Antipathogenic Activity of Lactobacillus plantarum Isolated from Pickled Mulberry Leaf

뽕잎 장아찌로부터 분리된 Lactobacillus plantarum 균주의 유해균 증식 억제 활성

Abstract

Strains of lactic acid bacteria were isolated from a variety of fermented foods collected in Korea. The strain L2167 showed a strong antipathogenic activity against Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, and Staphylococcus epidermidis. L2167 was identified as Lactobacillus plantarum by sequence analysis of its 16S rRNA gene. Scanning electron microscopy revealed rough and wrinkled morphology of B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus, and S. epidermidis cell membranes after treatment with a crude cell extract of L. plantarum L2167, indicating that Lactobacillus plantarum L2167 might destroy the cell membrane of pathogenic bacteria. The optimal temperature and initial medium pH for Lactobacillus plantarum L2167 growth were 35℃ and 5.5, respectively. Lactobacillus plantarum L2167 was more sensitive to NaCl than Lactobacillus plantarum KCTC21004, used as a control strain. Lactobacillus plantarum L2167 is expected to be developed as a prominent starter strain for efficient inhibition of growth of pathogens.

전국 각지에서 수집된 발표식품으로부터 젖산균을 분리하고 유해균인 B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus 및 S. epidermidis 균주에 대하여 생육 억제효능이 강한 L2167 균주를 선발하고, 16S rDNA 분석법을 이용하여 L. plantarum로 동정하였다. L2167 균주의 단백질 분획물을 제작하여 S. aureus 등 5종의 유해균 배양액에 첨가한 후, 전자현미경으로 관찰하였다. L. plantarum L2167 균주의 균체 단백질 분획물은 유해균의 생육을 억제하였으며, 생육 억제활성은 균체 내부에 함유된 단백질이 유해균의 세포막을 파괴하는 것에서 기인하는 것으로 추정되었다. L. plantarum L2167은 pH 5.5로 조절한 MRS 배지에서 35℃로 배양하였을 때, 가장 우수한 비성장속도를 나타냈으며, 대조구로 사용된 L. plantarum KCTC21004보다 NaCl에 대하여 민감한 특징을 나타내었다. 본 연구를 통하여 선발한 L. plantarum L2167 균주는 추가연구를 통하여 유해균의 생육을 효율적으로 억제할 수 있는 스타터 균주로서 개발될 수 있을 것으로 기대된다.

서 론

우리나라의 전통식품은 뚜렷한 사계절의 변화에 따라 식품의 저장성을 높이는 방법의 일환으로 다양한 발효 기법이 발달하였다[28]. 발효식품은 단백질, 지방, 탄수화물 등 원료에 포함되어 있는 영양소들이 다양한 미생물의 작용에 의해 소화 및 흡수가 용이한 형태로 변환되고[13], 미생물이 생산하는 유익한 대사산물이 면역능력을 향상시키고 장내 환경을 변화시켜 질병을 예방하는 기능 등이 있는 것으로 알려져 있다[5, 10]. 일반적으로 식품의 발효는 고분자 영양물질의 분해와 더불어 다양한 대사산물의 생성을 유도함으로써[12] 소화 흡수력의 증가, 새로운 기능성의 부여, 관능성의 향상 등을 기대할 수 있을 뿐만 아니라 식품의 보존성을 향상시킬 수 있는 방법으로 평가받고 있다[28].

발효식품에 관여하는 미생물로는 Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc속 등의 젖산균과, Aspergillus, Rhizopus속 등의 곰팡이류가 보고되었으며, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus natto의 세균과 Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces rouxii 등의 효모가 관여한다고 알려져 있다[1, 14, 16, 21]. 그 중에서도 젖산균은 요구르트, 치즈, 버터 등의 유제품이나 발효소시지 같은 육류가공 제품 뿐만 아니라 우리나라의 전통발효식품인 김치, 젓갈 등 다양한 식품에 존재한다[19]. Bifidobacterium과 Lactobacillus속 중의 일부 미생물은 프로바이오틱스로 인식되어 요구르트를 비롯한 유제품 가공에 많이 이용되고 있으며, 이 균주들의 섭취로 인한 젖산균의 장내증식에 의한 효과로 정장작용, 장내 균총의 개선, 혈청콜레스테롤의 감소, 젖당소화의 촉진 그리고 대장암 발생률의 억제 등 매우 다양하게 나타나고 있다고 보고되고 있다[1, 16, 26]. 또한 이들 젖산균은 유기산, 박테리오신 등을 생성하여 유해 미생물의 증식을 저해하는 것으로 알려져 있다[8, 15].

Staphylococcus epidermidis는 피부 상재균으로 각막염과 여드름을 유발하며[32], 일부는 항생제에 내성을 갖는 유해균으로 보고되었다[9]. B. cereus와 S. aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli O157:H7 등의 미생물은 식품과 물에 의해 전염되는 세계적으로 널리 분포하는 식중독과 관련된 유해 미생물들이다[27]. 집단 식중독 발생은 미국뿐만 아니라 캐나다, 일본 등 세계 여러 나라에서 보고되고 있으며, 1만 여명 이상의 환자가 발생하는 대형 식중독 사건도 보고된 바 있다[31]. 식품에서 이들 식중독 미생물에 대한 생물학적 억제방법으로 젖산균을 이용하려는 연구가 활발하게 보고되고 있다[22].

본 연구에서는 전통발효식품에 존재하는 젖산균을 분리하고 유해 균주에 대한 생육 억제활성이 우수한 균주를 선발하여 향후 전통 발효식품의 생산에 적용할 수 있는 스타터 균주로서의 기초자료를 확보하고자 하였다.

 

재료 및 방법

균주 분리

본 연구에 사용된 발효식품은 강원도를 포함한 전국 각 지역에서 제조 또는 판매되고 있는 34점(막걸리 8점, 장류 6점, 김치 8점, 장아찌 9점, 식초 3점)을 수집하여 사용하였다. 수집한 발효식품으로부터 젖산균을 분리하기 위하여 시료 1 g을 펩톤수(Buffered Peptone Water, Biomérieux, France) 5 ml에 현탁한 후 3분간 교반하였다. 현탁액을 105배까지 순차적으로 희석한 후 MRS (deMan, Rogosa and Sharpe; BD, MI, USA) 평판배지에 도말하고 30℃에서 48시간 동안 배양하였다[29]. 집락을 형성한 균주는 새로운 MRS 평판배지에 도말하고 30℃에서 48시간 동안 배양한 후 bromocresol purple (BD, 0.015 g/l)이 첨가된 MRS 배지에 접종하고 30℃에서 48시간 동안 배양하여 오렌지색으로 변하는 집락을 2차 선별한 후 동결 보관하였다[24].

항균활성 검정

분리된 젖산균의 항균 활성을 검정하기 위하여 B. cereus KCTC1012, L. monocytogenes KCTC3569, S. Typhimurium ATCC19430, S. aureus KCCM12214, S. epidermidis KCCM35494 및 L. plantarum KCTC21004 균주는 한국미생물자원센터(Korean Culture Type Collection, KCTC, Korea)와 한국미생물보존센터(Korean Culture Center for Microorganisms, KCCM, Korea) 및 미국미생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC, USA)로부터 각각 분양 받아 사용하였다. 유해균주는 Tryptic Soy Agar (TSA, BD) 또는 Tryptic Soy Broth (TSB, BD) 배지를 사용하여 30℃에서 배양하였다.

젖산균의 유해균에 대한 증식 억제활성은 종이 디스크법[20]을 이용하여 측정하였다. 각각의 유해균을 5 ml의 TSB 배지에 접종하여 24시간 배양한 후 원심분리(8,000 × g, 5분)하여 회수한 균체를 멸균증류수로 2회 세척한 후 5 ml의 TSB 배지에 초기 세포흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 다시 접종하였다. 배양액의 세포흡광도가 0.5−0.6 수준이 될 때까지 배양한 후 100 µl를 회수하여 MRS 평판배지에 도말하고, 지름 7 mm의 멸균된 종이 디스크(3M, MN, USA)를 점적하였다. MRS 액체배지에서 30℃ 조건으로 5일 동안 배양된 젖산균의 배양액을 세포흡광도가 1.0이 되도록 멸균수로 희석한 후 10 µl를 종이 점적된 종이 디스크에 분주하였다. 음성대조구로 MRS 배지를 사용하였으며 유해균에 대한 젖산균의 항균활성은 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 생성되는 생육저해환의 크기로 평가하였다.

균주 동정

분리한 젖산균은 MRS 배지를 사용하여 30℃에서 24시간 배양한 후 GenExTM genomic Sx (Geneall, Korea)를 사용하여 염색체 DNA를 추출하였다. 균주 동정을 위하여 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT3') 프라이머[33]를 사용하여 16S rDNA 유전자의 단편을 증폭하였다. 염색체 DNA (10 ng)을 주형으로 사용하여 Pfu Plus PCR PreMix (EBT-1405, Elpis, Korea)와 멸균 증류수를 혼합한 반응액의 최종 부피를 50 µl로 제조하여 94℃에서 5분간 반응시키고 94℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30번 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응산물은 agarose (1.5%, w/v) gel을 사용하는 전기영동장치를 이용하여 증폭산물을 확인한 후 염기서열을 해독하였다. 해독한 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하여 기존에 보고된 균주의 16S rDNA 유전자 단편과의 상동성을 근거로 동정하였다[7].

단백질 분획물 제작 및 주사현미경 분석

젖산균에 의한 유해균의 세포막 변형 또는 파쇄를 확인하기 위하여 MRS 배지를 대조구로 Wong 등[34]의 방법을 사용하여 단백질 분획물을 확보하였다. L. plantarum L2167 균주를 MRS 배지에서 5일간 배양한 후 배양액의 일부를 회수하고, 남은 배양액은 원심분리(8,000 × g, 5분)를 통하여 균체와 상등액으로 분리하였다. 회수한 균체는 멸균된 MRS 배지에 현탁한 후, 초음파 균질기(VCX130, Sonics, CT, USA)를 이용하여 20 kHz 출력으로 10분간 세포를 파쇄하였다. 균체 파쇄물, 상등액 및 배양액에 (NH4)2SO4를 80%(w/v)의 농도로 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 정치한 후 원심분리(10,000 × g, 10분)하여 상등액을 제거하고 동결 건조하였다. 유해균은 TSB 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각각의 유해균 배양액에 L. plantarum L2167 균주로부터 확보한 단백질 분획물의 동결건조물을 50 mg/ml의 최종 농도로 첨가하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양한 후 주사전자현미경(Hitachi S-4800, Hitachi High-Technologies Corp., Japan)를 이용하여 유해균의 세포 형태를 관찰하였다.

비성장속도 측정

배양 온도에 따른 젖산균의 비성장속도를 측정하기 위하여 전배양한 젖산균을 MRS배지에 초기 세포 흡광도가 0.1이 되도록 접종한 후 25, 30, 35, 40℃에서 배양하면서 비성장속도를 측정하였다. HCl (2 N) 또는 NaOH (2 N)를 사용하여 MRS 배지의 초기 pH를 각각 4, 5.5, 7, 9로 조정한 후 초기 세포 흡광도가 0.1이 되도록 접종하고 35℃에서 배양하면서 대수증식기에서 비성장속도를 측정하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 반복 수행하였으며 측정값은 SPSS(v 20.0, SPSS, IL, USA)를 사용하여 통계처리 하였고 유의성 검증은 일원배치 분산 분석법[35]을 이용하였다.

 

결과 및 고찰

균주 선발 및 동정

강원도를 비롯한 전국에서 수집한 34점의 발효식품으로부터 젖산균 224점을 분리하였다. 분리한 젖산균의 S. aureus 균주에 대한 생육 억제활성을 종이 디스크법으로 검정하였다(Fig. 1). S. aureus 균주에 대한 젖산균의 생육 억제활성은 Leu. mesenteroides, L. plantarum 등에 대하여 문헌에 [11, 23] 보고된 바 있으며, 본 연구에서는 발효식품으로부터 분리된 균주 중 88점의 균주가 S. aureus에 대한 생육 억제활성을 나타내었다. 가장 넓은 생육억제환(136 ± 10 mm)을 나타낸 뽕잎 장아찌로부터 분리된 관리번호180번 균주를 선발하여 식중독을 유발시키는 균주인 S. Typhimurium을 포함한 유해 균주 4종에 대한 생육 억제활성을 평가하였다.

Fig. 1.Antibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from fermented foods on the growth of S. aureus in TSA plate. 1−224: lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods, C: control (MRS). Cells were grown on TSA plate at 30℃ for 24 h.

관리번호 180번 균주는 B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus 및 S. epidermidis 균주에 대한 생육 억제활성을 나타냈으며(Fig. 2), L2167 균주로 명명하였다. L2167 균주는 16S rDNA 유전자 단편의 염기서열을 분석한 결과 기존에 보고된 L. plantarum JCM1149 균주의 16S rDNA 유전자 단편(Genbank No. D79210) [17] 및 대조구로 사용한 L. plantarum KCTC21004 균주의 16S rDNA 유전자 단편(Genbank No. KU720560)의 염기서열과 매우 높은 상동성(100%)을 나타내어 L. plantarum으로 최종 동정하였다. L. plantarum L2167 균주는 한국미생물보존센터에 기탁하였으며(KCCM43174), 16S rDNA 유전자의 염기서열은 Genbank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에 KU508622로 등록하였다.

Fig. 2.Antibacterial activity of L. plantarum L2167 isolated from pickled mulberry to L. monocytogenes (A), S. epidermidis (B), S. Typhimurium (C), S. aureus (D), and B. cereus (E). a, control (MRS); b, L. plantarum KCTC21004; c, L. plantarum L2167. For growth assays, cells were grown at 30℃ for 24 h on TSA plate.

L2167 균주의 항균활성

L2167 균주는 5종의 유해균 중에서 S. aureus에 대하여 상대적으로 가장 우수한 생육 억제활성을 나타냈으며(Fig. 2D), S. Typhimurium에 대한 생육 억제활성이 상대적으로 가장 저조하였다(Fig. 2C). 한편 대조구 균주로 사용한 L. plantarum KCTC21004 균주는 L. monocytogenes, S. epidermidis, S. Typhimurium 및 S. aureus 균주의 생육을 억제하지 않았으며, B. cereus 균주에 대한 생육 억제 활성을 나타냈으나, L2167 균주와 비교하여 억제효과가 미미한 수준이었다(Fig. 2E).

단백질 분획물의 항균활성

L. plantarum L2167 균주의 배양액, 균체 및 균체가 제거된 상등액으로부터 단백질 분획물을 확보하고 각각의 유해균에 처리한 후 유해균의 세포 형태를 관찰하였다(Fig. 3). 음성 대조구로 사용한 MRS 배지는 5가지 유해균의 세포 형태에 영향을 미치지 않았으며, L2167 균주의 균체 내부 단백질 분획물(intracellular fraction)을 처리하였을 때, 유해균의 세포 표면이 변형되거나 파쇄된 모습을 확인할 수 있었다. 균체 배양액의 단백질 분획물(total fraction)을 처리한 경우, L. monocytogenes (Fig. 3A), S. epidermidis (Fig. 3B), S. Typhimurium (Fig. 3C), S. aureus (Fig. 3D) 균주의 세포막이 손상된 모습을 나타냈으나, B. cereus (Fig. 3E) 균주에는 영향이 없는 것으로 나타났다. 또한, L2167 균주의 배양액으로부터 균체를 제거한 상등액의 단백질 분획물 (extracellular fraction)은 유해균주의 세포 형태에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 이상의 결과를 바탕으로 L2167 균주의 균체 내부에 존재하는 단백질이 유해균의 세포막을 손상시키는 것으로 추정할 수 있었다. Wong 등[34]은 L. plantarum BT85143 균체를 포함하는 배양액으로부터 단백질 분획물을 제작하여 S. aureus 균주의 세포막이 손상되는 것을 보고하여, 본 연구의 결과와 유사하였다. 그러나 본 연구에서는 L. plantarum L2167 균주의 배양액보다 세포내 단백질이 S. aureus 균주의 세포막 손상에 더 유의적인 영향을 미친다는 결과를 확보하였으며(Fig. 3D), L. plantarum L2167 균주가 S. aureus 이외의 4종의 유해균에 대해서도 세포막에 손상을 미친다는 것을 확인할 수 있었다. 치즈로부터 분리된 L. plantarum TF711 균주는 E. coli, B. cereus 및 S. aureus에 대하여 생육 억제활성이 있는 것으로 보고된 바 있고[6], 발효소시지에서 분리한 L. plantarum FS31 균주가 식중독 관련 유해균인 L. monocytogenes, E. coli, S. Enteritidis에 대한 생육 억제활성[8]을 보유하고 있는 것은 보고된 바 있다.

Fig. 3.Scanning electron microscope images of Listeria monocytogenes (A), S. epidermidis (B), S. Typhimurium (C), S. aureus (D), and B. cereus (E) treated with protein fraction obtained from intracellular, extracellular, and total (culture broth) of L. plantarum L2167. Protein fraction prepared from MRS medium was used as control.

젖산균이 생산하는 박테리오신은 식품보존제나 항균제로 사용되고 있으며[3], L. lactis subsp. lactis 균주가 생산하는 nisin은 식중독 미생물의 증식을 억제하여 식품의 천연 보존제로 사용되고 있고[4], Pediococcus 속 균주 중 일부가 생산하는 pediocin은 Listeria 속에 대하여 높은 항균활성을 나타내는 것으로 보고되었다[25]. 따라서, 본 연구를 통해 확보한 L. plantarum L2167 균주가 생산하는 항균물질에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 판단된다.

뽕잎 장아찌로부터 분리된 L. plantarum L2167 균주는 식중독 유발균 4점과 각막염 유발균 1점 등 총 5점의 유해균에 대하여 동시에 생육 억제활성을 나타내어 기존에 보고된 L. plantarum 균주보다는 유해균 억제 범위가 보다 광범위하였다. 또한, 유해균에 대한 생육 억제를 유발하는 물질은 L. plantarum L2167 균체 내부에 존재할 것으로 추정되며 이와 관련하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

배양조건에 따른 L2167 균주의 비성장속도

L. plantarum L2167 균주의 생육 특성을 조사하기 위하여 배양 온도, 배지의 초기 pH 및 NaCl 첨가 농도에 따른 비성장속도를 측정하였다(Fig. 4). 대조구로 사용한 L. plantarum KCTC21004 균주와 실험구인 L. plantarum L2167 균주는 25℃와 40℃에서 성장하지 못하였으며, 30℃에서는 두 균주의 비성장속도의 유의적인 차이를 관찰할 수 없었다. 그러나 35℃에서 L. plantarum L2167 균주의 비성장속도가 (0.87 ± 0.07 1/h)로 대조구 균주의 비성장속도(0.76 ± 0.05 1/h)보다 상대적으로 빠르게 나타났다(Fig. 4A).

Fig. 4.Influences of temperature (A), pH (B) and NaCl (C) on specific growth rates of L. plantarum KCTC21004 (■) and L2167 (□). Averages and standard errors from three independent cultures were shown. Different letters mean significant difference between means.

배지의 초기 pH를 4, 5.5, 7, 9로 조정하고 L. plantarum 균주의 비성장속도를 측정하였다. L. plantarum L2167 균주는 초기 pH 5.5에서 가장 빠른 비성장속도를 나타냈다(Fig. 4B). 대조구 균주는 pH 5.5와 pH 7의 배지에서 유사한 수준의 비성장속도를 나타냈지만, 모든 초기 pH 조건에서 L. plantarum L2167 균주가 대조구 균주보다 빠른 비성장속도를 나타냈다. 결론적으로 L. plantarum L2167 균주는 pH 5.5로 조절된 배지에서 35℃ 조건으로 배양하였을 때 가장 빠른 비성장속도를 나타냈다.

MRS 배지에 NaCl을 농도별로 첨가하여 L. plantarum L2167 균주와 대조구 균주의 비성장속도를 비교하였다. NaCl 첨가량이 증가할수록 대조구와 실험구 균주의 비성장속도는 느려졌으며(Fig. 4C), 대조구와 실험구 균주는 1M의 NaCl을 첨가하였을 때, NaCl을 함유하지 않은 배지에서의 비성장속도와 비교하여 각각 70%, 74% 감소하였다. L. plantarum L2167 균주는 대조구 균주보다 NaCl에 대하여 상대적으로 민감한 것으로 나타나, 현재로서는 염도가 높은 식품의 스타터 균주로 적용하기는 어려울 것으로 판단되었다.

최근 실험실적 진화 등[2]의 기법을 이용하여 L. delbrueckii 균주의 lactose operon의 발현을 조절하는 프로모터의 개량에 대한 연구가 보고되었으며[18], Teusink 등[30]은 glycerol을 대사하는 L. plantarum 균주의 개량에 대하여 보고하였다. 따라서 실험실적 진화 기법을 이용하여 L2167 균주의 염에 내한 내성을 증진시킨다면 스타터 균주로서 활용 가능성이 있을 것으로 기대된다.

뽕잎 장아찌로부터 분리된 L. plantarum L2167 균주는 기존에 보고된 L. plantarum 균주와 동일한 균주로 동정 되었지만 유해균에 대한 생육 억제활성 및 배양조건에 따른 생육 특성을 조사한 결과 서로 상이한 특성을 보유하고 있는 것으로 판단되었다. L. plantarum L2167 균주는 B. cereus, L. monocytogenes, S. Typhimurium, S. aureus 및 S. epidermidis 등의 유해균에 대한 생육 억제 활성을 동시에 나타냈으며, 균체 내부에 존재하는 단백질이 유해균의 세포막을 손상시키는 것으로 나타났다. 본 연구를 통하여 선발된 균주는 향후 추가연구를 통하여 유해균의 생육을 효율적으로 억제하는 유망한 스타터 균주로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.