재료 및 방법
실험재료 – 약용식물은 2011월 6월부터 2013년 9월까지 중국에서 채취되어, 가천대학교 생명과학과 김주환 교수의 감정을 거친 후 실험 재료로 사용되었다(Table I). 사용한 실험 재료의 증거표본은 한국한의학연구원 표본실에 보관 중이다.
Table I.IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.
추출 및 시료조제 – 분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P2O5를 이용하여 24시간 이상 재건조한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며 최종 DMSO의 농도가 0.2%가 되도록 15% TWEEN 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급시약을 사용하였다.
In vitro에서 최종당화산물 생성저해 실험 – Vinson과 Howard12)의 방법을 변형하여 실험을 실시하였다. 본 실험에서는 10 mg/ml의 우혈청 알부민(bovine serum albumin, Sigma)을 0.2 M phosphate buffer(pH 7.4)에 용해시키고, 0.2 M의 fructose와 glucose를 처리하였다. 이 때 0.2M phosphate buffer에 0.02% sodium azide를 넣어 반응기간 동안 박테리아의 생성을 방지하였다. 이 반응액에 추출물 또는 최종당화산물 생성저해제인 aminoguanidine을 넣은 후 37℃에서 7일 동안 반응시켰다. 이때 시료의 IC50값을 구하기 위해 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 75 μg/ml의 7개 농도에서 실험 하였다. 배양 후에는 spectrofluorometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 형광도를 측정하였다(Ex: 350, Em: 450nm). IC50값은 n=3으로 하여 계산되었다.
결과 및 고찰
최종당화산물은 신장, 안구, 뇌 등 조직 내 단백질과 반응하여 각 장기에 축적되어 당뇨병성 신증(Diabetic nephropathy), 망막증(D. retinopathy), 백내장(D. cataract), 신경병증(D. neuropathy) 등의 당뇨합병증으로 진행된다.4,5) 본 연구팀은 최종당화산물 생성을 강력하게 억제하는 천연물 소재를 발굴하기 위하여 많은 천연소재들의 효능을 검색 발표하였다.13-22)
본 연구에서도 중국에서 자생하는 약용식물 111종의 에탄올 추출물을 이용하여 최종당화산물 생성 저해 효능을 측정하였다. 양성 대조 약물인 aminoguanidine의 IC50값(76.47±4.81 μg/ml)을 근거로 하여, 추출물이 IC50: <50 μg/ml이면 효능이 있다고 판단하였다. 24종의 식물 추출물에서 IC50: <10 μg/μl로 최종당화산물 생성 저해 효능을 보였고, 그 중에서 9종의 추출물 Barleria cristata의 잎(4.97±0.10 μg/ml), Calotropis gigantea의 줄기(2.08±0.32 μg/ml), Ardisia virens의 잎(2.93±0.06 μg/ml), Dalbergia yunnanensis의 잎(3.52±0.30 μg/ml) Pittosporum runcatum의 잎(1.93±0.11 μg/ml), Ardisia japonica의 잎(1.93±0.12 μg/ml), Rhododendron racemosum의 소지(3.70±0.13 μg/ml), Oxyria sinensiss의 지상부(3.51±0.13 μg/ml), Pyrrosia calvata의 전초(3.88±0.11 μg/ml)는 IC50가 5 μg/ml 이하로 aminoguanidine보다 약 15-40배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.
쥐꼬리망초과 B. cristata의 잎은 항염효과가 있으며,23) 간 손상이 유발된 쥐에서 간보호 효과가 있다고 보고되었다.24) 또한 잎에 함유되어 있는 alkaloids, flavonoids, glycosides, saponins, phenols, tannins가 항산화효과가 있다고 보고되었다.25) 잎의 분획에서 얻은 saponin은 Klebsiella Pneumonia, Staphylococcus aureus, E.coli, Aspergillus parasites에 대해 항균작용을 한다고 보고되었다.26) 또한 건조한 씨앗이 당뇨모델 쥐에서 혈당을 낮추어 항당뇨 소재로서 가능성이 있다고 보고되었다.27) 박주가리과의 C. gigantea는 지상부가 지사제작용,28) 뿌리는 해열작용,29) 항균작용30) 구강암세포와 백혈병세포에 대해 세포독성을 나타내 항암작용에 효과가 있다고 보고되었다.31) 꽃은 진통작용,32) 잎은 항균작용을 한다고 보고되었고,33) 꽃과 잎의 추출물은 당뇨 모델 쥐에서 free radical 소거 활성을 나타낸다고 보고되었다.34) C. gigantea는 carbon tetrachloride로 인해 간손상이 유발된 쥐의 간보호 효과가 있다고 보고되었다.35) 자금우과의 Ardisia virens의 뿌리와 줄기에서 분획한alkyl benzoquinones 성분이 유방암과 중추신경계암세포에서 세포독성을 나타내 항암작용을 한다고 보고되었다.36) 콩과의 D.yunnanensis는 당뇨합병증의 발병기전 중 하나인 알도즈 환원 효소의 억제제로서 효과가 있다고 보고되었다.37) 앵초과의 A. japonica의 지상부는 anti-humanimmunodeficiency virus(HIV-1) 효과가 있으며,38) 인슐린 신호억제에 관여하여 당뇨병 치료제 개발의 표적이 되고 있는 protein tyrosin phosphatase 1B(PTP1B) 억제 효과가 있다고 보고되었다.39) 또한 생리활성 물질인 triterpenoid saponin이 함유되어 있으며, 이는 간암세포에 대해 항암효과가 있다고 보고되었다.40-42) 돈나무과의 P. runcatum, 진달래과의 R. racemosum, 마디풀과의 O. sinensiss, 고란초과의 P. calvata는 효능 및 성분에 관한 연구가 진행된 바 없으며, 위 언급된 9종의 약용 식물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 보고된 바 없었다. 9종 모두 양성 대조 약물 보다 15-40배 이상 최종당화산물 생성 억제 효능이 우수한 것으로 확인되었으므로, 전임상 실험을 통해 in vivo효능 확인이 필요하다고 생각된다. 본 연구 결과는 중국 약용식물로부터 안전하고 효능이 좋은 최종당화산물 생성 저해제 후보를 발굴하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있으며, 당뇨에 의해 나타나는 합병증 치료제 개발의 기반을 구축하는데 기여할 수 있을 것이다.
결 론
기원이 확인된 중국산 약용식물 111종의 에탄올 추출물이 in vitro에서 최종당화산물 생성저해 효능이 검색되었다. 그 결과 24종이 양성대조군인 aminoguanidine 보다 우수한 효능이 있음을 확인하였고, 특히 B. cristata의 잎, C. gigantea의 줄기, A. virens의 잎, D. yunnanensis의 잎 P. runcatum의 잎, A. japonica의 잎, R. racemosum의 소지, O. sinensiss 의 지상부, P. calvata 의 전초, 9종의 추출물은 양성대조군 보다 15-40배 억제 효능이 우수하므로 당뇨합병증 예방 및 치료제로 개발될 가능성이 있다.