서 론
비만과 제 2형 당뇨 환자들의 경우 정상인과 비교하였을때 복직근(rectus abdominis muscle)에서의 중성지방 함량이 높게 측정되는데, 이러한 근육세포 내 높은 중성지방(intramyocellular triacylglycerol, IMTG) 함량은 대부분 인슐린 민감성(insulin sensitivity)과 반비례 경향을 나타낸다[10, 12, 18]. 골격근 내 과도한 지방 축적은 긴사슬지방산(long chain fatty acid, LCFA)의 흡수율과 산화율의 불균형으로 인해 일어난다[12]. LCFA는 세포의 주요 에너지원으로, 대사적 에너지를 저장하는 중성지방 합성의 중요 요소로 알려져 있다[4]. 그러나 근육 내 LCFA의 흡수 증가와 산화 감소, 중성지방 합성 및 축적의 증가는 인슐린 저항성을 일으키고, 이는 비만과 당뇨의 주 원인이 될 뿐만 아니라 대사 증후군, 심혈관 질환의 주요 발생 원인이 되기도 한다[3, 12].
이와 같이 골격근 내에서의 LCFA 흡수와 산화 균형을 적정하게 유지시키는 것은 다양한 대사관련 질병을 예방 또는 개선 시키기 위한 주요 기전으로 볼 수 있다. 이러한 LCFA의 흡수와 저장 및 사용을 적정 수준으로 유지하는데 중심적인 역할을 하는 것이 지방산 수송체(fatty acid transporter proteins, FATPs)이다. 지방산 수송체는 골격근을 비롯한 다양한 조직에서 LCFA의 수송을 통해 지방대사를 매개하며, FABPpm (plasma membrane-bound fatty acid binding protein), FAT/CD36 (fatty acid translocase), FATP (fatty acid transporter) 등이 밝혀져 있다[7].
FABPpm은 세포막의 외부에 위치한 말초 세포막 단백질 (peripheral membrane protein)로[5, 19], 포유류의 대부분의 조직, 특히 심장에 많이 발현되며[2, 6, 15], 골격근의 경우, 속근(glycolytic muscle)에 비해 지근(oxidative muscle)에 FABPpm 함량이 더 높은 것으로 알려져 있다[4, 13]. FABPpm은 지방산을 세포 내로 수송하는 역할을 하는데[5, 6], 이를 쥐의 골격근에서 과발현 시키자, 근초(sarcolemmal)에서의 지방산 수송과 대사가 증가하는 것으로 밝혀졌다[6]. 또한 저항성 운동을 실시하자 골격근에서의 FABPpm의 발현이 증가하였고, 지방산 활용 능력 역시 증가하였다고 보고하였다[13].
IGF-I (insulin-like growth factor-I)은 골격근 세포의 성장, 분화 등의 중요한 매개체이며[8, 9, 14], 그에 따른 근 부피의 유지 및 비대, 근력 강화와 근육의 재생에 핵심적인 역할을 한다[1, 9, 11]. 최근에는 IGF-I의 골격근에서의 동화작용 효과 뿐만 아니라 인슐린 증감작용(insulin-sensitizing action)을 중재하는 역할도 하는 것으로 밝혀졌다[7, 16]. 따라서 IGF-I이 인슐린과 같은 대사 관련 호르몬을 조절하는 역할 과 더불어 다양한 대사 관련 기전에 미치는 영향에 대한 연구의 필요성이 제시되고 있다. 그러나 골격근 에너지 대사에 있어 IGF-I이 지방 에너지 대사 관련 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 골격근 세포에서 지방산 흡수 및 저장, 사용 정도의 적정 균형을 유지 하는데 중심적인 역할을 하는 FABPpm의 발현에 있어 IGF-I이 어떠한 영향을 미치는 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
세포 배양 및 시약 처리
본 연구에서 사용된 C2C12 골격근 세포는 American Type of Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 U/ml 의 penicillin G, 100 μg/ml 의 streptomycin sulfate (Welgene, KOREA)를 함유하고 있는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Welgene, KOREA)으로 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다. 세포는 35 mm plate에 2.5×105개씩 분주하여 90% 이상 자라도록 배양한 뒤, 배지를 제거하고 2% horse serum (HS) (Hyclone, Logan, UT)이 함유된 분화배지, IGF-I을 함유한 분화배지로 교체하여 24-96시간 동안 배양하였다. 또한 20 ng/ml 의 IGF-I (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 시간 별로 처리하여 FABPpm의 mRNA와 단백질 발현 변화를 알아보았다.
RNA 추출 및 cDNA 합성
RNA 추출은 TRIzol 용액(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용한 phenol-chloroform 기법을 사용하였다. TRIzol 용액을 well 당 각 600 μl 씩 넣고, 150 μl의 chloroform을 처리하여 섞어준 뒤 4℃, 13,000 rpm에서 15분간 원심 분리를 하였다. 상층액을 분리한 뒤, isoprophanol과 1:1 비율로 섞어 4℃, 12000 rpm에서 10분간 원심분리를 하였다. 이때 생성된 pellet을 DEPC 용액으로 희석한 75% EtOH을 이용하여 씻은 다음 4℃, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리를 하였다. 최종적으로 추출된 pellet은 상온에서 10분간 완전히 건조시킨 뒤 ultra pure water 30 μl에 녹여 UV 흡광도 260 nm에서 농도를 측정하였다. 1 μg/μl의 RNA를 cDNA master mix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 혼합하여 25℃에서 10분, 42℃ 에서 60분, 그리고 95℃에서 5분간 PCR 을 이용해 cDNA를 합성하였다.
Real-time RT-PCR
FABPpm의 mRNA 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green PCR master mix (Kappa, USA)를 사용하여 real-time RT-PCR (ABI PRISM 7700 system, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)을 실시하였다. 이 때 사용한 모든 Primer는 마크로젠(Macrogen, KOREA)에서 제작 및 구입하여 사용하였으며, 사용된 primer sequence는 Table 1에 제시되었다. 모든 샘플은 3회 반복 실험하여 합성시킨 cDNA를 2회 이상 반복 측정하였다. 95℃ 15초, 60℃ 30초간 40 cycle을 측정하여 CT 값을 얻어내고, 융해 곡선 확인을 위해 40 cycle 이후 dissociation stage를 2회 반복하였다. 결과는 단순 CT 값 비교 분석 방법을 사용하였으며, mRNA 발현양은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 CT 값으로 상대 정량 하여 보정하였다.
Table 1.Primer sequences for real-time RT-PCR in this study
면역 형광 염색
분화배지 또는 IGF-I을 처리한 C2C12 세포를 PBS로 한번 씻어낸 후, 1 ml의 4% formaldehyde를 이용해 상온에서 20분간 처리하여 plate에 세포를 고정시켰다. 그 후 TBS로 2회 씻어 내어, 0.2% triton X-100을 함유한 TBS (0.2% TBST)로 5분간 상온에서 permeabilizing 하였다. 그 다음 0.1% TBST로 5분간 3번 씻어낸 후, blocking을 위해 5% BSA를 함유한 0.1% TBST로 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 TBS로 1회 씻어낸뒤, 3% BSA를 함유한 TBS에 FABPpm monoclonal mouse antibody (Abcam, Cambridge, UK)를 1:500으로 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 후, 0.1% TBST로 5분간 3회 세척한 뒤, Alexa 568-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 3% BSA에 1:250으로 희석하여 상온에서 20분간 반응시킨 다음 0.1% TBST로 5분간 3번 씻어내었다. 세포 사진은 digital imaging system이 갖춰진 Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany)로 촬영하였다.
자료처리
IGF-I 처리에 따른 C2C12 세포에서의 FABPpm mRNA 발현의 유의성 검증을 위하여 SPSS 18.0 for window를 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였다(p<0.05).
결 과
FABPpm의 mRNA 발현
C2C12 골격근 세포가 myotube로 분화하는데 있어 FABPpm 유전자의 mRNA 발현에 어떠한 변화가 나타나는지 측정해본 결과, Fig. 1A와 같이 FABPpm이 시간 의존적으로 증가되었음을 알 수 있었다. Myotube로 분화를 유도한지 24시간을 기준으로 보았을 때, 48시간 동안 분화를 유도한 경우 FABPpm의 mRNA 발현이 약 7%, 72시간 동안 분화시킨 경우 약 96% 가량 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않으며, 96시간이 경과하였을 때는 약 262% 유의하게 증가하였다. 한편, 시간 별(24, 48, 72, 96시간)로 IGF-I 20 ng/ml를 처리한 결과, 제시된 Fig. 1B과 같이, IGF- I 을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 때와 달리 시간에 따른 일정한 결과를 얻을 수 없었다. 분화배지와 IGF-I 처리를 한 후, 시간 별로 비교하였을 때 24 시간이 지났을 때는 약 130%(Fig. 1C), 48시간이 경과하자 약 179%로 유의하게 증가하였다(Fig. 1D). 72시간이 경과한 경우 약 12% 가량 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았다(Fig. 1E). 반면 96시간이 경과한 경우에는 FABPpm의 발현이 감소하는 상반되는 결과를 나타내었으나 통계적으로 유의하지 않았다(Fig. 1F).
Fig. 1.FABPpm mRNA levels determined by real-time RT-PCR in C2C12 myotubes. FABPpm mRNA were time dependently expressed on differentiation medium (A). Expression of FABPpm mRNA on differentiation medium treated with 20 ng/ml of IGF-I (B), Regulation of FABPpm by IGF-I in C2C12 myotubes for 24 hr (C), 48 hr (D), 72 hr (E), or 96 hr (F) in the absence or presence of IGF-I (20 ng/ml). Target mRNA values are shown normalized to the GAPDH mRNA level for each sample. Samples were analyzed in duplicate in parallel with GAPDH. Values are means ± SE from three independent experiments. *p<0.05 vs. control.
FABPpm의 단백질 발현
C2C12 근원세포가 다핵의 myotube를 형성하여 골격근 세포로 분화하는 과정에 있어 IGF-I이 FABPpm 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 이를 위해 24, 48, 72, 그리고 96시간 동안 분화배지로 분화를 유도하였고, 분화를 유도하는 과정에서 20 ng/ml의 IGF-I을 처리하여 면역 형광 염색(immuno-cytochemistry)을 실시하였다. 그 결과, Fig. 2에 제시된 바와 같이 24시간 동안 분화배지와 IGF-I을 각각 처리 한 두 조건에서는 모두 완벽한 myotube의 형태가 아닌 근원세포에 가까운 형태로 관찰되었다. 그러나 IGF-I을 처리하였을때는 처리하지 않은 조건에 비해 myotube를 형성하기 시작하는 형태를 보였으며, 더욱 많은 수의 근원세포와 두드러진 FABPpm의 발현 관찰할 수 있었다. 동일한 조건으로 24시간을 더 관찰한 결과, 48시간이 지난 후에는 IGF-I을 처리한 조건에서 더욱 선명한 형태의 myotube를 볼 수 있었으며, FABPpm 단백질이 증가된 것을 관찰 할 수 있었다. 더 나아가 72시간이 지나자, IGF-I을 처리한 경우 더욱 굵고 선명한 형태의 myotube를 관찰 할 수 있었고, 전반적으로 더욱 증가된 FABPpm 단백질을 확인 할 수 있었다. 반면, 96시간이 지나자 그림에서 처럼 IGF-I을 처리한 조건에서 처리하지 않은 조건에 비해 선명하지 못한 myotube의 형태와 FABPpm 단백질을 관찰 할 수 있었다. 이와 같이 C2C12 골격근 세포의 분화 과정에 있어 IGF-I은 전체적인 FABPpm의 발현을 증가시키고, 특히 myotube를 형성하는 과정에서 FABPpm 발현을 더욱 증가시키는 것을 알 수 있었다.
Fig. 2Immunocytochemistry image showing the effect of IGF-I-induced FABPpm expression in C2C12 myotubes. C2C12 cells were treated with 2% horse serum media (differentiation media, DM) containing 20 ng/ml of IGF-I for various periods of time (24-96 hr). FABPpm is stained fluorescent red.
고 찰
생명체의 생존을 위한 대표적인 에너지 대사 시스템은 탄수화물과 지방 대사 시스템으로, 특히 탄수화물 대사는 많은 연구들을 통해 글루코스 운반 수송체(glucose transporters, GLUTs)가 에너지 항상성 유지를 위한 역할을 하는 것으로 밝혀져왔다. 이 때, GLUTs는 글루코스를 저장하고, 에너지 생성을 위해 필요로 하는 장기로 글루코스를 분배하는 등의 역할을 한다. 이와 마찬가지로 또 다른 에너지 대사 시스템인 지방대사 시스템에 있어 LCFA의 저장 및 운반, 사용 등은 에너지 생성 및 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라 LCFA 저장 및 사용 불균형은 비만과 당뇨, 심혈관 질환 등의 질병을 초래하는 것으로 알려졌다. 따라서 지방산 수송체가 지방산을 저장하고, 운반하는 기전을 밝히고자 하는 연구들이 활발히 이루어지고 있다.
현재 골격근 세포에서 LCFA를 저장 및 사용을 중재하는 단백질로 FATP1, FAT/CD36, 그리고 FABPpm 등이 밝혀져 있다. 이들은 각각 여러 기관에서 발현되며, 특히 골격근의 세포막, 또는 미토콘드리아 막에 위치하여 LCFA의 저장 및 사용을 매개하고 있으며, 지방산 수송체 발현 증가는 골격근에서의 LCFA 흡수와 산화 증가를 조절시킨다고 알려져 있다[12]. 이러한 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 골격근 세포의 성장 및 분화에 따른, 그리고 인슐린 구조 및 신호 체계와 유사하고 골격근 세포의 대사에 있어 중요한 역할을 하는 IGF-I이 FABPpm mRNA 및 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.
첫째로, C2C12 골격근 세포의 분화 과정에 있어 FABPpm의 mRNA 발현이 myotube로 분화함에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 이전까지의 선행연구에서는 근육조직에서 지방산 수송에 관여하는 유전자의 발현과 세포 내에서의 이동, 지방산 저장 및 산화 메커니즘에 연구가 집중되어왔다. 또한 C2C12 골격근 세포의 성장 및 분화, 특정 유전자의 세포 성장 및 분화 관여, 또는 근 비대와 위축 기전 등을 규명하는데 집중 되어왔던 반면, 근육 세포가 분화하는 과정에서의 지방산 수송과 같은 대사적인 측면에서의 연구는 미비하였던 것이 사실이다. 따라서 본 연구에서는 C2C12 골격근 세포의 분화과정에서 지방산 수송체인 FABPpm의 발현이 myotube로 분화됨에 따라 증가한 것을 처음으로 관찰하였다는 것에 의의가 있다.
FABPpm이 인슐린 또는 운동에 의해 발현이 증가되고 활성화되면 세포막으로 이동하며, 이러한 이동은 지방산의 저장과 산화를 증가시키는 영향을 미친다고 알려져 있다. 본 연구에서는 IGF-I이 C2C12 골격근 세포의 myotube 형성 과정에서 두 유전자의 단백질 발현을 증가시키는 것은 확인할 수 있었으나, 세포막으로의 이동은 확인할 수 없었다. IGF-I에 의해 FABPpm의 발현은 증가하였으나 세포막으로의 이동에는 또다른 인자들이 작용하였을 것으로 추측된다.
이러한 결과들을 바탕으로 실제로 IGF-I이 FABPpm의 발현을 증가시킴으로써, 지방산 세포의 흡수 및 저장과 산화 능력을 증가시켰는지를 논의해볼 필요가 있다. Talanian 등[20]은 일반 여성들을 대상으로 6주간 운동시킨 결과, 근육 내에서의 FABPpm의 발현이 증가되었고, 그에 따라 지방 산화 능력 증가와 함께 혈장 내 유리지방산(free fatty acid)이 증가되었다고 보고하였다. 혈중 내 유리지방산의 증가는 운동을 통한 지방산 수송체의 발현 증가가 지방 산화 증가로 이어지면서 더욱 많은 지방산을 에너지로 사용한 결과로 설명할 수 있다. 뿐만 아니라 지구성 운동 선수들은 IMTG 농도가 증가되어 있는데[17], 이는 지구성 운동 선수들의 지방 산화 능력 증가에 따라 운동 시 IMTG 산화를 위한 IMTG의 저장을 증가시킨 결과로 볼 수 있다. 이러한 결과들을 바탕으로 운동에 의한 지방산 수송체 증가는 지방 산화 능력 증가와 함께 지방산 흡수 및 저장능력도 증가시키는 것으로 볼 수 있다. 이러한 선행 연구 결과들을 바탕으로 차후 운동에 의한 IGF-I의 증가가 FABPpm의 발현을 증가 시키는데 있어 지방산 흡수 및 저장과 산화 증가에 협력하는 역할을 하는 다른 인자들과의 상호작용에 대한 연구가 함께 진행되어야 할 것이다.