Korean Journal of Plant Resources (한국자원식물학회지)

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Genetic Variation of Pinus densiflora Populations in South Korea Based on ESTP Markers

ESTP 표지를 이용한 국내 소나무 집단의 유전변이

  • Received : 2014.09.13
  • Accepted : 2014.11.17
  • Published : 2015.04.30
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Abstract

Genetic diversity and genetic differentiation of thirteen Pinus densiflora populations in South Korea were estimated using nine ESTP (Expressed Sequence Tag Polymorphism) markers. The numbers of allele and the effective allele were 2.2 and 1.8, respectively. The percentage of polymorphic loci (P) was 98.8%. The observed and the expected heterozygosity were 0.391 and 0.402, respectively, and the eleven populations except for Ahngang and Gangneung population were under Hardy-Weinberg equilibrium state. The level of genetic differentiation (Wright’s FST = 0.057) was higher than those of isozyme or nSSR markers. We could not find out any relationship between the genetic distance and geographic distribution among populations from cluster analysis. Also, the genetic differentiation between populations was not correlated with the geographic distance (r = 0.017 and P = 0.344 from Mantel test). From the result of FST-outlier analysis to identify a locus under selection, six loci were detected at confidence interval of 99% by the frequentist’s method. However, only three loci (sams2+AluⅠ, sams2+RsaⅠ, PtNCS_p14A9+HaeⅢ) were presumed as outliers by Bayesian method. The sams2+AluⅠ and sams2+RsaⅠlocus were originated from the sams2 gene and seemed to be the loci under balancing selection.

소나무의 유전다양성과 유전구조를 추정하기 위해 9개의 ESTP 표지를 13개 소나무 집단에 적용하였다. 소나무 집단의 유전다양성은 관찰된 대립유전자 수(A)가 2.2개, 유효 대립유전자 수(Ae)가 1.8개, 다형적 유전자좌 비율(P)이 98.8%, 이형접합도 관찰치(Ho)가 0.391, 이형접합도 기대치(He)가 0.402로 나타났다. 안강과 강릉 집단을 제외한 11개 집단이 하디-바인베르그 평형을 만족하였다. 집단간 유전분화도(FST)는 0.057으로, 동위효소나 nSSR 표지분석 결과보다 강하게 나타났다. 군집분석에서 집단의 유전적 거리와 지리적 분포간에 뚜렷한 연관성은 확인할 수 없었으며, 집단의 유전분화와 지리적 인접성도 상관이 없는 것으로 나타났다(Mantel 검증, r = 0.017, P = 0.344). 유전자좌에 대한 FST-outlier 분석을 실시한 결과, 빈도주의 방법에서는 FST 값이 신뢰하한 이하인 3개 유전자좌와 신뢰상한 이상인 3개 유전자좌가 특이값으로 추정되었고, 베이즈 방법에서는 3개 유전자좌들만 특이값으로 확인되었다. 두 방법에서 공히 특이값으로 판정된 3개 유전자좌(sams2+AluⅠ, sams2+RsaⅠ, PtNCS_p14A9+HaeⅢ)중 sams2 표지에서 유래된 2개 유전자좌는 balancing selection의 영향을 받는 것으로 추정되었다.

Keywords

서 언

소나무(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)는 소나무과(Pinaceae) 소나무속(Genus Pinus)에 속하는 수종이다. 우리나라에 분포하는 소나무는 중생대 백악기, 신생대 제3기 마이오세, 제4기 플라이스토세, 홀로세 기간을 거쳐 현재 한랭한 북부 고산지대부터 온난한 제주도 해안가에 이른다. 따라서 분포역이 우리나라에 자생하는 소나무 속 수종들 중 가장 넓다(Kong et al., 2014). 소나무와 같은 임목수종은 많은 세대를 거치면서 환경 변화에 지속적으로 영향을 받게 되고 그에 따른 적응과정을 겪는다. 적응과정에서 살아남은 집단이나 개체에서는 선발영향을 받은 유전자에 의해 집단의 유전구조가 변화하게 되는데 이를 적응유전변이(adaptive genetic variation)라 한다(Holderegger et al., 2006). 임목을 대상으로 하는 적응유전변이 연구에는 중요형질과 관련된 유전자를 찾아 염기서열상의 선발효과를 확인하는 방법과 표지를 이용하여 유전자좌에서 나타난 선발효과를 확인하는 방법이 주로 시도되고 있다(Garcia-Gil et al., 2003). 유전자의 염기서열을 확인하는 방법은 정확성은 높지만 대부분의 중요 형질이 다수의 유전자가 관련되어 있는 양적형질이기 때문에 관련 유전자를 탐색하기 위해서는 많은 시간과 비용이 필요하다. 표지를 이용하는 방법은 빠르고 간편하게 분석할 수 있는 장점이 있지만, 동위효소나 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats) 같은 대부분의 분자표지는 진화중립적(selectively neutral)으로 적응변이와의 상관성이 없는 것으로 나타났다(González-Martínez et al., 2006a; Karhu et al., 1996).

EST (Expressed Sequence Tags) 표지는 유전체 내에서도 coding region에 존재하는 정보를 이용하기 때문에 중요 형질과 관련된 유전자 연구에 적합하다(Krutovskii and Neale, 2005). 짧은 single copy DNA 염기서열 영역을 프라이머로 이용하는 STS (Sequence Tag Site) 방법을 이용하기 때문에 특이성과 재현성이 높은 장점을 가지고 있으며(Olson et al., 1989), 공우성 DNA 표지로 유전자 지도 작성과 비교 연구 및 집단의 유전다양성과 유전구조 추정에 유용하게 사용될 수 있다(Chagné et al., 2004). ESTP 표지는 PCR 산물을 전기영동 하여 나타난 증폭산물의 다형성으로 변이를 확인하지만, PCR 산물만으로 다형성을 확인하지 못할 경우 RFLP 분석을 추가적으로 수행함으로써 제한효소 인식부위에 나타난 변이를 추적한다. EST표지 종류로는 EST-SSR, EST-SNPs, Insertion & Deletion (Indels), ESTP (Expressed sequence tag polymorphism), COS (Conserved orthologue set) 등이 알려져 있다(Gupta and Rustgi, 2004; Seo et al., 2013).

침엽수류를 대상으로 목부 조직형성 및 뿌리 발달과 같은 생장형질이나 bud burst, 내한성, 건조스트레스 같은 환경변화에 대한 생리적 반응 등 적응유전변이 연구를 위해 EST 분석이 이용되었으며(Allona et al., 1998; Cairney et al., 2006; Lorenz et al., 2006; Liang et al., 2007; Ralph et al., 2008), Picea mariana (Perry and Bousquet, 1998)를 비롯하여 다수의 침엽수를 대상으로 EST 표지 개발이 이루어졌다(Harry et al., 1998; Temesgen et al., 2001; Komulainen et al., 2003; Chagné et al., 2003; Brown et al., 2004; Chagné et al., 2004; Gonz á lez-Martínez et al., 2006b; Eckert et al., 2009). 최근에는 EST표지를 이용한 침엽수류 집단 수준에서의 적응유전변이 구명도 활발히 이루어지고 있다(Schubert et al., 2001; Jaramillo-Correa et al., 2001; Achere et al., 2005; Tsumura et al., 2007; Eckert et al., 2009).

본 연구는 침엽수류에서 개발된 ESTP 표지를 우리나라 소나무 집단에 적용하여 유전다양성과 유전구조를 분석하고, EST 표지중에서 선발 영향을 받았을 것으로 기대되는 특이적 유전자좌를 구명하여 집단의 유전구조 변화에 미치는 효과를 알아보고자 수행되었다.

 

재료 및 방법

공시시료

전국에 분포하는 13개 소나무 집단으로부터 개체간 최소 50 m 간격을 두고 집단 당 30개체 이상에서 침엽을 채취하였다(Fig. 1). 침엽으로부터 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다.

Fig. 1.Location of 13 Pinus densiflora populations in South Korea.

ESTP 표지 분석

Pinus taeda (Temesgen et al., 2001; Komulainen et al., 2003; Brown et al., 2004; González-Martínez et al., 2006b), Pinus sylvestris (Komulainen et al., 2003), Pseudotsuga menziesii var. menziesii (Eckert et al., 2009)에서 개발된 EST 영역을 포함하는 PCR 분석용 primer를 제작하였다(Table 1). PCR 반응용액은 20 ㎕당 20 ng template DNA, 1 × reaction buffer, 0.2 μM forward primer, 0.2 μM reverse primer, 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 1 Unit Taq DNA polymerase가 포함되었다. PCR 증폭은 94℃에서 5분간 초기 변성 후에 94℃ 1분 변성, primer에 따라서 55℃~65℃에서 1분 결합, 72℃ 2분의 중합과정을 35회 반복하고, 72℃에서 5분간 최종 중합하였다. PCR 증폭산물의 크기에 다형성이 있는 경우는 EST 표지로 사용하고, 개체 간 크기에 차이가 없는 PCR 증폭산물은 4bp-cutter 제한효소를 이용하여 EST-RFLP 표지를 선발하였다. 증폭산물 분획은 2% agarose gel에서 전기영동 하였다.

Table 1.Information on EST primer sequence, PCR product size, functional gene and the original species

통계 분석

유전자좌간 연관불평형(Linkage disequilibrium) 검증을 위하여 마르코프 연쇄 방법으로 조건부 확률 분포(10,000 demorization step, 100 batch, 5,000 iteration)를 구하고 Fisher의 정확성검증(95% 유의수준)을 Genepop v4.2.1 (Rousset, 2008) 프로그램으로 수행하였다. GeneAlEx 6.4 프로그램(Peakall and Smouse, 2006)을 이용하여 대립유전자 수(A), 유효대립유전자 수(Ae), 다형성 유전자좌 비율(P), 이형접합도 관찰치(HO), 이형접합도 기대치(He)를 구하고, Wright의 F 통계량을 추정하였다. FSTAT v2.9.3.2 프로그램(Goudet, 2002)을 이용하여 집단별 근교계수(Inbreeding coefficient: F)를 구하고, 하디-바인베르그 평형 검증을 수행하였다. Nei의 유전적 거리를 기초로 Phylip v3.695 프로그램(Felsenstein, 2002)을 이용하여 UPGMA 방법으로 군집분석을 실시하였다. Structure v2.3.1(Pritchard et al., 2000)프로그램을 이용한 베이즈 군집분석(Bayesian cluster analysis)에서 5,000번 burn-in 후 20,000번의 MCMC 시뮬레이션을 20회 반복하여 최적 군집수를 추정하였다(Evanno et al. 2005). 선발 영향을 받은 유전자를 추정하기 위해 Beaumont and Nichols (1996)에 따라 집단의 유전분화는 Island model, mutation은 Infinite allele mutation model로 상정하고 유전자좌별 이형접합도 기대치(He)와 FST 값을 추정하였다. 특이값(outlier)인 유전자좌를 구명하기 위하여 LOSITAN v1.0 프로그램(Antao et al., 2008)에서 200,000번의 시뮬레이션을 수행하고 99% 신뢰수준에서 선별하였다. 베이즈 추론을 위하여 BayeScan 프로그램(Foll and Gaggiotii, 2008)에서 50,000번 burn-in 후 300,000번의 MCMC 시뮬레이션을 실시하고, 유전자좌의 FST 값에 대한 확률(P)이 0.99이상이고 모델 적정성을 판단하는 기준인 log10 (Bayes factor)가 2 이상인 유전자좌를 특이값으로 선정하였다.

 

결 과

ESTP 표지 선발

침엽수류에서 개발된 EST 표지들 중 소나무 유전분석에 사용한 표지는 9개로 PtIFG_8744, PtNCS_p14A9, sams2, glyhmt1, glyhmt2, CSP, rd21Alike, PsARI_dehydrin, agp4 였다. EST 정보를 제공한 수종별로는 Pinus taeda에서 7개, Pinus sylvestris와 Pseudotsuga menziesii var. menziesii에서 각 1개씩의 표지가 개발되었다. 기능별로는 목부 생장에 관련된 유전자(PtIFG_8744, PtNCS_p14A9, agp4, sams2, glyhmt1, glyhmt2,)가 6개, 건조스트레스에 의해 발현되는 유전자(PsARI_dehydrin, rd21Alike)가 2개, 내한성에 관련된 유전자(CSP)가 1개 였다. 9개 EST 표지들 중 2개표지(glyhmt2, agp4)는 전기영동 상에서 개체 간 변이가 확인되었다. 나머지 7개 표지는 RFLP 분석을 추가적으로 수행한 후 개체간 변이를 확인할 수 있었는데, PtIFG_8744 표지에서 3개, PtNCS_p14A9표지에서 3개, sams2 표지에서 2개, glyhmt 1 표지에서 2개, rd21Alike 표지에서 3개, CSP 표지에서 1개, PsARI_dehydrin 표지에서 4개의 개체간 변이가 나타난 EST-RFLP 유전자좌를 확인하였다. 본 연구에서는 17개의 EST-RFLP 유전자좌와 2개의 EST 유전자좌를 포함한 19개의 유전자좌를 선발하였다. 각 유전자좌 별로 관찰된 대립유전자는 최소 2개(PtIFG_8744+RsaⅠ등 16개)에서 최대 4개(PsARI_dehydrin+AluⅠ)로 나타났으며, 대립유전자 조합에 따른 기대 가능한 유전자형은 sams2+AluⅠ, sams2+RsaⅠ를 제외한 나머지 유전자좌에서 모두 확인되었다(Table 2).

Table 2.zA = number of observed allele. yG = number of observed genotype. xGmax = maximum number of genotype.

19개 유전자좌간 연관불평형을 확인한 결과 171개 조합 중 10개(5.8%)에서 연관불평형이 나타났다(P < 0.05; data not shown). 연관불평형이 나타난 유전자좌를 제거하면 유전다양성이나 유전분화 모수를 추정할 때 편차가 줄어들 수도 있지만(Excoffier and Heckel, 2006), 본 연구에서는 연관불평형이 나타난 유전자좌 조합이 집단별로 상이해서 교배 양친수의 조합 차이에 의한 것으로 생각된다. 따라서 집단 유전모수 추정에 연관불평형이 나타난 유전자좌를 포함하여 분석에 사용하였다.

소나무 집단의 유전다양성

19개의 유전자좌를 이용하여 유전다양성을 추정한 결과 관찰된 평균 대립유전자 수(A)는 2.2개, 평균 유효대립유전자 수 (Ae)는 1.8개, 다형성 유전자좌 비율(P)은 98.8%, 평균 이형접합도 관찰치(Ho)는 0.391, 평균 이형접합도 기대치(He)는 0.402였다(Table 3). 근교계수 평균은 0.048이었으며, 내장산, 오대산, 울진 소광리를 제외한 나머지 집단들이 양의 근교계수 값을 갖는 것으로 나타났다. 특히 안강(F = 0.273; P<0.001)과 강릉(F = 0.105; P<0.05)은 하디-바인베르그 평형보다 이형접합체의 관찰빈도가 낮게 나타났다. 집단별로는 내장산(A = 2.3, Ae = 1.9, Ho = 0.464, He = 0.452)이 유전다양성이 가장 높았고, 대구(A = 1.9, Ae = 1.6, Ho = 0.336, He = 0.345)와 강화도(A = 2.3, Ae = 1.6, Ho = 0.336, He = 0.337)의 유전다양성이 비교적 낮았다.

Table 3.zA = number of observed alleles. yAe = number of effective alleles. xP (%) = percentage of polymorphic loci. wHo = observed heterozygosity. vHe = expected heterozygosity. uF = inbreeding coefficient. *Significant at the P < 0.05. ***Significant at the P < 0.001.

소나무 집단의 유전구조 및 유연관계

ESTP 표지를 이용한 우리나라 소나무 집단에 대한 유전분화도는 FIS = 0.055, FIT = 0.101, FST = 0.057로 나타났다(Table 4). 집단간의 유전분화를 나타내는 FST 값은 유전자좌별로 최소 0.009 (sams2+AluⅠ, sams2+RsaⅠ)에서 최대 0.196 (PsARI_ dehydrin+MboⅠ)이었다. 건조스트레스 관련 dehydrin 유전자 부위에 위치하는 PsARI_dehydrin EST 표지에서 확인된 4개 유전자 좌중 3개 유전자좌(PsARI_dehydrin+HaeⅢ, PsARI_dehydrin+MboⅠ, PsARI_dehydrin+AluⅠ)의 FST 값이 0.1 이상으로 높게 나타났다.

Table 4.Wright’s F statistics for 17 EST-RFLP loci and 2 EST loci in Pinus densiflora populations

13개 집단에 대한 Nei의 유전적 거리 평균은 0.042이며, 인접한 울진의 2개 집단(울진 수곡리, 울진 소광리)간 유전적 거리가 0.005로 가장 작게 나타났다. 그러나 UPGMA 방법을 이용한 유연관계도에서 집단 간 지리적 인접성에 따른 유전적 연관성을 확인할 수는 없었다(Fig. 2). 이런 결과는 소나무 집단을 대상으로 동위효소(Lee et al., 1997), RAPD (Kim et al., 1995), ISSR (Hong et al., 2007)을 이용한 분석결과에서도 유사하게 나타났다. 한편 RAPD 표지를 이용한 집단유연관계 분석(Kim et al., 1995)에서 한라산은 유전적 거리가 제일 먼 것으로 나타났으며, 침엽수종인 주목(ISSR: Kwon and Kim, 2002)이나 구상나무 (nSSR: Hong et al., 2011) 집단의 분석에서도 한라산은 유전적 거리가 가장 먼 것으로 확인되어 본 연구에서도 한라산 집단을 outgroup으로 지정하고 유연관계를 재분석하였지만, 지리적 인접성과 유전적 거리간 뚜렷한 경향을 확인할 수는 없었다 (Fig. 2). 따라서 집단 간 지리적 분포특성과 집단들의 유전적 분화양상이 일치하지 않았으며, 지리적 거리와 유전적 거리 간의 상관성도 없는 것으로 나타났다(Mantel 검증; r = 0.017, P = 0.344). 베이즈 군집분석에서 국내 소나무 13집단에 대한 상위 군집수는 최적 3개 군집으로 추정되었다(data not shown). 3개 군집에 대한 사후확률을 기준으로 집단을 구분하면 강화도(Cluster I = 0.729)는 제1군집에 대해 가장 높은 사후확률을 나타냈고, 울진 수곡리, 울진 소광리, 강릉, 주왕산, 오대산, 한라산 등에서 제1군집의 사후확률이 제일 우세하였다(Table 5). 제2군집에서는 안면도(Cluster II = 0.623)에서 높은 확률을 가지고 있었고, 설악산, 내장산, 덕유산, 대구에서 제2군집 할당이 높게 나타났다. 집단 내에서 제3군집의 확률이 우세한 경우는 없었으나, 안강(Cluster II = 0.568, Cluster III = 0.335)이나 한라산(Cluster I = 0.556, Cluster III = 0.251)에서 제3군집의 사후확률이 비교적 높게 나타났다.

Fig. 2.UPGMA dendrogram based on Nei's genetic distance in Pinus densiflora populations.

Table 5.Proportion of cluster memberships at the population level in Pinus densiflora by Bayesian cluster analysis

베이즈 군집분석은 Nei의 유전적 거리를 이용한 빈도주의 군집분석과 유사한 결과를 나타냈다(Table 5, Fig. 2). 최적 군집수(K = 3)에서 제1군집에서 빈도가 높은 집단들은 강화도, 주왕산, 강릉, 울진 수곡리, 울진 소광리, 오대산, 한라산 집단이었으며, 빈도주의 군집분석에서는 outgroup으로 설정한 한라산과 두 군집간 사후확률 차이가 0.1 미만인 오대산을 제외한 5개 집단이 동일한 군집에 속했다. 제2군집에서 빈도가 높은 집단들은 안면도, 설악산, 내장산, 덕유산, 대구, 안강 집단이었으나 제2군집의 빈도가 높은 안면도, 안강, 대구 집단이 빈도주의 군집분석에서 하나의 그룹을 형성하였다. 제1군집과 제2군집의 사후확률 차이가 0.1 미만인 설악산, 덕유산, 내장산, 오대산이 빈도주의 군집분석에서 별도의 그룹을 형성하였다. 그러나 지리적 인접성에 따른 군집 구별을 확인할 수 없었다.

ESTP 유전자좌의 특이값(outlier) 추정

선발 영향(selection effect)을 받은 유전자좌를 추정하기 위해 FST-outlier 분석(Beaumont and Nichols, 1996)을 실시하였다. 특이값으로 판정된 유전자좌는 전체 19개 중 6개(31.6%)였다(Table 6, Fig. 3). 99% 신뢰수준에서 신뢰하한 보다 낮은 FST값을 나타낸 3개의 유전자좌인 sams2+AluⅠ, sams2+RsaⅠ, PtNCS_p14A9+HaeⅢ는 balancing selection의 후보 유전자좌로 추정되었고, 신뢰상한 보다 높은 FST 값을 나타낸 3개의 유전자좌 PsARI_dehydrin+HaeⅢ, PsARI_dehydrin+MboⅠ, PsARI_dehydrin+AluⅠ는 positive selection을 겪은 유전자좌로 추정되었다. 그러나 베이즈 방법(Foll and Gaggiotii, 2008)에서는 낮은 FST값을 갖는 3개(15.8%) 유전자좌만 Bayes factor의 로그값 2 이상의 기준에서 특이값으로 판정되었다(Table 6, Fig. 4).

Table 6.Outlier loci detected by Frequencist’s method (Beaumont and Nichols, 1996) and Bayesian method (Foll and Gaggiotti, 2008)

Fig. 3.Outliers estimated from the locus-specific FST values against the expected heterozygosity (He) (Beaumont and Nichols, 1996) in Pinus densiflora populations. Black dots are represented 19 EST loci. The dark grey indicates the region with 99% confidence interval and the six outlier loci were shown in the light grey region.

Fig. 4.Outliers estimated from the FST values and the Bayes factors for 19 EST loci (Foll and Gaggiotti, 2008) in Pinus densiflora populations. The dashed line indicates the threshold of 2 as log10 transformed Bayes factor that provides decisive evidence for selection corresponding to a posterior probability of 0.99.

 

고 찰

ESTP 표지를 이용한 소나무의 유전다양성 및 유전구조

ESTP 표지로 확인된 국내 소나무의 유전다양성(He = 0.402)은 nSSR 표지로 확인된 국내 소나무의 유전다양성(He = 0.672; J.Y. Ahn et al., in press)보다 낮았다. ESTP 표지를 이용한 소나무의 유전다양성 정도는 Picea abies (He = 0.505; Achere et al., 2005)에 비해 낮았으나, Picea lauca (He =0.313; Jaramillo-Correa et al., 2001)와 Cryptomeria japonica (He = 0.322; Tsumura et al., 2007) 보다는 높았다. 그러나 nSSR 표지로 분석한 Picea abies (He = 0.796; Achere et al., 2005), Cryptomeria japonica (He = 0.770; Takahashi et al., 2005) 보다 소나무의 유전다양성이 낮게 나타났다. 전반적으로 소나무 유전다양성은 Picea abies, Cryptomeria japonica 보다 낮은 것으로 사료된다. 본 연구의 유전다양성(A = 2.2개, Ho = 0.391, He = 0.402)은 동위효소로 확인된 국내 소나무의 유전다양성(A = 2.4개, Ho = 0.262, He = 0.263; Kim et al., 1994)과 대립유전자 수는 비슷했으나, 이형접합도 관찰치나 기대치는 더 높게 나타났다. Picea abies에서 동일한 개체들을 대상으로 동위효소와 EST 표지 분석을 수행했을 때 대립유전자 수(A: 동위효소 = 3.00개, EST = 3.33개)와 이형접합도 기대치(He: 동위효소 = 0.60, EST = 0.67)는 비슷했지만 이형접합도 관찰치(Ho: 동위효소 = 0.23, EST = 0.50)는 EST 표지가 더 크게 나타났다 (Schubert et al., 2001). 따라서 동위효소와 EST 표지로 소나무의 유전다양성을 추정한 경우에 대립유전자 수는 비슷하게 나타나도 이형접합체의 관찰빈도는 EST 표지가 더 높은 것으로 생각된다. ESTP 표지를 이용한 국내 소나무의 유전분화(FST)는 0.057로, 동위효소(FST = 0.038; Kim et al., 1994)나 nSSR 표지로 추정한 유전분화(FST = 0.031; J.Y. Ahn et al., in press)보다 더 심한 것으로 나타났다. 일반적으로 EST 표지로 추정한 FST값이 다른 표지로 추정된 값보다 크게 나타난다. Picea glauca의 유전분화는 EST표지(FST = 0.020)가 동위효소(FST = 0.014)보다 크게 나타났으며(Jaramillo-Correa et al., 2001), Picea abies의 유전분화도 EST 표지(FST = 0.025)가 nSSR 표지(FST = 0.009)보다 크게 나타났다(Achere et al., 2005). Cryptomeria japonica에서도 EST 표지(FST = 0.059; Tsumura et al., 2007)의 유전분화가 동위효소(FST = 0.034; Tomaru et al., 1994)나 nSSR 표지(FST = 0.028; Takahashi et al., 2005)보다 더 크게 나타났다. 따라서 소나무 유전분화는 Picea abies, Picea glauca, Cryptomeria japonica 보다 심화된 것으로 생각된다.

선발 영향을 받는 유전자좌의 추정

FST-outlier 추정은 유전자좌별 선발 영향을 확인하는 방법으로 초창기의 Lewontin-Krakauer test를 시작으로 다양한 집단 분화모델을 가정한 방법들이 제안되고 있다(Beaumont and Nichols, 1996; Vitalis et al., 2001). 그러나 Cryptomeria japonica 경우에서 보듯이 집단 분화 모델에 따라 outlier로 판정된 유전자좌의 비율이 크게 차이날 수도 있다(Island model= 5%, split model = 19.4%; Tsumura et al., 2007). 이러한 변동은 집단 분화에 미치는 요인이 선발뿐 아니라 또다른 생물학적 요인이나 집단의 계층 구조 등에 의해서도 영향 받을 수 있기 때문이며, 이런 경우에는 분화모델에 따라 outlier 결정의 제1종 오류가 발생할 가능성도 높아질 수 있다(Beaumont, 2005; Narum and Hess, 2011; Bierne et al., 2013). 빈도주의 통계방법과 더불어 베이즈 추론을 이용한 FST-outlier 추정 방법도 이용되고 있는데(Foll and Gaggiotti, 2008), Picea glauca에서 두 가지 통계방법을 각기 적용했을 때 outlier로 판정된 유전자좌의 비율이 빈도주의 방법 3.7%, 베이즈 방법 9.2%로 다르게 나타났다(Namroud et al., 2008). 본 연구의 특이값 추정에서도 빈도주의 방법에서 6개로 확인된 특이값이 베이즈 방법에서는 3개로 판정되었는데, 두 방법에서 공통적으로 확인된 특이값은 sams2+AluⅠ, sams2+RsaⅠ, PtNCS_p14A9+HaeⅢ 등이다. 빈도주의 방법에서 확인된 PsARI_dehydrin+HaeⅢ, PsARI_dehydrin+MboⅠ, PsARI_dehydrin+AluⅠ는 베이즈 방법에서 유의하지 않은 것으로 판명되었다. PsARI_dehydrin에서 유래된 이들 3개 유전자좌는 일부 소나무 집단에서 null allele 빈도가 높게 나타났는데(대구 = 92.5%, 강릉 = 85.4%, 안면도 = 60.8%), 이러한 자료의 특성이 각 통계방법의 특이값 판정결과에 다른 강도로 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. 빈도주의 방법은 유전자좌가 중립적(neutral)이라는 가정에서 벗어나는 분화값을 나타내는 유전자좌를 특이값으로 추정하는 것에 비하여, 베이즈 방법은 중립적 집단유전학 모델(neutral population genetic model)에서 추정된 유전모수를 기준으로 특이값을 판정하기 때문에 이러한 오류를 어느 정도 감소시킬 수 있다(Foll and Gaggiotti, 2008). 빈도주의 방법과 베이즈 방법에서 공히 특이값으로 판정된 3개 유전자좌는 balancing selection을 받았을 것으로 추정된다. selection을 받았을 것으로 판정된 3개의 유전자좌를 제외하고 유전분화를 다시 추정한 결과 FST값은 0.066으로 유의한 차이가 없었으며(P = 0.65), 3개의 유전자좌는 집단 분화에 미미한 영향을 미치는 것으로 판단된다. 유전자좌에 대한 선발 (selection)이 발생할 경우에 balancing selection은 집단간 대립유전자 빈도가 비슷하게 분포하기 때문에 유전분화도(FST)가 낮거나 유전다양성(He)이 높게 나타난다. 반면에 positive selection이 나타난 유전자좌는 대립유전자 빈도가 특정 집단에서 높게 되서 유전분화도는 높지만 유전다양성이 낮게 나타나게 된다(Luikart et al., 2003, Excoffier et al., 2009). 본 연구에서 선발 영향을 받는 특이값으로 판정된 3개 유전자좌에서 추정된 유전다양성과 유전분화 수준은 매우 유사하게 나타났으며(Table 6), 각 유전자좌의 대립유전자 빈도는 sams2 표지에서 확인된 2개 유전자좌(sams2+AluⅠ, sams2+RsaⅠ)의 대립유전자별 관찰빈도가 유사하게 나타난 것에 비하여 PtNCS_p14A9+HaeⅢ 유전자좌는 제1대립유전자 빈도보다 제2대립유전자 빈도가 2배 이상 높은 것으로 관찰되었다(Table 2). 따라서 소나무 집단에서 sams2 표지가 위치한 목부 생장과 관련된 유전자 S-adenosyl methionine synthetase 2에서 balancing selection이 나타난 것으로 판단된다. 이들 유전자좌를 제외한 나머지 유전자좌들에 대한 Ewens-Watterson Neutrality Test (Watterson, 1977)를 실시한 결과(data not shown), 선발 영향을 받지 않는 중립적 유전자좌(neutral loci)들로 확인되었다.

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