성은 DNA template 5 μl, 10X PCR buffer (15 mM MgCl2 포함) 5 μl, dNTP mix (dATP, dCTP, dTTP, dGTP, 각각 10 mM) 4 μl, 5 unit/ μl Taq DNA polymerase (Takara, Japan) 0.25 μl, 10 pmol forward primer 2 μl, 10 pmol reverse primer 2 μl이며, 최종 용액은 50 μl가 되도록 하였다. 94℃에서 5분간 predenaturation 후 denaturation: 94℃ 30초, annealing: 55℃ 30초, extension: 72℃ 30초로 30 cycle 수행후 final extension은 72℃에서 7분간 수행하였다.

염기서열 분석 및 3차원 구조 예측

PCR 산물의 염기서열 분석을 위하여 ABI 3730xl 96-capillary DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하였으며 목적 유전자의 open reading frame (ORF)를 구하고자 5'과 3'쪽의 염기서열은 DNA Walking SpeedUP Premix Kit (Seegene, Korea)를 사용하였다. 염기서열의 분석에는 European Bioinformatics Institute (EBI)의 Clustal W를 이용하였다. 다중 정렬된 염기서열 matrix는 BioEdit를 이용하여 편집하였고, 동일 프로그램의 sequence identity matrix를 이용하여 다른 Vibrio 종들과의 유사도를 계산하였다. PGM/PMM 아미노산 서열의 3D 구조는 SWISS-MODEL(http://www.expasy.org/swissmod/)를 통해 예측하였다.

Total RNA 추출 및 cDNA 합성

Trizol Reagent (Invitrogen, USA)을 사용하여 Total RNA를 추출하였고 DNaseI (Takara, Japan)을 첨가하여 정제된 RNA를 얻었다. cDNA는 추출된 total RNA를 주형으로 하여 RT-PCR (Promega, USA)를 이용하여 합성하였으며 합성된 cDNA는 −20℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다.

재조합 단백질 PMM의 발현 및 정제

pmm/pgm 유전자의 증폭을 위하여 forward: 5'- GGCC CATATG TCT GAC AAA AGA CGT TAC -3', the NdeI site is underlined; reverse: 5'- GGCC GGATCC GCA ATT ATC TTT AAC CGC TTG-3', the BamHI site is underlined)으로 같은 조건으로 동일한 thermal cycler를 사용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 산물을 NdeI-BamHI을 사용해 타겟 유전자와 pET-28a(+)를 enzyme digestion 한 후 ligation시켜 E. coli BL21(DE3)에 transfromation하였다. Kanamycin 100 μg/ml이 포함된 LB 액체배지를 이용하여 형질전환된 E. coli를 37℃에서 배양하면서 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 1 mM을 첨가하여 4시간동안 37℃에서 단백질 발현을 유도하였다. 그 후 배양액을 4℃의 원심분리기에서 3,900 × g으로 원심분리하여 얻은 cell을 50 mM Tris-HCl buffer (pH8.0)에 현탁 후 초음파분쇄기로 파쇄하여 4℃의 원심분리기에서 9,700 × g으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 회수하였다.

PMM과 PGM 효소활성 측정

PMM과 PGM의 효소활성 측정은 Köplin 등[9]의 방법에 따라서 수행하였다. PMM 활성 측정을 위한 반응액의 조성은 MOPS (morpholinepropanesulfonic acid) buffer (pH7.6), 1 mM mannose-1-phosphate, 20 mM MgCl2, 1.0mM NADP, 0.075mM glucose 1,6-bisphosphate, 0.7 unit glucose-6-phosphate dehydrogenase, 1 unit phosphoglucose isomerase, 1 unit phosphomannose isomerase이며 PGM활성측정을 위한 반응액의 조성은 MOPS (morpholine propanesulfonic acid) buffer (pH7.6), 1 mM glucose-1-phosphate, 20mM MgCl2, 1.0mM NADP, 0.075mM glucose 1,6-bisphosphate, 0.7 unit glucose-6-phosphate dehydrogenase이다. NADP의 감소량은 반응액(1 ml)와 rPMM (100 μl)를 반응시키고 15분후 UV-spectrophotometer로 340 nm 파장에서 흡광도의 증가량으로 확인하였다. 효소활성 1 unit은 분당 1 μmol의 NADP를 감소시킬 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.

pmm/pgm:: pNQ705 mutant 제조

V. anguillarum의 pmm/pgm 유전자의 돌연변이 균주의 제조는 Kim 등의[8] 방법을 사용하였다. 유전자의 deletion을 위하여 370 bp의 목적 단편의 증폭에 사용된 primer는 다음과 같이 forward primer (5'- GGCC GCTGAC GCT GAA AAT CGT CGT TGA -3', the SalI site is underlined)와 reverse primer (5'- GGCC TCTAGA ACC TAA CTG CTT TAA GC -3', the XbaI site is underlined)를 사용하였다. PCR을 행한 후에 얻어진 PCR 산물은 suicide vector인 pNQ705 plasmid에 ligation 하여 conjugal donor인 E. coli SM10λpir에 transformation하고 이를 V. anguillarum wild type과 접합시켜 mutant를 제작하였다. LB 고체배지에서 8시간 이상 배양 후 자란 균주들을 취하여 chloramphenicol 10 μg/ml이 포함된 TCBS (Thiosulfate Citrate Bille Salt Sucrose) agar plate에 도말한 후 노란색으로 자라는 균을 선택하여 목적으로 하는 pmm/pgm 유전자의 결손을 확인하였다. 결손 Selectable marker를 이용하여 확인된 conjugant가 돌연변이 균주임을 확인하기 위해 Table 2의 primer를 사용하여 V. anguillarum wild type과 mutant의 chromosomal DNA를 주형으로 PCR를 수행하였다.

Table 2.PCR primers used in this study for checking pmm/pgm mutant.

LPS 분리 및 SDS-PAGE

Crude LPS는 hot phenol/water method를 이용하여 분리하였다[29]. V. anguillarum 야생형과 돌연변이를 BHI 액체배지에 18시간 배양한 뒤 얻어진 cell을 50 mM sodium phosphate buffer (pH7.0, 5 mM EDTA 포함)에 현탁하고 lysozyme 100 mg을 첨가하였다. 계속해서 4℃에서 12시간 교반하였고 37℃에서 20분간 incubation하였다. MgCl2를 20 mM 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응하였다. 동일부피의 90% hot phenol과 섞은 후 68℃에서 30분간 반응 후 15분 냉각하였고, 냉각된 시료를 원심분리(4℃, 9,700 × g, 20 min) 하여 상층액을 회수하고 48시간 동안 증류수에 투석하였다. 샘플은 5 × sample buffer (2% sodium dodecyl sulfate, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 25% glycerol, 0.1% bromophenol blue)와 혼합해 주었고 10분간 끓인 후 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 통해 전개시켰다. 이후 silver staining kit (Biosesang, Korea)를 사용하여 염색후 LPS를 확인하였다.

 

결과 및 고찰

염기서열 및 아미노산 서열 분석

PCR 산물을 사용하여 염기서열을 밝힌 결과 ORF는 1,338 bp로 구성되었고 아미노산은 446개를 포함하고 있었으며 이같은 아미노산 서열로부터 계산된 단백질의 분자량은 47,625 Da을 가지고 있는 것으로 생각되었다. Genbank에 있는 다른 Vibrio sp.의 pmm/pgm 유전자와 상동성을 비교하였을 때 V. mimicus, V. vulnificus, V. splendidus, V. harveyi와 각각 92.3%, 91.4%, 89.9%, 89.9%의 상동성을 가지고 있었다(Fig. 2). Vibrio sp.에서 보고된 PMM/PGM의 아미노산 서열내에는 3군데의 functional domain들이 있는 것으로 보고되고 있는데 phosphate의 전달에 필요한 활성부위는 102−106번째의 ASHNP 서열에 해당된다. 모든 Vibrio sp.의 PMM/PGM은 같은 아미노산 서열을 보여주고 있다. 아미노산서열 242−247번째 아미노산 서열(DGDGDR)은 metal binding site로 알려져 있으며 효소활성을 위해서 Mg2+ ion이 결합하고 있는 영역이며 아미노산 서열 225−230 (AENSGH)은 기질인 당에 결합하는 부위로 알려져 있는데 아미노산 서열을 확인한 결과 V. anguillarum의 PMM/PGM내에도 이같은 3영역이 잘 보존되고 있는 것으로 나타났다(Fig. 2). PMM/PGM은 4개의 domain으로 구성되어 있으며, 그 중 domain1-3은 4개의 β-sheet와 2개의 α-helix를 가지는 Vibrio들간에 매우 유사한 구조를 가지고 있었다. 효소의 활성부위는 domain1에 존재하고 있으며 3차 구조에서 중심부에 위치하고 있다. Metal binding site와 sugar binding site는 각각 domain2, domain3에 존재하고 있는 것으로 나타났다(Fig. 3).

Fig. 2.Comparison of amino acid sequences of PMM/PGM of Vibrio species. The sequences were aligned with the program BioEdit.

Fig. 3.Prediction of three-dimensional structure and schematic illustration of PMM/PGM. (A) Metal binding site is located between 242−247, sugar binding site is located between 225−230, active site is located between 102-106. (B) PMM/PGM is composed by 446 amino acids and is structured into four domains.

대장균에서의 발현, 단백질 정제 및 효소활성

V. anguillarum의 genomic DNA로부터 증폭된 pmm/pgm 유전자를 대량발현 vector인 pET-28a(+)의 NdeІ과 BamHІ site에 결합시켜 대량발현을 유도하였다. Fig. 4에서처럼 발현된 단백질은 세포내에서 insoluble 형태보다는 soluble한 상태로 더 많이 존재하고 있었으며 soluble fraction만을 얻어 Ni-NTA column chromatography로서 정제한 결과 약 50 kDa의 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 단백질을 사용하여 2가지의 다른 기질인 mannose-1-phosphate와 glucose-1-phosphate에 대한 효소활성을 측정한 결과 1 mg의 효소에서 mannose-1-phosphate에 대한 specific activity가 glucose-1-phosphate에 대한 specific activity보다 약 1.8배 높은 것으로 나타났다(Table 3). 이와 같은 결과는 아마도 이 효소가 대사과정에서 주로 mannose-1-phosphate를 이용하는 효소로 생각되었다. 그러나 glucose-1-phosphate도 이용할 수 있는 것으로 나타나 LPS 생합성에 주요하게 작용하고 있을 것으로 예상되었다. PMM/PGM은 metal binding site를 가지고 있으며 Mg2+ ion이 결합하고 있는 것으로 알려져 있다[27]. 정제된 본 효소의 경우에도 Mg2+ ion이 존재 했을 때 효소활성을 보여주었고 존재하지 않을 때는 효소활성을 전혀 보여주지 못했다.

Fig. 4.SDS-PAGE of recombinant PMM/PGM. Lane 1, standard molecular weight proteins; Lane 2, crude extract of cells transformed with pET-28a(+) vector; Lane 3, cell harboring for 4 h after induction; Lane 4, soluble proteins ; Lane 5, insoluble proteins; Lane 6, eluted fraction from a Ni-NTA affinity chromatography.

Table 3.PMM and PGM activity.

생육온도에 따른 pmm/pgm 유전자의 전사

V. anguillarum은 25℃를 생육 최적온도로 가지고 있는 세균이다. 본 실험에서는 25℃와 15℃에서 생육한 V. anguillarum의 pmm/pgm 유전자의 mRNA 생성을 RT-PCR로 분석해 본 결과 Fig. 5에서처럼 pmm/pgm 유전자는 15℃에서 오히려 더 높은 mRNA 생산량을 보여주고 있다. 이러한 결과는 V. anguillarum을 온도, pH, NaCl 등이 다른 stress 조건하에서 배양하여 생육 최적온도인 50℃보다 단백질 2D 분석을 행하여 나타난 Kim등의 결과에서도 25℃보다는 15℃에서 PMM/PGM 단백질의 생성이 높았다는 연구 결과와도 일치하는 것으로 나타났다[7]. 이와 같은 결과는 V. anguillarum이 최적 생육온도보다 낮은 온도의 환경에 노출되었을때 phospho-hexose의 대사를 더욱 촉진하여 LPS의 생합성을 촉진시키는 것으로 추측되었고 LPS 합성을 더욱 증가시켜 외부환경의 stress에 저항하는 것으로 생각되었다.

Fig. 5.V. anguillarum gene expression profiles : pmm/pgm gene and 16S rRNA as internal control gene.

pmm/pgm 유전자 deletion

pmm/pgm 유전자의 deletion이 LPS 합성에 영향을 미치고 있는지 또는 생육에 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 pNQ705 suicide vector를 사용하여 deletion mutant를 얻었고 PCR로 확인한 결과 염색체상의 pmm/pgm 유전자내로 suicide vector가 삽입되어 결손이 일어났음을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 야생주와 변이주를 배양 후 LPS를 분리하여 분석한 결과, mutant의 LPS가 야생주의 LPS와는 다른 형태를 보여주고 있었다. Fig. 7에서처럼 분자량이 작은 부위에 나타나는 core 영역(B 부분)은 야생주와 별다른 차이점이 없었으나 분자량이 큰 부위에서는(A 부분) 야생주와는 많이 다른 형태를 보여주고 있는데 이 부위는 LPS의 O-antigen polysaccharide의 band가 나타나는 곳이다[18]. 이와같은 결과는 본 연구팀에서 V. furnissii에서 PMM/PGM 효소가 LPS의 O-antigen polysaccharide의 생합성에 직접 관여하고 있다고 보고한 결과[8]와 P. aeruginosa를 사용한 연구결과[30]와 같은 전기영동 패턴으로 나타나고 있어 본 연구에서 분리한 pmm/pgm 유전자는 V. furnissii, P. aeruginosa처럼 O-antigen polysaccharide의 생합성에 관여하고 있음을 알 수 있었다. 불완전한 LPS를 생산하는 균이 최적 생육온도에서 생육수준이 변화하는지를 알아본 결과 Fig. 8에서 보는 것처럼 pmm/pgm 결손변이주가 야생주에 비해낮은 생육을 보여주고 있었다. 이와 같은 결과는 Brucella abortus의 pgm mutant나 V. cholerae의 LPS 생합성 유전자의 하나인 wbeW mutant에서 O-antigen polysaccharide의 결손이 cell 의 생존을 낮게하여 생육에 매우 중요한 역할을 하고 있다는 연구결과와 같은 경향을 보여주고 있었다[27]. Bordetella bronchiseptica의 O-antigen deficient mutant의 경우 인간의 폐조직 상피세포에 부착하는 능력이 매우 떨어지고 host의 면역방어 시스템에 더 많이 공격을 당해 야생주보다 현저히 낮은 병원성을 나타내고 있음이 보고되고 있다[25]. Kim 등[8]도 V. furnissii의 O-antigen polysaccharide의 생합성이 불완전하게 일어난 pmm/pgm deletion mutant에서도 생육과 동물생체에서 매우 낮은 병원성을 보여주는 결과를 보고하고 있어 V. anguillarum에서도 병원성 인자로 알려진 LPS를 정상적으로 생합성하지 못하는 pmm/pgm deletion mutant도 어류체내에서의 병원성 감소를 보일 것으로 예상하고 있으며 이에 대한 병원성 연구는 현재 진행 중에 있다.

Fig. 6.Agarose gel electrophoresis of PCR products from pmm/pgm knock out mutant by PCR using the primers; forward primer for construction knockout mutant, pNQ705 rp-I and pNQ705 rp-II. M, molecular weight marker; Lane 1, Wild type; Lane 2, PCR products of the mutant using primers forward primer for construction knockout mutant and pNQ705 rp-I; Lane 3, PCR products of the mutant using primers forward primer for construction knockout mutant and pNQ705 rp-II.

Fig. 7.Silver stained LPS profiles of V. anguillarum O1 wild strain (lane 1) and pmm/pgm mutant (lane 2). A: O-antigen region; B: core-lipidA region.

Fig. 8.Growth of V. anguillarum O1 wild-type (■) and the pmm/pgm mutant (▲).