Development of New Analytical Method Evaluating Working Memory on Y Maze

Y-미로에서 작업기억을 평가하는 새로운 방법 개발

Abstract

The Y-maze is widely used to test working memory in behavioral science. For this purpose, spontaneous alternation behavior is monitored, and an increased percentage of spontaneous alternation is regarded as enhanced working memory. However, in some cases, the percentage of spontaneous alternation does not accurately reflect the extent of working memory in rodents. To complement the short-comings of this measure, we developed a new method to evaluate working memory on the Y-maze. This is done by defining all spontaneous alternation cases and P_i, the probability that the rodent achieved spontaneous alternation from each alternation case. After all P_i-values acquired in each animal are summarized, the result is considered as entropy. To validate the new analytical method, mice were raised under either control or an enriched environmental condition for 10 weeks, and working memory behavior on the Y-maze was monitored. The results showed that the new analytical method successfully reproduced significance. In addition, the new method turned out to be more accurate than measurement of the percentage of spontaneous alternation, meaning that, to get higher entropy, alternation should be recorded in all arms and directions. Together, these data indicate that the new analytical method is a useful supplement to the method that compares the percentage of spontaneous alternation, and thus is a good tool with which to evaluate working memory in rodents.

Y-미로는 행동연구 분야에서 작업기억을 측정하는데 흔히 사용된다. 이를 위해 자발적 교대 행동을 측정하고 자발적 교대 비율이 증가하면 작업기억 능력이 향상된 것으로 간주된다. 그러나, 설치류에서 자발적 교대 비율이 작업기억 능력을 정확히 반영하기 어려운 경우가 때때로 존재한다. 이러한 단점을 보완하기 위해 Y-미로에서 작업기억능력을 측정하는 새로운 통계 방법을 개발하였다. 이를 위해 먼저 Y-미로에서 자발적 교대가 이루어질 수 있는 경우를 모두 지정하고 각 경우마다 P_i 값을 구한다. P_i 값은 각 자발적 교대가 이루어지는 경우에서 실제 실험동물이 보이는 확률을 의미한다. 각 동물에서 P_i 값을 모두 더하면 그 값은 한 동물에서 얻은 엔트로피에 해당하고 각 군에서 엔트로피를 통계적으로 분석한다. 이러한 새로운 통계 분석 방법을 평가하기 위해 작업기억능력을 향상시키는 것으로 알려진 풍족한 환경에 노출된 군과 정상군을 10주간 사육한 후 Y-미로에서 작업기억능력을 평가하였다. 그 결과 새로운 통계 분석 방법은 자발적 교대 비율을 이용한 통계의 유의성을 재연하였다. 뿐만 아니라 새로운 방법은 자발적 교대 비율을 이용한 분석법보다 유의성 있는 차이를 얻기가 더욱 힘들었다. 이러한 결과는 높은 엔트로피를 얻기 위해서는 모든 통로와 방향에서 자발적 교대가 이루어져야 함을 의미한다. 종합하면, 새로 제시된 분석법은 자발적 교대 비율을 비교하는 분석방법의 단점을 보완할 수 있으며 설치류에서 작업기억 능력을 평가하는 유용한 통계 방법임을 알 수 있다.

서 론

작업기억(working memory)이란 이미 저장되어 있는 기억이나 현재 경험하고 있는 정보를 바탕으로 새로운 학습, 추론, 이해, 판단 등 복잡한 인지 기능을 수행하는 기억체계를 말한다[9]. 작업기억은 단순한 읽기에서부터 상황판단에 이르기까지 고차원적인 뇌 기능의 기본적 요소이므로 작업기억의 분자적 기전을 이해하고자 수 많은 연구가 진행되어 왔다[5]. 이러한 작업기억에 관한 연구는 학습과 기억에 관여하는 세포 내 신호전달기전에 관한 연구에서부터 알츠하이머성 치매, 정신분열증과 같은 뇌질환 및 최근에는 신약개발 분야에서도 활발하게 이용되고 있다[7, 20, 21, 27].

다른 연구분야와 마찬가지로 작업기억에 관한 연구도 설치류는 물론 인간을 대상으로 하는 다양한 연구기법이 개발되어 사용되고 있다. 설치류에서 작업기억에 관한 연구는 1970년대에 Olton 등이 방사상 미로(radial arm maze)를 개발하여 설치류에서 기억능력을 측정한 이래로 Y-미로, T-미로, 수조 미로 (water maze) 등 다양한 방법이 개발되어 연구에 이용되고 있다[1, 19, 25, 29]. 특히 Y-미로를 비롯한 통로(arm)를 이용하는 미로 실험법은 다른 실험법에 비해 설치류에 스트레스를 적게 유발한다[26]. 이미 알려진 바와 같이 스트레스는 작업기억을 현저히 저해하므로 통로를 이용하는 미로 실험법은 설치류에서 작업기억능력을 측정하기 위한 적절한 방법으로 받아 들여지고 있다[18].

Y-미로 또는 T-미로를 이용하여 작업기억능력을 측정할 때 흔히 자발적 교대 비율(spontaneous alternation ratio)를 이용한다[8, 12, 14, 23]. 이 실험법은 T자 또는 Y자 모양으로 생긴 통로에서 생쥐 또는 흰쥐가 일정 시간 동안 자유롭게 3개의 통로를 탐험하게 하며 자발적 교대가 일어나는 비율을 측정하여 작업능력을 평가한다. 여기서 자발적 교대란 하나의 통로에 들어갔다 나올 때 다음 선택 가능한 두 개의 통로 중 이전에 탐험하지 않았던 새로운 통로를 선택하는 경우를 말하며 이는 설치류가 호기심이 많아 이전에 방문했던 통로보다는 탐험하지 않았던 새로운 통로를 선택하는 습성을 이용한 실험법이다[4, 8]. 세 개의 통로를 각각 A, B, C라 할 때 자발적 교대가 일어나는 방법은 연속된 세 통로를 방문할 때 ABC, ACB, BAC, BCA, CAB, CBA의 경우로 총 6개에 해당한다. 그런데 실제 실험을 진행해 보면 많은 동물에서 특정 경로 또는 방향에서 자발적 교대가 특히 잘 일어나거나 반대로 잘 일어나지 않는 경우를 볼 수 있는데 이는 각 동물간의 행동 및 방향성에 선호도 또는 특이성이 존재할 수 있음을 의미한다. 이를 뒷받침 할 수 있는 근거로 최근에 해마를 비롯하여 대뇌에서 단백질의 발현과 신호전달기전의 비대칭이 존재함이 밝혀졌다[2, 28]. 이러한 대뇌의 비대칭으로 인해 설치류에서 자발적 회전 방향의 선호도를 보이는 것으로 알려졌다[24]. 이러한 결과는 Y-미로나 T-미로를 이용하여 작업기억 능력을 측정할 때 하나의 통로에서 나와 다른 통로를 선택할 때 특정 방향을 선호할 수 있음을 의미하고 이는 곧 자발적 교대 측정법이 작업기억능력을 평가하는 데 한계가 있음을 나타낸다. 그러나 아직까지 이러한 문제점을 보완할 수 있는 분석법이 개발되지 않고 있다.

따라서 이러한 단점들을 극복하기 위하여 본 연구진은 방향의 선택성에 따른 효과를 최소화할 수 있는 수학적 알고리즘을 적용한 분석법을 개발하여 작업기억능력 분석에의 적용 가능성을 평가하고자 하였다. 이를 위해 작업기억능력을 향상시키는 것으로 잘 알려진 풍족한 환경(enriched environment)에서 사육한 마우스와 대조군을 이용하여 Y-미로 실험을 진행 하였으며 그 결과를 자발적 교대 비율과 수학적 알고리즘을 적용한 방법으로 비교 분석하였다[13].

 

재료 및 방법

실험동물

실험동물의 사육환경은 이전 논문에서 제시한 바와 같다[3]. 요약하면 본 실험은 수컷 C57BL/6 생쥐(4주령, 샘타코, 한국)를 사용하였다. 생쥐는 표준온도(22±1℃) 및 습도(50±5%)와 조명 조절 환경(오전 8시 점등, 오후 8시 소등)에서 물과 음식에 자유롭게 접근 가능하도록 사육되었다. 본 연구에서 실험동물의 관리는 미국 NIH의 관리지침(NIH Publication No. 80 - 23, 1996년 개정)에 따랐으며 실험동물의 고통을 줄이고 최소한의 실험동물을 사용하도록 설계하였으며 대구가톨릭대학교 실험동물윤리위원회의 승인을 받은 후 진행하였다(승인번호 : IACUC-2012-32).

풍족한 환경 노출군과 대조군의 사육환경

생쥐를 충족한 환경에 노출시키기 위하여 케이지는 중간형(30×70×25 cm) 또는 대형(70×70×50 cm) 크기로 제작하여 사육하였다. 케이지 안에는 운동을 위한 수레바퀴(running wheel)와 호기심을 자극할 수 있는 터널, 시소, 미끄럼틀, 모래샤워 용품, 은신처 등의 놀이 기구를 설치하였다. 호기심을 지속적으로 자극하기 위하여 풍족한 환경은 주 1회 새로운 놀이기구와 위치로 변경하였다. 이에 반하여 대조군은 정상적인 마우스 케이지(20×26X13 cm)를 사용하였다. 풍족한 환경 또는 대조환경에서의 사육은 생후 4주에 시작하여 10주간 유지되었으며 케이지 당 대조군은 3~5마리, 중간형과 대형은 11~12마리를 사육하였다.

Y-미로를 이용한 학습과 작업기억능력 측정

생쥐에서 작업기억능력을 측정하기 위하여 Y-미로를 사용하였다. Y-미로의 각 통로(arm)는 두께 0.5 cm의 검정색 불투명 아크릴을 이용하여 폭 5 cm, 길이 35 cm, 높이10 cm로 제작 하였다. Y-미로를 이용한 행동시험은 조명이 꺼지는 오후 8시에 붉은색 미등 하에서 시행하였다. 각 생쥐의 행동시험은 6분간 진행되었으며 Y-미로 위에 설치된 비디오 카메라를 이용해 녹화하였다. 각 생쥐의 행동 측정이 종료된 후 알코올을 이용하여 모든 통로의 내부를 닦아 냄새를 제거하였다. 모든 실험이 종료된 후 컴퓨터에서 동영상을 관찰하며 작업기억능력을 평가하였다.

자발적 교대 행동 분석

자발적 교대 행동은 하나의 통로를 탐방 후 나올 때 이전에 탐방했던 통로가 아닌 새로운 통로를 선택한 것을 의미한다. 따라서 각 생쥐의 행동 분석을 통하여 통로를 방문한 총 회수와 자발적 교대의 수를 평가하여 아래와 같이 구하였다.

자발적 교대 행동(%) = 자발적 교대의 수×100 / (방문한 총 회수-2)

알고리즘을 통한 엔트로피의 개발 및 행동 분석

먼저 3개의 통로를 각각 A, B, C로 명명한 후 생쥐가 6분동안 탐방했던 통로를 알파벳으로 표시하면 자발적 교대가 일어나는 경우는 ABC, ACB, BAC, BCA, CAB, CBA 등 모두 6가지에 해당한다. 따라서 각 생쥐에서 위 6가지 자발적 경로에 해당하는 횟수를 구한다. 이 각각의 값을 자발적 교대가 가능한 횟수(총 통로 방문 회수 - 2)로 나누고 그 값을 각각의 Pi 값으로 한다. 각 생쥐에서의 엔트로피는 아래 식에 의해 구한다.

엔트로피 = ΣPilogPi

위 식에 따라 각 생쥐의 엔트로피를 구한 후 각 그룹의 평균을 구하여 비교 평가한다.

통계

모든 결과는 Prizm software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)를 이용하여 student t-test 방법으로 분석하였고 p<0.05에 해당하는 경우를 유의한 차이가 있는 것으로 결론지었다.

 

결 과

풍족한 사육 환경의 제공

먼저 1차 실험으로 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 풍족한 환경 노출군은 가로, 세로, 높이 각 30×70×25 cm인 케이지를 제작하여 11마리(4주령)를 사육하였고(Fig. 1B) 대조군은 정상 케이지(20×26×13 cm)에 3~5마리씩 사육하였다(Fig. 1A). 풍족한 환경 노출군은 주 1회 새로운 소품들을 이용하여 환경을 변화시켜 주는 방법으로 10주 간에 걸쳐 지속적으로 호기심과 자발적 운동을 할 수 있도록 하였다.

Fig. 1.Environmental condition of control and enriched groups. Mice (male, 4 weeks old) were divided into two groups and animals in control group were raised in the small conventional mouse cage (20×26×13 cm) for 10 weeks. On the other hand, in enriched group 11 mice were raised in the middle sized cage (30×70×25 cm) for 10 weeks. Enriched environment was provided by installing tunnel, seesaw, slide, hideout, sand shower place, and so on and the environment was changed every week to stimulate curiosity.

Y-미로 행동 분석

풍족한 환경 또는 대조 환경에 10주간 노출 시킨 후 사육실의 전등이 소등되는 오후 8시~12시에 Y-미로 행동 시험을 실시하였다. 먼저 자발적 교대 행동을 평가한 결과 탐험한 통로의 수가 풍족한 환경에 노출된 군에서 유의하게 증가하였다(Fig. 2A). 그러나 자발적 교대 행동 비율은 대조군이 61.35±5.05%, 풍족한 환경 노출군이 54.20±5.44%로 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2B). 알고리즘을 이용한 엔트로피 결과에서도 대조군은 -0.557±0.023, 풍족한 환경 노출군은 -0.569±0.013로 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2C). 이러한 결과는 실험에 사용된 풍족한 환경 케이지가 폭이 좁고 긴 형태로써 비록 대조군에 비해서는 넓지만 사육된 마리수에 비해 풍족한 환경을 주기에 충분하지 않았음을 의미한다.

Fig. 2.Statistical analysis of working memory in mice. (A) Working memory behavior on Y maze was recorded for 6 min and compared to control group the number of arm entry was significantly increased in enriched group (26.80±1.77 vs. 35.09±1.92). ** p<0.01. (B) The percent of alternation was measured and there was no significant difference between two groups (61.35±5.05 vs. 54.20±5.44). (C) The entropy was calculated and there was no significant difference between two groups (-0.557±0.023 vs. -0.569±0.013). The number of animals was 10 and 11 for control and enriched mice, respectively and data were represented as mean ± SEM.

대형 케이지를 이용한 풍족한 사육 환경의 제공

위와 같은 결과를 반영하여 2차 실험으로 Fig. 3에 나타낸 바와 같이 풍족한 환경 노출군은 가로, 세로, 높이 각 70×70×50 cm인 케이지를 제작하여 12마리(4주령)를 사육하였고 대조군은 정상 케이지(20×26×13 cm)에 3~5마리씩 사육하였다. 1차 실험과 마찬가지로 풍족한 환경 노출군은 주 1회 새로운 소품들을 이용하여 환경을 변화시켜 주는 방법으로 10주 간에 걸쳐 지속적으로 호기심과 자발적 운동을 할 수 있도록 하였다.

Fig. 3.Environmental condition of control and enriched groups. Mice (male, 4 weeks old) were divided into two groups and animals in control group were raised in the small conventional mouse cage (20×26×13 cm) for 10 weeks. On the other hand, in enriched group 12 mice were raised in the bigger sized cage (70×70×50 cm) for 10 weeks. Enriched environment was provided by installing tunnel, seesaw, slide, hideout, sand shower place, and so on and the environment was changed every week to stimulate curiosity.

Y-미로 행동 분석

풍족한 환경 또는 대조 환경에 10주간 노출 시킨 후 사육실의 전등이 소등되는 오후 8시~12시에 Y-미로 행동 시험을 실시하였다. 2차 시험에서는 1차 실험과는 반대로 탐험한 통로의 수가 풍족한 환경에 노출된 군에서 유의하게 감소하였다(Fig. 4A). 그러나 자발적 교대 행동 비율을 평가한 결과 대조군이 62.49±2.13%, 풍족한 환경 노출군이 73.76±3.04%로 풍족한 환경 노출에 의해 유의하게 증가하였다(p=0.0044, Fig. 4B). 알고리즘을 이용한 엔트로피 결과에서도 대조군은 -0.548±0.011, 풍족한 환경 노출군은 -0.598±0.017로 엔트로피 값이 유의하게 증가하였다(p=0.0199, Fig. 4C). 특징적인 점으로 자발적 교대의 비율을 평가한 경우와 비교할 때 엔트로피를 구했을 때 두 군간의 차이가 감소하는 것을 볼 수 있다(Fig. 2B and 2C, Fig. 4B and 4C).

Fig. 4.Statistical analysis of working memory in mice. (A) Working memory behavior on Y maze was recorded for 6 min and compared to control group the number of arm entry was significantly decreased in enriched group (38.19±1.92 vs. 27.58±2.44). ** p<0.01. (B) The percent of alternation was significantly increased in enriched group compared to control group (62.49±2.13 vs. 73.58±3.04) and this data indicate that working memory was enhanced by enriched environment. ** p<0.01. (C) The entropy was significantly increased in enriched group compared to control group (-0.548±0.011 vs. -0.598±0.017) and this data support the conclusion from percent of alternation. The number of animals was 16 and 12 for control and enriched mice, respectively and data were represented as mean ± SEM. * p<0.05.

 

고 찰

본 연구는 Y-미로에서 작업기억능력을 측정하는 방법으로 사용되고 있는 자발적 교대 비율 측정법을 보완할 수 있는 새로운 평가방법을 개발하기 위해 고안되었다. 이를 위해 수학의 알고리즘을 이용한 공식을 만들었고 이를 적용하여 평가한 결과 작업기억능력을 향상시키는 것으로 잘 알려진 풍족한 환경을 제공한 결과 유의성 있는 차이를 관찰하였다. 주목할 점은 자발적 교대 비율의 통계수치와 비교했을 때 평균치의 차이는 감소하고 p 값은 증가하는 경향을 보였다(Fig. 4에서 p 값은 0.0044에서 0.0199로 증가하였음). 이는 알고리즘을 이용한 결과가 자발적 교대 행동 결과와 비교했을 때 유의성 있는 차이를 얻기가 더 어려워 보다 엄격한 평가가 가능함을 의미한다.

자발적 교대란 하나의 통로를 탐방한 후 다른 통로로 들어갈 때 이전에 방문했던 통로가 아닌 새로운 통로를 선택함을 의미한다[4]. 이 방법은 설치류가 호기심이 많은 동물이므로 새로운 통로에 대한 호기심이 있어 그 통로를 선택할 것이라는 가정에 기반하며 실제로 정상 상태의 흰쥐와 생쥐를 이용하여 측정할 때 약 60~70% 사이의 교대 비율을 나타낸다[10, 16, 22]. 특히 작업기억능력을 높여 주는 것으로 알려진 자극에 의해서 자발적 교대 비율은 증가하며 반대의 경우에는 감소하는 현상을 보이므로 많은 연구에서 작업기억능력을 측정하는 적절한 모델로 활용되고 있다[6, 17]. 그러나, 예를 들어 실험동물이 처음부터 끝까지 한 방향, 즉 시계 방향 또는 반시계 방향으로 회전할 때 자발적 교대 비율은 100%에 이르게 된다. 또한 실제 실험을 해 보면 특정 통로 또는 특정 방향에서 자발적 교대가 잘 일어나지 않거나 또는 특이적으로 많이 일어나는 경우도 확인할 수 있다. 따라서 비록 자발적 교대 비율이 작업 기억능력을 평가하는 좋은 방법이 될 수 있으나 평가 방법을 다양화하여 보다 정밀하게 분석할 필요성이 제기된다.

이에 따라 본 연구진은 수학의 알고리즘을 적용하여 엔트로피를 구하고 이를 비교하여 통계적 유의성을 찾는 방법을 고안하였다. Y-미로에서 3개의 통로를 시계 방향으로 A, B, C로 명명했을 때 자발적 교대가 일어나는 방법은 실험동물이 시계방향으로 이동했을 때 ABC, BCA, CAB 그리고 반시계 방향으로 이동했을 때 ACB, CBA, BAC 등 모두 6가지에 해당한다. 각각의 경우에 해당하는 자발적 교대의 수를 구한 후 이를 전체 통로 방문횟수-2로 나눈 값을 Pi로 한다. 이 값에 Pi의 로그값을 구하여 곱하고 6가지에 해당하는 값들을 모두 더하여 엔트로피를 구하였다. 물론 엔트로피를 이용하여 작업기억능력을 평가했을 때에도 자발적 교대가 많이 일어난 실험동물에서 엔트로피는 더 큰 음의 값을 갖게 되어 자발적 교대 비율을 측정한 결과와 마찬가지로 통계적으로 차이를 보이게 된다. 그러나, 이 모델이 갖는 장점으로는 특정 통로 및 방향에서 집중되어 자발적 교대가 일어난 경우보다 모든 통로 및 방향에서 자발적 교대가 일어난 경우가 보다 큰 음의 값을 가지게 된다는 점이다. 결국 본 연구진이 개발한 엔트로피를 이용하여 작업기억능력을 측정할 때 두 가지 조건, 즉 많은 자발적 교대가 일어나고 그 자발적 교대가 어느 한 통로 또는 방향에서 선호도를 보이지 않고 모든 통로 및 방향으로 고르게 나올 때 엔트로피는 더욱 큰 음의 값을 갖는 것이다. 예를 들어 실험동물이 질병이 있거나 대뇌의 비대칭이 있는 등 작업기억이라기 보다는 단지 방향의 선택성이 있어 극단적으로 처음부터 끝까지 한 방향으로만 계속 돌았다고 가정할 때 자발적 교대비율은 100%에 해당하나 엔트로피를 이용할 때에는 6가지의 경우 중 반대 방향으로의 경우에서는 엔트로피 값이 0이 나오므로 엔트로피 값은 크지 않다. 또한 실험 결과에서 알 수 있듯이 엔트로피를 이용할 경우 두 군의 통계치에서 평균의 차이가 감소하고 student t-test 결과 p 값은 증가함을 볼 수 있다. 이러한 결과로 볼 때 본 연구진이 개발한 엔트로피를 이용하여 작업기억능력을 평가할 경우 지금까지 사용하고 있는 자발 적 교대의 비율을 이용한 평가와 비교할 때 유의성 있는 차이를 보이는 결과를 얻기가 더 어려움을 의미하고 이는 곧 분석 결과의 신뢰도 향상을 의미한다. 또한 Y-미로를 이용한 실험 결과를 자발적 교대 비율과 엔트로피를 함께 이용하여 분석하면 보다 세밀한 분석이 가능하다. 예를 들어 자발적 교대 비율은 통계적으로 유의하게 증가하였으나 엔트로피에는 유의한 차이가 없다면 자발적 교대가 특정 통로 또는 특정 방향에서 집중적으로 일어났을 가능성을 제시하므로 실험 결과를 보다 신중하게 해석해야 한다.

설치류에서 학습과 기억 능력을 측정함에 있어 알고리즘을 적용한 분석법은 아직 많지 않다. 현재까지 적용된 알고리즘 분석법을 예를 들면, 게이팅 모델(gating model)에서 설치류의 강화학습(reinforcement learning) 능력을 평가하기 위한 알고리즘이 보고되었다[15]. 또한 공포 조건화(fear conditioning) 실험에서도 동결거동(freezing behavior)을 분석하기 위한 알고리즘이 보고된 바 있다[11]. 그러나 아직까지 Y-미로에서 자발적 교대 실험은 알고리즘을 이용한 적절한 분석법이 개발되지 못하였다. Y-미로를 이용한 자발적 교대는 방향의 선택을 의미하므로 대뇌 비대칭이나 질환 등에 의한 방향 선택의 선호도는 결과에 큰 영향을 미친다. 따라서 Y-미로에서 방향 선택의 선호도에 의한 오류를 최소화 할 수 있는 분석 방법의 개발이 시급한 과제이다.

본 연구를 통해 우리는 Y-미로에서 작업기억 행동시험을 분석할 수 있는 엔트로피 계산식을 이용한 새로운 방법을 제시하였다. 이 평가법은 자발적 교대의 비율을 반영할 뿐만 아니라 실제 자발적 교대가 일어나는 통로와 방향의 편중여부도 함께 반영한다. 따라서 지금까지 사용해 오던 자발적 교대 비율의 평가와 더불어 사용될 때 Y-미로에서 작업기억의 차이를 보다 세밀하고 정확하게 분석하는 지표로 활용될 수 있을 것으로 기대한다.