다엽의 5가지 페놀성분과 R-(-)-carvone의 치아우식균 Mutans Streptococci에 대한 항균력 상승효과

Antimicrobial synergism of Camellia sinensis-isolated five phenol compounds and R-(-)-carvone against mutans streptococci

Abstract

Objectives : Camellia sinensis (Theaceae) possesses a various beneficial effects such as free radical-scavenging, inactivation of urokinase in cancer cell proliferation, antibacterial, and hypotensive. Dental caries is one of the most common oral infectious disease in a human. Oral microorganisms play a significant role in the etiology of dental caries. An aberration to this ecology due to dietary habits, improper oral hygiene or systemic factors lead to an increase in cariogenic microorganisms. Cariogenic microorganisms like Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus encourage the accumulation and adherence of plaque biofilm by metabolizing sucrose into glucans. The purpose of this study was to investigate the antimicrobial activity of phenolic compounds of Camellia sinensis and R-carvone, monoterpenes, is can be found naturally in numerous essential oils, on Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus .Methods : The antimicrobial activity of these compounds was determined by the broth microdilution method and checkerboard dilution assay to investigate the potential synergistic effects of each five compounds of Camellia sinensis (C. sinensis) and R-carvone.Results : C. sinensis-isolated compounds and R-carvone were determined with MIC of more than 1,000 ㎍/mL. However, the combination test showed significant synergism against S. mutans and S. sobrinus, implicated in the lowered MICs.Conclusions : These results suggest that combinatory application of phenolic five compounds (theophyllin, l-theanine, epicatechin, epicatechin gallate, and caffeine) from C. sinensis and R-carvone has a potential synergistic effect and thus may be useful as a mouthrinse in helping control cariogenic microorganism.

Ⅰ. 서 론

다엽은 차나무과 (Theaceae) 에 속하는 다년생 식물 차(茶)나무 Camellia sinensis L. 의 잎이다. 생엽 은 수분이 75%이고 주요 성분으로는 폴리페놀, 아미노산, 탄수화물, 비타민 등이 있다1). 찻 잎의 약리작용은 항암, 항산화, 콜레스테롤 억제, 중추신경 흥분, 관상혈관 확장, 이뇨(利尿) 및 다량의 탄닌계열 성분으로 인한 항균 및 항바이러스 효과 등이 알려져 있으며, 녹차의 떫은 맛을 내는 카테킨(catechin)은 체내에 축적된 중금속 등의 독성물질을 배출시켜주는 해독작용을 가지고 있다2-3).

다엽의 성분 중 theophylline은 평활근을 이완시켜 기관지 천식이나 담산통(膽疝痛)에 이용하고, 이뇨시키는 작용이 있다4-5). 아미노산의 일종인 l-theanine은 GABA를 증가시켜 마음을 안정시키고 수면의 질을 향상시켜주는 기능을 한다6).

Fig. 1.Theophylline

Fig. 2.L-theanine

녹차에 함유되어 떫은 맛을 내는 탄닌(tannin)은 폴리페놀 (polyphenol) 성분으로 주된 구성 요소는 카테킨류이다. 건조된 녹차에 있는 성분의 30%를 차지하며 수렴(收斂), 해독, 살균 및 방부(防腐) 등의 작용이 있으며 항산화, 콜레스테롤 억제, 지방흡수억제, 혈압강하(血壓降下), 항알러지 등의 생리활성 기능이 있다7-8). 녹차에 함유된 폴리페놀의 대표적인 4가지 카테킨(catechin)은 epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin, epigallocatechin gallate가 있다.

Fig. 3.Epicatechin

Fig. 4.Epicatechin gallate

전체 차 무게의 3% 정도만을 차지하는 caffeine은 중추신경을 흥분시키고 사고력을 높이며 피로를 없애주는 효과가 있다9).

Fig. 5.Caffeine

녹차에는 가용성 불소(F)가 풍부하게 함유되어 있어 충치를 예방하고 구강 치석을 일으키는 Streptococcus mutans의 성장을 억제하며, 탄닌의 항균작용과 플라보놀(flavonol)성분의 구취제거 효과로 인해 치은염(齒齦炎)과 충치를 예방할 수 있다10-11).

카르본(carvone)은 광학이성질체의 테르페노이드(terpenoid)계 정유 성분으로 두 종류의 분자 구조를 가지고 있다. 그 중 R-(-)-carvone은 스피아민트 향이 나며, 다른 물질 S-(+)-carvone은 캐러웨이(caraway) 향이 난다12-13). 스피아 민트(학명: Mentha Spicata L.) 정유의 주 활성성분인 R-(-)-carvone은 감미제 및 향료로 사용되고 있으며, 강력한 항경련(鎭痙)효과와 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 항균활성이 있는 것으로 보고되어 있다14-15).

Figure 6.R-(-)-carvone

치아우식증(齒牙齲蝕症, dental caries)은 석회화(石灰化) 조직의 일부가 용해되고 파괴되는 감염성 세균 질환으로써 세균, 음식물, 타액 등 여러 가지 요소들이 동시에 작용하여 일어나는 다인성 질환이다16). Streptococci 균주는 구강 내 상재균으로 치아우식증을 유발하는 세균은 크게 mutans streptococci와 lactobacilli가 주를 이루는데, 주요원인균인 mutans streptocococci에서는 Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus가 있으며 lactobacilli와 일부 다른 세균들은 치아우식증의 진행에 관여하는 것으로 알려져 있다. Mutans streptococci는 치아우식증의 개시 뿐 아니라 우식의 진행에도 중요한 세균으로 인식되고 있다17-18). 그 중에서도 가장 먼저 군집을 이루는 세균인 Streptococcus mutans (S. mutans)는 치아표면의 획득피막(acquired pellicle)에 부착한 후 glucosyltransferase (GTase, 글루코실 전달효소) 및 fructosyltransferase (프럭토실 전달효소)와 같은 당전이 효소를 생산하여 당류로부터 불용성 glucan을 합성한다. 합성된 glucan은 치면에서 증식하는 세균간의 결합을 증가시키며, 이렇게 하여 치면에 부착한 세균들이 음식물로부터 당(sucrose)을 분해하여 유기산을 생성함으로써 치아의 무기질이 용해되어 치아우식증을 유발시킨다19-20).

치아우식증 예방에 관한 연구로써 GTase 합성저해제, 치아우식 유발균인 S. mutans의 생육을 억제하는 항균제재 등의 연구가 진행되고 있으며21-22), 특히 녹차, 우롱차, 홍차, 구아바, 알로에, 대황 등의 천연물을 대상으로 한 항균물질의 효과 등이 보고되고 있다23-27). 현재 주로 사용되고 있는 chlorohexidine은 강력한 항균력이 있는 반면 치아 착색과 구강 점막상피의 손상을 일으키며, penicillin, erythromycin, tetracycline과 같은 항생제는 치아착색, 소화기 장애 및 과민반응 등의 부작용을 나타내고 있다16,22). 치아우식증을 예방하기 위해 항균제 및 면역억제제 사용 등의 방법이 있으나 기회감염에 따른 내성균주와 부작용을 동반하여 이를 극복할 수 있는 방법의 일환으로 천연물질로부터 부작용이 없고 지속적 사용이 가능한 충치예방물질을 개발하려는 노력이 시도되고 있다28).

본 연구는 치아우식증 치료제 개발을 위한 전 단계로써 다엽의 성분과 방향성 정유성분인 R-carvone의 병용이 치아우식증의 주 원인균인 S. mutans와 S. sobrinus에 대한 항균활성이 있음을 확인하고 이를 통해 치아우식증을 예방하는 제제로써 이용 가능성을 제시하고자 한다.

 

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

1) 시약

Theophyllin, L-theanine, epicatechin, epicatechin gallate, caffeine 각각의 성분은 Sigma-aldrich (St. Louis, USA)로부터, R-(-)-carvone은 TCI (Tokyo Chemical Industry Co., LTD)로부터 구입하였다. Brain-Heart Infusion (BHI) (Becton, Dickinson and company)은 배지로써 사용하였다.

2) 균주

본 실험에 사용한 균주 Streptococcus mutans [KCOM 1116, KCOM 1136]와 Streptococcus sobrinus [KCOM 1157, KCOM 1221]는 한국구강미생물자원은행 (Korean Collection for Oral Microbiology, KCOM)에서 구입하였다.

각각의 균주들은 –79℃ deep freezer에서 보관하고, Brain-Heart Infusion agar(BHI agar)에 도말하여 37℃ incubator에서 24시간 배양하였다.

2. 방법

1) 최소억제농도

최소억제농도는 배지 미량 희석법(broth microdilution method)을 통해 측정하였다29-30). 각 성분들을 Brain Heart Infusion (BHI)를 이용하여 약물을 순차적으로 희석하였고, 여기에 탁도 0.5 McFarland 1.5 × 108 CFU/mL을 기준으로 10 ㎕ 접종하여 최종적으로 1.5 × 105 CFU/well이 되게 하였다. 다음으로 37℃ incubator에서 18시간 배양한 후에 미생물이 증식되지 않는 가장 낮은 약물의 농도를 MIC로 측정하였다.

2) 약물병용효과

두 약물의 병용효과를 보기위해 checkerboard dilution 법을 이용하였다. 5가지 차성분과 정유성분인 R-carvone을 농도별로 병용하였을 때 항균효능의 변화를 통해 FICI (Fractional inhibitory concentration index)를 측정하였다31).

FICI 산출기준은 다음과 같다.

Fractional inhibitory concentration index (FICI)

= FICA+FICB = A/MICA+B/MICB

(A: 병용한 A약물의 농도, MICA: A약물의 MIC)

FICI≤0.5, synergy; 0.54.0, antagonism을 따른다. 따라서 이들의 범위에 따라 두 항균물질의 시너지효과를 측정하였다.

3) 통계분석

실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차 (SEM)를 구하여 그 유의성은 Student’s t-test 분석법을 이용하여 신뢰 수준 95% (p < 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.

 

Ⅲ. 결 과

1. 최소억제농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC)

다엽의 5가지 성분의 S. mutans와 S. sobrinus에 대한 최소억제농도(MIC)는 1,000 ㎍/mL 이상이었다. R-carvone은 1,000~2,000 ㎍/mL의 최소억제농도를 나타냈다.

Table 1.TP, theophylline; LT, L-theanine; EC, epicatechin; ECG, epicatechin gallate; CF, caffeine.

2. 약물병용효과 (Fractional inhibitory concentration, FIC)

1) Theophyllin과 R-carvone의 병용효과

Theophyllin (TP)과 R-carvone (R-car)의 병용 시 최소억제농도는 각각 8~64배, 4~32배 감소하였으며, FICI 0.04~0.27의 시너지효과를 나타냈다.

2) L-theanine과 R-carvone의 병용효과

L -theanine (LT)과 R-carvone (R-car)의 병용 시 최소억제농도는 각각 8~64배, 4~32배 감소하였으며, FICI 0.05~0.27의 시너지효과를 나타냈다.

3) Epicatechin과 R-carvone의 병용효과

Epicatechin (EC)과 R-carvone (R-car)의 병용 시 최소억제농도는 각각 16~64배, 2~32배 감소하였으며, FICI 0.09~0.52의 시너지효과를 나타냈다.

Table 2.Results of the combination of theophylline (TP) and R-carvone (R-car) against S. mutans (KCOM 1116 and KCOM 1136) and S. sobrinus (KCOM 1157 and KCOM 1221).

Table 3.Results of the combination of l-theanine (LT) and R-carvone (R-car) against S. mutans (KCOM 1116 and KCOM 1136) and S. sobrinus (KCOM 1157 and KCOM 1221).

Table 4.Results of the combination of epicatechin (EC) and R-carvone (R-car) against S. mutans (KCOM 1116 and KCOM 1136) and S. sobrinus (KCOM 1157 and KCOM 1221).

4) Epicatechin gallate와 R-carvone의 병용효과

Epicatechin gallate (ECG)와 R-carvone (R-car)의 병용시 최소억제농도는 각각 16~128배, 2~64배 감소하였으며, FICI 0.03~0.52의 시너지 및 부분적 시너지효과를 나타냈다.

5) Caffeine과 R-carvone의 병용효과

Caffeine (CF)과 R-carvone (R-car)의 병용 시 최소억제농도는 각각 8~64배, 4~32배 감소하였으며, FICI 0.04~0.28의 시너지효과를 나타냈다.

Table 5.Results of the combination of epicatechin gallate (ECG) and R-carvone (R-car) against S. mutans (KCOM 1116 and KCOM 1136) and S. sobrinus (KCOM 1157 and KCOM 1221).

Table 6.Results of the combination of caffeine (CF) and R-carvone (R-car) against S. mutans (KCOM 1116 and KCOM 1136) and S. sobrinus (KCOM 1157 and KCOM 1221).

6) S. mutans (KCOM 1136)에 대한 병용효과 1/8 MIC & 1/4 MIC 비교

다엽의 5가지 페놀성분과 R-carvone의 S. mutans (KCOM 1336)에 대한 항균 시너지효과에 기인하여 분할 저해농도인 1/8 MIC와 1/4 MIC를 병용하여 비교 분석한 결과, 각각의 단일 성분에서는 S. mutans에 대해 낮은 억제효과를 보였으나 병용했을 시 두 약물의 항균활성이 현저히 상승하였다.

Fig. 7.Synergistic antimicrobial effect of Camellia sinensis isolated five compounds and R-carvone on Streptococcus mutans (KCOM 1136) proliferation. The bacterial cell viability was determined spectrophotometrically (optical density at 600 nm) after incubation for 24 h with 1/8 MIC and 1/4 MIC drugs. The data are average of three-independent experiments. TF, theophyllin; LT, l -theanine, EC, epicatechin; epicatechin gallate, ECG; CF, caffeine; CON, control (drug-free).

7) S. sobrinus (KCOM 1221)에 대한 병용효과 1/8 MIC & 1/4 MIC 비교

다엽의 5가지 페놀성분과 R-carvone의 S. sobrinus (KCOM 1221)에 대한 항균 시너지효과에 기인하여 분할 저해농도인 1/8 MIC와 1/4 MIC를 병용하여 비교 분석한 결과, 각각의 단일 성분에서는 S. sobrinus에 대해 낮은 억제효과를 보였으나 병용했을 시 두 약물의 항균활성이 현저히 상승하였다.

Fig. 8.Synergistic antimicrobial effect of Camellia sinensis isolated five compounds and R-carvone on Streptococcus sobrinus (KCOM 1221) proliferation. The bacterial cell viability was determined spectrophotometrically (optical density at 600 nm) after incubation for 24 h with 1/8 MIC and 1/4 MIC drugs. The data are average of double-independent experiments. TF, theophyllin; LT, l -theanine, EC, epicatechin; epicatechin gallate, ECG; CF, caffeine, CON, control (drug-free).

 

Ⅳ. 고 찰

구강은 다양한 미생물이 서식하는데 용이한 환경을 제공하는데 있어서 상재균 및 병원성 감염균에 의한 구강질환이 많이 발생하는 인체부위이다. 치아우식증(충치)은 구강 내에 상재하고 있는 균에 의해 당질이 발효된 후 생성된 산에 의해 치아 법랑질(치아의 가장 외곽을 구성하는 조직)과 상아질(치아에서 가장 많은 부분을 차지하는 조직)이 부식된 상태이다. 이러한 구강 내 미생물의 생육을 억제하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 왔으나 원내 감염균에 의한 약제내성 문제가 대두되면서 대체약물의 필요성이 커지고 있다. 이에 본 연구에서는 천연 항균소재 중 다엽의 페놀성분과 방향성 식물에서 분리한 정유성분을 이용하여 구강균주에 대한 항균활성을 탐색하고자 4종의 표준 구강분리균주와 다엽의 5가지 성분과 방향성 정유성분인 R-carvone에 대한 항균실험을 진행하였다.

다엽의 페놀성 화합물이 생리활성에 미치는 영향은 다양하게 보고되어 있다. Staphylococcus aureus (S. aureus)및 Streptococcus pyogens (S. pyogens)와 같은 그람양성균주와 Escherichia coli (E. coli)및 Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)와 같은 그람음성균주를 포함한 여러 가지 병원성 미생물에 대한 항균활성을 보였으며32), 항산화 및 항암효과33-34) 등이 보고되었다. 선행 연구에서 Camellia sinensis L. 에탄올추출물은 치아우식 유발균(cariogenic microorganisms)인 Streptococcus mutans (S. mutans )와 Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus)의 활성 억제효과를 보여주었다35).

정유 성분(essential oil)은 세균의 세포벽을 파괴하고, 효소활성을 방해하여 용균시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 사용한 R-carvone 또한 그람양성균인 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus, S. aureus)에 대해서 항균력이 있음이 보고되었다16). R-carvone을 S-carvone과 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계 항생제인 gentamacin을 각각 병용하였을 때 MRSA에 대한 우수한 시너지효과를 보여주었다. R-carvone은 광학 이성질체를 나타내는 2종류의 분자구조 중 하나로써, 박하, 감국, 초피 등 다양한 식물의 정유 성분(essential oil)에 포함되어 있다. In vitro에서 Mentha spicata 정유성분의 78% 이상을 차지하는 carvone의 S. aureus를 포함한 여러 병원균에서 항균활성을 나타냈으며36), N2a 신경모세포종(neuroblastoma) 세포의 증식억제를 통해 항암효과를 나타냈다37).

본 연구에서는 다엽에 포함되어 있는 5가지 폴리페놀류와 방향성 테르페노이드계 정유성분인 R-carvone의 치아우식 유발균인 S. mutans와 S. sobrinus에 대한 항균 상승효과 (antimicrobial synergism)를 조사하였다. 그 결과, 다엽의 폴리페놀 성분인 theophylline, l-theanine, epicatechin, epicatechin gallate, caffeine과 R-carvone의 mutans streptococci (S. mutans, S. sobrinus)에 대한 최소억제농도(MIC)는 1,000 ㎍/mL 이상에서 나타났으나, R-carvone의 병용 시 항균효과가 현저히 상승하였다. 이것은 병용한 두 약물의 mutans streptococci에 대한 시너지효과를 통해 단일로 사용하였을 때 보다 항균활성이 증진되었음을 짐작할 수 있다. 반면, 다엽의 폴리페놀 성분끼리의 병용 시 항균효과가 상승하지 않았던 것으로 보면 C. sinensis 분리성분이 R-carvone과는 상보적인 항균기전을 나타냄을 알 수 있다.

이러한 결과를 토대로 다엽의 분리성분과 R-carvone의 병용이 치아우식증에 직접적인 영향을 미치는 mutans streptococci에 의해 생성된 유기산과 치아표면의 부착능력에 직접적인 저해효과를 나타내는지 분석하여 치아 우식에 효과적인 천연물질로써 그 기전을 명확히 입증하는 것이 앞으로의 과제라 하겠다.

 

Ⅴ. 결 론

본 연구에서 다엽의 폴리페놀 성분의 S. mutans와 S. sobrinus에 대한 항균효과는 테르페노이드계 정유성분인 R-carvone과 병용함으로써 현저히 상승했다. 각 단일성분의 항균활성을 측정한 결과, 1,000 ㎍/mL 이상에서 저해효과를 나타냈으나, 다엽의 5가지 페놀류와 R-carvone의 병용결과 최소억제농도(MIC)가 각각 8~128배, 2~64배 감소하는 것으로 우수한 시너지효과를 나타냈다.

이로써, 다엽의 폴리페놀 성분과 R-carvone의 mutans streptococci에 대한 항균 시너지효과를 나타내는 것을 근거로 하여 향후 치아우식증을 개선 및 치료할 수 있는 치의약품을 개발하는 데 있어 다엽의 폴리페놀 성분과 R-carvone의 병합이 후보물질로써의 가능성이 있음을 시사하는 바이다.