치자(梔子)가 JNK와 NF-kB를 통한 항산화와 항염증의 대사과정에 미치는 영향

Effects of Gardeniae Fructus on the metabolic process of antioxidant and anti-inflammation by JNK and NF-kB

Abstract

Objectives : The purpose of this study is to observe the effects of Gardeniae Fuctus(GF) on the metabolic process of antioxidant and anti-inflammation. Methods : 4-HNE was injected into PC-12 cell to cause oxidative stress-induced inflammatory response, and then a western blot was conducted to observe the expression of Nuclear Factor-kB (NF-kB) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) protein that are important factors involved with inflammation. Results : 1. The Gardeniae Fuctus water extract 50 ㎍ and 100 ㎍ significantly suppressed the increase in JNK protein expression in PC-12 cell. 2. The Gardeniae Fuctus water extract 50 ㎍, 100 ㎍ and 200 ㎍ significantly suppressed the increase in NF-kB protein expression in PC-12 cell. Conclusion : These results suggest that the Gardeniae Fuctus water extract has antioxidative and anti-inflammatory activity through suppressing the activity of JNK and NF-kB.

1. 서 론

염증(Inflammation)이란 외부자극으로 유발되는 손상에 대한 생체 조직의 방어보호반응으로, 국소적인 혈관 확장으로 인한 發赤과 灼熱感, 신경 자극으로 인한 疼痛, 조직의 부종으로 인한 腫脹, 섬유화와 변형으로 인한 기능장애를 특징으로 하며1), 점진적으로 조직의 구조와 기능이 정상적으로 회복하도록 하면서 자연스럽게 소실된다2). 그러나 여러 가지 원인으로 염증이 지속되면 정상조직을 손상시키고 만성적인 염증으로 발전하면서 조직의 기능상실까지 초래한다3).

이러한 과다 염증반응은 산화 스트레스의 증가와도 깊은 관련이 있다4). 산화 스트레스는 세포내의 reactive oxygen specise(ROS)가 증가하여 단백질, 지질이나 DNA와 반응하여 그것들을 손상시키는 현상인데5) 과다 염증반응의 경우 ROS가 단백질 인산화효소(protein kinase)인 JNK와 IKK를 활성화시켜서 NF-kB가 iNOS와 COX-2 등을 발현시키게 한다. 따라서 현대의 염증 질환 치료에 있어서는 항염증 작용뿐만 아니라 항산화 작용도 지닌 약물의 투여가 요구된다6).

梔子(Gardeniae Fructus, GF)는 꼭두서니과(茜草科 : Rubiaceae)에 속하는 치자나무(Gardenia jasminoides Ellis) 또는 동속식물의 성숙한 果實을 건조한 것으로, 性味가 苦寒하고 心, 肝, 肺, 胃, 三焦로 귀경하며 淸熱瀉火除煩, 凉血解毒, 泄熱利濕하는 효능이 있어7) 濕熱黃疸, 消渴, 衄血, 尿血, 吐血, 目赤, 熱病虛煩不眠 등의 치료에 사용되며8), 타박으로 인한 외용약으로도 사용된다.

梔子의 구성성분에는 iridoid 계열의 geniposide, genipin, gardenoside 등과 carotenoid 계열의 crocetin, crocin, jasminoides 등과 flavonoids 계열의 quercetin, rutin, nicotiflorin, umuhengerin 등과 organic acid esters 성분인 chlorogenic acid, quinic acid ursolic acid 등이 있다9).

梔子에 대한 연구로는 간세포 보호작용10), 담즙분비 촉진작용11), 수면각성 억제작용12), 항불안작용13), 항균작용14) 등이 보고되었다.

예로부터 치자는 타박으로 인한 통증, 출혈에 소염진통, 부종제거작용을 이용한 외용약으로 사용되어 왔고 최근에는 피부 트러블이나 기미, 잡티 등을 제거하는데 팩이나 화장품의 원료로 사용되고 있는데 이와 관련된 梔子의 항산화와 항염증 작용에 관한 연구들이 보고되고 있다15).

이에 저자는 梔子가 항산화와 항염증의 대사과정에 미치는 영향을 연구하였다. PC-12 cell에 4-Hydroxynonenal (4-HNE) 을 주입하여 산화 스트레스를 일으켜 염증반응을 유도한 후 염증에 관여하는 대표적인 전사인자인 Nuclear Factor-kB(NF-kB) 와 c-Jun N-terminal kinase (JNK) 의 단백질 발현량을 western blot으로 관찰한 바 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.

 

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 세포배양

본 실험에 사용한 PC-12 세포(rat adrenal pheochromocytoma cell)는 신경세포의 특성을 나타내는데 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다. 세포의 배양을 위해 10% horse serum과 5% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin, 2% NaHCO3가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37℃의 온도와 5% CO2가 포함된 공기가 공급되는 CO2 incubator에서 세포를 배양하였다.

2. 기기 및 시약

1) 기기

본 실험을 위해 사용된 기기로는 Clean Bench(Nuaire, USA), CO2 Incubator(Nuaire, USA), Spectrophotometer(Implen, Grrmany), Water Purification(High-Q, USA), Microplate Reader(Dynex, USA), Freezing dryer(Eyela, Japan), Sonicator(Sonics, USA), Auto clave(sam woo, Korea), Balance(Mettler, Switzerland), Automatic X-ray Filmprocessor(JPI, Korea), Centrifuge (Hanil, Korea) 등이 있다.

2) 시약

본 실험에 사용된 시약으로는 4-Hydroxy Nonenal (Cayman, USA), MTT(Sigma, USA), RPMI Medium 1640(Gibco, USA), Fetal Bovine Serum(Gibco, USA), Horse Serum(Gibco, USA), Sodium Bicarbonate(Sigma, USA), Sodium Chloride(Sigma, USA), Dimethyl Sulfoxide (Amresco, USA), Trzma Base(Sigma, USA) 등을 구입하여 사용하였다.

3. 한약물의 제조

본 실험에 사용한 梔子(Gardeniae Fructus, GF)는 ㈜옴니허브(영천, 한국)에서 구입하였다. 梔子 50g에 물 500㎖를 가하여 환류추출기에서 2시간 동안 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다. 梔子는 15.5g의 추출물을 얻어 수율은 31%였다.

4. Western Blot Analysis

세포는 차가운 PBS(㏗ 7.4)로 2번 씻어낸 후 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 그리고 세포분해용액(iNtRON Biotechnology, Korea)을 넣은 후 초음파 분쇄기로 세포를 균질화 하고 다시 원심분리기를 이용하여 20분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad의 protein assay dye reagent(Bio-Rad, USA)를 사용하여 흡광도로 측정하였다. 정량한 단백질을 Mini-PROTEANⓇ TGXTM Gel(Bio-Rad, USA)에 loading하여 분리한 다음 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA)으로 이동시켰다. 1차 항체로 mouse actin antibody(Millipore, USA)와 rabbit JNK antibody (CST, USA), rabbit p-JNK antibody (CST, USA), rabbit NF-κB p65 antibody (CST, USA) rabbit p-NF-κB p65 antibody (CST, USA)를 사용하였다. 2차 항체로 actin은 mouse IgG horseradish peroxidase -conjugated antibody(R&D, USA)와 JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65는 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody (CST, USA)를 사용하였다. Nitrocellulose membrane으로 단백질 이동을 제외하고 모든 실험은 실온에서 시행하였다. Nitrocellulose membrane으로 단백질 이동은 4℃ 냉장고 안에서 실시하였다. 단백질 밴드 검출은 clarity western ECL substrate(Bio-Rad, USA)를 사용하여 발색시켰다.

5. 통계처리

통계분석은 4-HNE와 4-HNE+梔子 투여 group 간의 유의성검증으로 Graphpad Prism(USA)으로 Student's t-test를 사용하였으며, 실험 결과는 평균 ± 평균의 표준오차[means ± standard error of the mean(SEM)]로 나타내었다. 통계적 유의성 검정은 P < 0.05로 하였다.

 

Ⅲ. 결 과

1. 梔子가 p-JNK 단백질 발현에 미치는 영향

梔子가 세포내의 신호전달 경로에 참여하는 MAPKs의 하나인 JNK에 미치는 영향을 관찰하고자 세포에 梔子 물추출물을 처리하고 4-HNE를 주입한 다음 세포의 p-JNK 단백질 발현량을 측정하였다. 정상군의 p-JNK 단백질 발현량을 100%로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군의 p-JNK 단백질 발현량은 384.6±63.171%이었다.

梔子 물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(GF50)에서 p-JNK 단백질 발현량은 186.3±22.77%이었고, 梔子 물추출물 100 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(GF100)에서 p-JNK 단백질 발현량은 215.7±22.87%이었으며, 梔子 물추출물 200 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(GF200)에서 p-JNK 단백질 발현량은 212.2±46.23%로 모두 대조군에 비해 감소하였으나 GF50과 GF100 처리군에서만 유의성을 나타내었다(Fig. 1).

Fig. 1.Effect of Gardeniae Fructus(GF) on p-JNK expression. Normal ; only media-treated group. Control ; 35 μM 4-HNE-treated group. GF50 ; 35 μM 4-HNE and 50 ㎍/㎖ GF-treated group. GF100 ; 35 μM 4-HNE and 100 ㎍/㎖ GF-treated group. GF200 ; 35 μM 4-HNE and 200 ㎍/㎖ GF-treated group. Data are represented by mean ± SEM (n=4 in each group). Statistical significances are based on comparison to the Control group (*, p<0.05).

2. 梔子가 p-NF-κB 단백질 발현에 미치는 영향

梔子가 세포내의 신호전달 경로에 참여하는 NF-κB에 미치는 영향을 관찰하고자 세포에 梔子 물추출물을 처리하고 4-HNE를 주입한 다음 세포의 p-NF-κB 단백질 발현량을 측정하였다. 정상군의 p-NF-κB 단백질 발현량을 100%로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군의 p-NF-κB 단백질 발현량은 341.2±62.96%이었다.

梔子 물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(GF50)에서 p-NF-κB 단백질 발현량은 101.8±9.89%이었고, 梔子 물추출물 100 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(GF100)에서 p-NF-κB 단백질 발현량은 124.0±7.758%이었으며, 梔子 물추출물 200 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(GF200)에서 p-NF-κB 단백질 발현량은 146.6±7.185%로 대조군에 비해 모두 유의한 감소를 하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Effect of Gardeniae Fructus(GF) on p-NF-κB expression. Normal ; only media-treated group. Control ; 35 μM 4-HNE-treated group. GF50 ; 35 μM 4-HNE and 50 ㎍/㎖ GF-treated group. GF100 ; 35 μM 4-HNE and 100 ㎍/㎖ GF-treated group. GF200 ; 35 μM 4-HNE and 200 ㎍/㎖ GF-treated group. Data are represented by mean ± SEM (n=4 in each group). Statistical significances are based on comparison to the Control group (*, p<0.05; **, p<0.01).

 

Ⅳ. 고 찰

梔子는 淸熱瀉火除煩, 凉血解毒, 泄熱利濕의 효능을 가지는 약으로 현대적인 의미에서 항산화와 항염증의 효능을 가지고 있다. 梔子에 관한 항산화와 항염증 관련 연구를 보면 geniposide에 의한 MAPKs, NF-kB 경로 억제16), 류마티스 관절염 억제17), 발목염좌의 부종 억제18)와 기관지 염증 억제19)가 있고 genipin에 의한 MMP-1, -3의 생성 억제20)와 항산화 작용과 혈관신생 및 nitric oxide (NO) 생성 저해21), 항산화작용 등에 의한 위궤양 억제22)가 있다. 또한 crocin에 의한 prostaglandin E2 등의 유리 억제를 통해 항염증23)과 crocetin에 의한 폐의 부종과 염증억제24)와 산화적 스트레스 또는 ER 스트레스 억제25)가 있다.

이에 저자는 梔子가 세포손상에 의한 염증반응에 어떤 영향을 미치는 가를 연구하기 위해 세포에 梔子 물추출물을 처리하고 4-HNE를 주입한 다음 염증반응에 관여하는 대표적인 인자인 JNK와 NF-κB의 인산화된 단백질 발현량을 관찰하고자 western blot을 실시하였다.

4-HNE는 세포막 지질의 산화에 의해 생성되는 aldehyde 중 하나로 독성이 강한 화합물로 산화 스트레스를 유도하여 세포의 구조적 변화와 기능 손실을 유도하며26) 병리적으로 동맥경화증, 당뇨, 알츠하이머, 다운증후군 등과 같은 질병의 원인물질로 작용한다27). 이러한 4-HNE는 세포내에 작은 양이 존재하여 JNK를 포함하는 Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 와 NF-kB의 세포내 신호기전을 조절하는데28) 인위적으로 높은 농도의 4-HNE를 주입하면 강력하게 MAPKs와 NF-kB 활성과 인산화를 증가시켜 세포손상과 염증을 일으키는 독성물질로 작용하게 된다29). 이에 저자는 梔子 물추출물을 처리한 PC-12 cell에 4-HNE를 주입하여 산화 스트레스로 인한 염증을 유발하여 정상군에 비해 대조군의 JNK와 NF-kB의 단백질 발현량이 현저하게 증가하였다.

ROS는 적당한 농도에서는 세포내 신호전달에서 중요한 역할을 하나30) 과량의 농도에서는 산화 스트레스를 일으키는데 특히 염증의 과정에서 JNK나 IKK를 활성화시킨다. JNK나 IKK는 단백질 인산화효소로 세포내 신호전달에 영향을 미치고 세포 내부의 복잡한 기작들을 조절하는 역할을 한다31-33). ROS는 불활성의 단백질 인산화효소를 활성화시켜 결국 염증 반응을 일으키는데 항산화 작용을 하는 물질들은 ROS의 활동을 억제한다. 梔子는 이런 ROS를 제어하는 항산화 성분으로 flavonoids 계열, carotenoid 계열이나 organic acid esters 계열의 구성성분 등을 다양하게 함유하고 있다9).

염증반응은 NF-kB, JNK 등의 염증매개물 생성이 중요한 역할을 하고 이들의 생성량 조절이 항염증 효과에 밀접한 관련이 있다. 이런 염증반응은 JNK를 비롯한 MAPKs의 활성화로 인한 NF-кB의 전사조절인자들의 가동으로 시작된다34). MARKs는 cytokine이나 ROS 등의 자극을 세포막에서 세포내핵까지 전달하는 신호전달경로로 염증물질의 합성을 유도하는데 extracellular signal-regulated kinase(ERK) , JNK, p38 kinase의 3가지로 분류된다35). 특히 JNK는 stress-activated protein kinase(SAPK) 라고 불리는데 ROS가 증가하면 JNK의 억제제인 MAP kinase phosphatases (MKP) 가 분해되거나31) JNK의 촉진제인 mitogen-activated protein kinase 4/7(MKK4/7) 이 활성화되면서32) JNK가 활성화된다. 이렇게 활성화된 JNK는 activator protein (AP) -1 전사인자를 형성하여 핵으로 이동하여 NF-kB가 염증에 필요한 물질을 전사하는데 관여하게 된다36).

梔子가 p-JNK 단백질 발현에 미치는 영향을 관한 결과, 梔子 물추출물 50 ㎍, 100 ㎍ 및 200 ㎍ 실험군 모두 대조군에 비해서 감소하였으나 50 ㎍과 100 ㎍에서만 유의성이 있었다.

NF-κB는 일반적인 면역과 염증, 세포 성장 조절과 같은 다양한 단계에 참여하는 전사 인자로 평소에는 세포질 내에서 억제 단백질 IκB와 결합하여 불활성 상태로 존재한다37). 만약 ROS가 증가하여 I-kB kinase (IKK) complex를 자극하여 활성화시키면, IKK가 NF-κB와 결합하고 있는 IκB를 인산화(phosphorylation)시키면서, 분리된 NF-kB는 핵안으로 들어가 JNK의 활동과 함께 특정 유전자 내의 DNA 서열과 결합하여 전사를 시작하여 염증 효소 iNOS와 COX-2 등의 발현을 증가시켜 염증반응을 가속화시킨다33).

梔子가 p-NF-κB 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 梔子 물추출물 50 ㎍, 100 ㎍ 및 200 ㎍ 실험군 모두 대조군에 비해서 유의성 있는 감소를 나타내었다.

이상의 결과, 梔子 물추출물을 주입한 세포에서 JNK와 NF-kB의 인산화된 단백질 발현량이 감소하였다. 이는 4-HNE를 주입하여 산화 스트레스로 유도된 ROS가 JNK와 NF-kB를 활성화시켜서 염증반응을 일으키는데 항산화능이 있는 梔子가 산화 스트레스를 억제함으로서 결국 염증반응을 억제한 것으로 보인다. 이것은 항산화 성분이 있는 梔子가 항산화 작용에 의한 JNK와 NF-kB의 활성 억제를 통한 항염증 작용이 있음을 시사한다.

지금까지 살펴 본 항산화 작용을 일으키는 치자의 성분은 全梔子나 梔子果皮에서 더 효과적인 것으로 보고되므로38) 기존의 梔子仁 중심으로 약재가 사용되었던 방식에 대해서 향후 연구할 필요가 있는 것으로 사료된다.

 

Ⅴ. 결 론

梔子가 항산화와 항염증의 대사과정에 미치는 영향을 연구하였다. PC-12 cell에 4-Hydroxynonenal(4-HNE) 을 주입하여 산화 스트레스를 일으켜 염증반응을 유도한 후 염증에 관여하는 대표적인 전사인자인 Nuclear Factor-kB(NF-kB) 와 c-Jun N-terminal kinase(JNK)의 단백질 발현량을 western blot으로 관찰한 바 아래와 같은 결과를 얻었다

이상의 결과로 보아, 梔子가 JNK와 NF-kB의 활성을 억제함으로써 항염증 작용을 한다고 생각한다.