Inhibitory Effects of S-allylcysteine on Cell Proliferation of Human Cervical Cancer Cell Line, HeLa

S-allylcysteine의 자궁경부암세포주 HeLa에 대한 세포증식 억제효과

Abstract

S-allylcysteine (SAC) is a water-soluble organosulfur compound abundant in the aged garlic extract and has been drawing attention as a diet-derived alternative agent not only for the effects of anti-oxidation and anti-inflammation but also for the prevention and treatment of various types of cancer. However, there is no report about the anticancer effects of SAC on cervical cancer cells. The aim of this study was to analyze the inhibitory effects of SAC on cell proliferation of cervical cancer cell line, HeLa and to examine its effects on the apoptosis and cell cycle as the cellular mechanisms of anti-proliferation. For this, we examined effects of different concentrations of SAC on cell proliferation according to treatment periods. Treatment with SAC not only induced morphological changes but also resulted in the reduction of cell viability and the inhibition of concentration- and time-dependant cell proliferation of HeLa. Furthermore, SAC also induced fragmentation of DNA in both DNA fragmentation and TUNEL assays, and induced cell cycle arrest at the G₂/M phase in cell cycle analysis. These results suggest that SAC inhibits proliferation of HeLa at least in part through the induction of apoptosis and the cell cycle arrest.

S-allylcysteine (SAC)은 숙성마늘에 다량 함유된 수용성 유기황 화합물로서 항산화 및 항염증 효과뿐만 아니라 여러 유형의 암에서 예방 및 항암 치료를 위한 하나의 식품유래 대체물질로 주목 받아 오고 있다. 그러나, SAC에 의한 자궁경부암세포에서의 항암효과는 아직 보고된 바 없다. 본 연구의 목적은 SAC가 자궁경부암세포주 HeLa의 증식에 미치는 억제효과를 분석하고, 이에 대한 세포 항증식 작용기전 중 세포자멸 및 세포주기에 미치는 영향을 조사하는데 있다. 이를 위하여, 먼저 다양한 농도의 SAC가 처리기간에 따라 세포증식에 미치는 영향을 분석하였다. SAC 처리는 HeLa 세포의 형태학적 변화를 유도하였을 뿐만 아니라, 세포의 viability 감소 그리고 농도 및 시간 의존적인 세포증식 억제효과를 초래하였다. 또한 SAC는 DNA fragmentation assay 및 TUNEL assay에서 DNA 분절을 유도하였으며, 세포주기 분석에서 G₂/M기에서의 세포주기 억제를 유도하였다. 이러한 결과는 SAC가 최소한 부분적으로 세포사멸의 유도 및 세포주기의 통제를 통하여 HeLa 세포의 증식을 억제함을 제시한다.

서 론

마늘(Allium sativum)은 역사적으로 오랫동안 여러 문화에서 식용뿐만 아니라 약용의 목적으로 사용되어 왔다[19]. 마늘은 많은 양의 유기황 화합물들을 함유하고 있으며, 이들은 크게 diallyl sulfide, diallyl disulfide (DADS) 및 diallyl trisulfide (DATS)를 포함하는 지용성 군과 S-allylcysteine (SAC) 및 S-allylmercaptocysteine을 포함하는 수용성 군으로 나뉜다[33]. 마늘의 숙성과정 동안 독특한 냄새의 원인이 되는 대부분의 지용성 군은 보다 안정적이고, 생물학적으로 이용 가능한 수용성 군으로 전환된다[33].

SAC는 숙성된 마늘 추출물에서 가장 풍부하게 존재하며[4, 6], allyl기에 황 원자가 첨가된 cysteine의 유도체로서, 항산화, 항염증, 신경보호 및 항암기능 등의 다양한 생리적 활성효과를 갖는 것으로 보고되어 왔다[19, 33]. SAC는 노화와 다양한 질병에 연루된 산화적 손상을 억제하며[8], 이러한 항산화 효과는 지방[13, 27]과 단백질[20]의 산화를 방지할 뿐만 아니라, superoxide anion (O2•−) [16, 20, 23]과 hydroxyl radical (•OH) [16, 23, 27] 등을 제거하는 다양한 항산화 기전을 나타낸다. 또한 SAC는 항염증 작용기전을 통하여 당뇨병성 신장질환 완화에 효과가 있음이 보고되었다. Mong과 Yin [24]의 보고에 의하면, 당뇨병성 신장질환을 가진 생쥐에 SAC를 경구 투여한 결과, tumor necrosis factor-α 및 prostaglandin E2를 포함하는 염증 유발인자들의 생성을 억제함으로써 신장기능을 향상시켰으며, 이러한 효과는 SAC가 mitogen-activated protein kinase의 신호전달경로에 작용하여 NF-κB의 활성을 억제함으로써 염증매개인자들의 발현을 감소시키는 기전에 기인한 것으로 제시되었다. SAC의 항산화 및 항염증 효과는 또한 신경세포의 성장 촉진과 신경손상으로부터의 보호기능과도 관련된 것으로 여겨진다. 최근의 연구에 의하면, SAC를 포함하는 마늘의 유기황 화합물은 해마 신경세포의 축삭 분지를 촉진할 뿐만 아니라 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경 질환에서 산화적 스트레스를 초래하는 활성산소종 생성을 억제하고 베타 아밀로이드 단백질에 의해 유도된 세포사멸을 방지함으로써 신경세포에 대한 보호효과를 나타내는 것으로 보고되었다[8]. 그리고, 특히 지난 수 년간의 광범위한 역학조사 결과, 마늘의 섭취와 암 발생률 감소와의 상관관계가 있는 것으로 밝혀지면서[5, 34], 다수의 연구를 통하여 마늘에 함유된 유기황 화합물들이 암 발생 위험성의 감소에 기인할 가능성이 높은 것으로 제시되었다[12]. 이 후 마늘에 함유된 SAC가 특이적인 항암활성을 갖는 지에 대한 연구들이 진행되어 왔다. 최근의 연구결과, SAC가 인간 난소암세포주[33], 전립선암 세포주[5, 7], 유방암세포[10], 대장암세포[29] 및 위암세포[31] 등을 포함하는 다양한 암세포들의 증식을 억제할 뿐만 아니라 세포사멸을 유도하는 것으로 보고되어 왔다. Xu 등[33]에 의하면, 인간 난소암세포주 A2780에서 SAC는 p-Akt 단백질의 하향조절을 통한 G1/S기의 세포주기 억제와 caspase-3 및 Bax 단백질의 상향조절을 통한 미토콘드리아 경로-매개 세포자멸사를 유도함으로써 세포 증식을 억제하였다. 안드로겐-비의존성 전립선암세포주 PCa에 대한 Chu 등[7]의 보고에 의하면, SAC가 세포증식을 억제할 뿐만 아니라 mesenchymal to epithelial transition의 유도, E-cadherin 단백질 발현증가 및 E-cadherin 억제단백질 Snail 발현의 하향조절을 통하여 세포의 전이를 억제함을 보였다. 이와 유사하게, SAC는 또한 고정-비의존성 유방암세포주 MDA-MB-231에서 부착과 전이관련 단백질인 E-cadherin의 발현증가와 matrix metalloproteinase-2의 발현감소를 유도함으로써 유방암세포의 성장과 부착 및 침입을 억제하였다[10]. 이 외에도, SAC는 대장암 선종의 진행을 억제하며[29], 발암물질-유도 위암세포의 성장억제와 세포 사멸을 유도함으로써[31], 여러 유형의 암에서 예방 및 항암 치료를 위한 하나의 식품유래 대체물질로써 주목 받아 오고 있다. 그러나, SAC에 의한 자궁경부암세포에 대한 항암효과는 아직 보고된 바 없다.

자궁경부암은 전 세계적으로 여성에게서 세 번째로 진단되고 예방 가능한 악성 질병이지만, 진단과 치료의 진전에도 불구하고 환자의 생존율이 여전히 낮고 사망률이 높은 암에 해당한다[14]. 특히 개발도상국에서의 낮은 생존율은 조기 진단의 부족으로 인한 악성종양 단계로의 진전 및 전이 가능성에 기인한다[14]. 자궁경부암의 발병원인은 주로 인유두종 바이러스(human papilloma virus)의 감염으로 발생되며, 치료적 수단으로는 항암화학요법, 수술 및 방사선 요법 등이 시행되고 있다. 그러나 현재 사용되고 있는 cisplatin과 같은 항암제는 신장, 간장 및 골수세포 등에 대한 독성을 나타내거나, 항암제에 대한 내성세포 증가 등의 부작용을 동반한다. 따라서 정상 세포에 대한 독성 작용을 최소화 하면서 암세포의 내성을 줄일 수 있는 새로운 항암물질의 개발이 요구되고 있다[25].

따라서, 본 연구의 목적은 마늘 유래 유기황 화합물의 하나인 SAC가 인간 자궁경부암세포주 HeLa의 증식에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 이를 위해 SAC의 처리농도 및 시간에 따른 HeLa에 대한 증식 억제효과를 분석하고 이에 대한 세포작용 기전 중 세포자멸 및 세포주기에 미치는 영향을 조사하였다.

 

재료 및 방법

세포배양

HeLa 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 구입되었으며, 30~40회의 계대배양을 통하여 실험에 사용되었다. 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 및 송아지 혈청은 GIBCO Invitrogen (Grand Island, NY, USA)으로부터, 그리고 세포배양 plate는 Nunc A/S (Roskilde, Denmark)로부터 구입되었다. SAC는 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)로부터 구입되어 500 mM의 농도로 phosphate buffered saline (PBS)에 녹여 −20℃에 보관되었다. HeLa 세포는 10% 송아지 혈청, 100 unit/ml의 penicillin 및 100 mg/ml의 streptomycin이 첨가된 DMEM 내에서 5% CO2 및 37℃에서 배양되었다. 배양된 세포는 PBS에 용해된 0.05% trypsin 및 2 mM EDTA로 37℃에서 5분간 처리 후 10 cm 배양 plate로부터 분리시키고, trypan blue 염색 및 hemocytometer를 사용하여 세포를 계수한 다음, 새로운 배양 plate에 분주하여 SAC 처리 전 12시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양되었다.

형태학적 관찰

각각 다른 농도의 SAC (0, 10, 20, 30, 40 및 50 mM in PBS)를 포함하는 신선한 DMEM 배지를 6-well plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포(5×104 cells/well)에 첨가한 다음 2일 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하여 세포의 형태학적 변화를 200배율의 위상차 광학현미경으로 관찰하였다

Trypan Blue Exclusion Assay

다양한 농도의 SAC (0, 0.1, 5, 10, 20, 30, 40 및 50 mM in PBS)를 96-well plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포 (8,000 cells/well)에 첨가한 다음 2일 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. SAC 처리에 의한 HeLa 세포의 viability에 미치는 효과는 각 well에서 1X trypsin-EDTA로 세포를 분리, 수집한 후, 0.4% trypan blue (Gibco, USA)와 세포현탁액을 1:9 (v/v)로 혼합한 다음 hemocytometer와 광학현미경을 사용하여 염색되지 않은 세포를 계수함으로써 분석되었다. 이러한 실험은 각각 3회 반복되었으며, 각 실험군의 viability는 대조군에 대한 상대적인 백분율로 환산되었다.

Cell Proliferation Assay

다양한 농도의 SAC (0, 0.1, 5, 10, 20, 30, 40 및 50 mM in PBS)를 96-well plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포 (8,000 cells/well)에 첨가한 다음, 각각 1일, 2일, 3일 및 4일 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 처리된 각 well 내의 배양세포는 48시간 마다 동일한 농도의 SAC를 포함하는 신선한 배지로 교체하여 배양되었다. SAC 처리에 의한 HeLa 세포의 증식에 미치는 효과는 시약공급자의 protocol에 따라 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, U.S.A.)에 의해 분석되었다. 간단히 말하면, 세포를 함유하는 plate의 배양액을 제거한 후, 100 μl의 새로운 배양액과 동일한 부피의 CellTiter-Glo® reagent를 혼합하여 각 well에 200 μl의 반응혼합액을 첨가한 다음 orbital shaker에서 2분간, 이후 정지상태에서 8분간 반응시킨 후 luminometer를 이용하여 발광양을 측정하였다. 이러한 실험은 각각 3회 반복되었으며, 각 실험군의 세포증식률은 대조군에 대한 상대적인 백분율로 환산되었다.

DNA Fragmentation Assay

다양한 농도의 SAC (0, 20, 50 및 100 mM in PBS)를 포함하는 신선한 배지를 10 cm culture plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포(2X106 cells/plate)에 첨가한 다음, 2일 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. SAC 처리에 의한 HeLa 세포의 DNA 분절을 확인하기 위하여, 배양된 각 plate를 1X trypsin-EDTA로 4분간 처리하여 세포를 분리, 수집한 다음, 0.5 ml의 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 25 mM EDTA 및 0.5% SDS)와 1 μl의 20 mg/ml RNase A를 첨가하여 37℃에서 30분간 세포 용해반응을 진행하였다. 이 후 용해반응 부피의 1/10에 해당하는 50 μl의 10 M ammonium acetate와 2.5배 부피의 100% ethanol를 첨가하여 −20℃에서 12시간 동안 DNA를 침전시켰으며, 침전된 DNA를 70% ethanol로 수세한 다음 Tris-EDTA buffer에 용해하였다. 분리된 DNA 시료를 ethidium bromide가 포함된 2% Tris-acetate-EDTA agarose gel에서 전기영동 한 다음 자외선 조사에 의해 DNA 분절을 분석하였다.

Terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay

다양한 농도의 SAC (0, 20, 30 및 50 mM in PBS)를 포함하는 신선한 배지를 8-chamber culture slide에 균등히 분주된 HeLa 배양세포(5X104 cells/chamber)에 첨가한 다음 2일 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 각 처리 별 TUNEL assay에 의한 형광현미경적 DNA 분석은 시약공급자의 protocol에 따라 Click-iT® TUNEL Assay (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)에 의해 분석되었다. 간단히 말하면, 세포를 함유하는 chamber의 배양액을 제거하고 PBS로 2회 수세한 다음 실온에서 4% paraformaldehyde에 15분간 세포를 고정하였다. 고정액을 제거한 후 순차적으로 permeabilization 용액(0.25% Triton® X-100 in PBS)과 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 반응용액을 실온에서 각각 20분 및 10분간 처리하여 분절된 DNA의 3’ 말단에 표지 뉴클레오티드를 병합하였다. 그리고 TUNEL assay에 대한 양성 대조군은 permeabilization 용액으로 반응시킨 다음 DNase I을 처리하여 DNA의 인위적인 분절을 유도하였으며, 음성 대조군은 TdT를 제외한 TdT 반응용액을 사용하였다. 표지 뉴클레오티드가 병합된 각 처리군의 HeLa 세포에 대하여 Click-iT® reaction cocktail을 첨가한 다음, 실온에서 30분간 배양함으로써 병합된 새로운 뉴클레오티드에 대한 형광반응을 유도하였다. 형광 반응에 대한 background 염색은 3% BSA (in PBS)에서 2분간 2회 처리하여 최소화시켰으며, DAPI로 DNA를 대조 염색한 다음 형광현미경을 이용하여 DNA의 분절을 확인하였다.

세포주기 분석

다양한 농도의 SAC (0, 10, 20, 30 및 50 mM)를 포함하는 신선한 배지를 6-well plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포 (8X105 cells/plate)에 첨가한 다음 2일 동안 배양하였다. 배양된 세포를 1X trypsin-EDTA로 분리, 수집하여 PBS로 2회 수세한 다음 100% cold ethanol을 첨가하여 세포 부유용액의 최종 ethanol 농도를 70%로 조정한 후 -5℃에서 2시간 동안 고정하였다. 그리고 고정된 세포를 PBS로 2회 수세하여 용액 내 잔류 ethanol을 제거하였으며, 50 μl의 100 μg/ml RNase A와 200 μl의 50 μg/ml의 propidium iodide를 첨가하여 30분 동안 처리한 다음 세포 내 DNA 함량을 유세포 분류기(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)로 분석하였다.

통계분석

실험결과는 평균±SE로 표시되었으며, 처리군 사이의 통계적 유의성은 Student’s t-test에 의해 결정되었다. p＜0.05의 값은 통계적으로 유의성이 있음을 의미한다.

 

결 과

SAC 처리에 의한 HeLa 세포주의 증식억제 효과

SAC의 처리 농도에 따른 HeLa 세포주의 광학현미경적 형태의 변화를 관찰한 결과, Fig. 1A에서 나타난 바와 같이 농도가 증가할수록(10~50 mM) 대조군의 둥근 다각형 모양으로부터 가늘고 긴 방추형태를 띤 세포의 수가 증가함을 나타내었다. 또한, SAC의 처리는 농도가 증가함에 따라 2일간의 배양 동안 plate 기저에 부착되어 있는 세포의 수가 감소함을 관찰할 수 있었다. 광학현미경적 세포 형태의 변화 및 세포수의 감소는 10 mM의 낮은 SAC 농도에서는 나타나지 않았으나, 30 mM 이상의 농도에서는 비교적 농도 의존적인 변화를 보였다. 이러한 광학현미경적 소견으로 관찰된 SAC 처리에 의한 세포 수의 변화를 보다 더 정량적으로 분석하기 위하여 trypan blue exclusion assay에 의한 살아있는 세포를 계수하였다. 광학현미경적 관찰결과와 유사하게, SAC 처리는 HeLa 세포주의 viability에 대한 농도의존적인 억제효과를 나타내었다(Fig. 1B). 흥미롭게도, 낮은 농도의 SAC 처리(10 mM)에 의한 광학현미경적 차이는 미미하였으나, 세포의 viability에 있어서는 매우 낮은 농도의 SAC (0.1~10 mM) 또한 유의적인 억제효과를 보였다. 즉 2일간의 SAC 처리농도 0.1, 5, 10, 20, 30, 40 및 50 mM은 대조군 PBS 처리와 비교하여 각각 12%, 28%, 45%, 50%, 73%, 76% 및 82%의 농도 의존적인 세포 viability의 감소를 유도하였다. 추가적으로, HeLa 세포에 대한 SAC의 이러한 viability 감소효과가 처리 기간에 따라 다르게 나타나는지를 확인하기 위하여 동일한 SAC 농도에 따른 처리 기간별 세포증식에 미치는 영향을 cell proliferation assay를 이용하여 비교 분석하였다. Fig. 2에 나타나 있는 바와 같이, 모든 처리 기간(1~4일)에서 10 mM 이상의 SAC 처리는 HeLa 세포주의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다. 또한 20~50 mM의 동일한 SAC 처리 농도는 비교적 시간 의존적인(1~4일) 세포증식 억제효과를 보였다(Fig. 2A~D). 구체적으로, 20, 30, 40 및 50 mM의 SAC 처리는 1일의 경우 각각 46%, 58%, 65% 및 76%, 2일의 경우 각각 49%, 64%, 69% 및 80%, 3일의 경우 각각 63%, 74%, 83% 및 89% 그리고 4일의 경우 각각 61%, 74%, 86% 및 90%의 현저한 증식 억제효과를 보임으로써, SAC가 HeLa 세포주에 대하여 농도 의존적일 뿐만 아니라 처리시간 의존적인 증식 억제효과를 나타냄을 보였다.

Fig. 1.A. Morphological changes of HeLa by SAC treatment. HeLa cells were treated with SAC in different concentrations of 0 (PBS control), 10, 20, 30, 40 and 50 mM for 2 days. The photographs show representative pictures of cultured cells taken under the phase-contrast microscope at 200x magnification. B. Inhibitory effects of SAC on the viability of cultured HeLa. HeLa cells were treated with SAC in different concentrations of 0 (PBS control), 0.1, 5, 10, 20, 30, 40 and 50 mM for 2 days. Cells were stained with trypan blue and the unstained viable cells were counted under the light microscope using hemocytometer. Values are expressed as means from three independent experiments. * indicates p＜0.05 and ** indicates p＜0.01 as compared to PBS control.

Fig. 2.Inhibitory effects of SAC on proliferation of HeLa as measured by CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay. Hela cells were treated for 1 day (A), 2 days (B), 3 days (C) or 4 days (D) with different concentrations of SAC. Values are expressed as means from three independent experiments. * indicates p＜0.05 and ** indicates p＜0.01 as compared to the untreated cells.

SAC 처리에 의한 DNA 분절 효과

배양된 HeLa 세포를 각각 다른 농도의 SAC로 2일간 처리하여 추출된 DNA를 agarose gel 상에서 전기영동으로 DNA의 분절을 분석한 결과, Fig. 3에서 나타난 바와 같이 20 및 50 mM의 농도에서는 SAC에 의한 분절된 DNA band를 보이지 않았으나 100 mM의 고농도에서는 뚜렷하게 분절된 DNA의 ladder 패턴을 나타내었다. 이러한 DNA의 분절 패턴은 양성 대조군으로 사용된 3.5% ethanol 처리에서의 결과와 유사하게 나타남으로써 고농도 SAC 처리가 DNA 분절효과를 유도함을 보여주었다(Fig. 3). 이러한 SAC에 의한 DNA 분절효과를 세포 내 in situ 핵 DNA에서 형광현미경으로 확인하기 위하여 TUNEL assay를 실시한 결과, agarose gel DNA 전기영동에서의 결과와 일치하게 SAC가 핵 DNA의 절단을 유도함을 확인하였다(Fig. 4). HeLa 세포주에 대한 20 mM의 SAC 처리는 DNA 절단을 표지하는 붉은 형광염색(Alexa Fluor® 594)을 나타내지 않았으나, 더 높은 농도(30 mM 및 50 mM)에서는 형광 양성반응이 관찰되었으며, 특히 50 mM에서는 양성반응 세포수의 빈도가 더욱 증가되었다.

Fig. 3.Effects of SAC on DNA fragmentation of HeLa. HeLa cells were treated for 2 days with either different concentrations of SAC or ethyl alcohol (positive control). The genomic DNA was extracted from each treated cells and separated by 2% agarose gel electrophoresis. The white smeared lanes indicate fragmented DNAs. M and PBS indicate DNA molecular weight marker and untreated control, respectively.

Fig. 4.Effects of SAC on in situ DNA fragmentation of HeLa as measured by TUNEL assay. HeLa cells were treated for 2 days with either PBS or different concentrations of SAC and the late apoptotic genomic DNA fragmentation was examined by TUNEL assay. In addition, HeLa cells were also treated with DNase I as a positive control to induce artificial DNA fragmentation (PO), or the terminal deoxynucleotidyl transferase was omitted as a negative assay control to remove nucleotide incorporation for probe staining (NE). The left panels show nuclei stained with DAPI, the middle panels show fragmented DNAs stained with Alexa Fluor® 594 by TUNEL assay, and the right panels show the merged photographs of both DAPI and Fluor stains. The arrows indicate nuclei with fragmented DNA. All photographs are representative pictures of each slide either at 200× (A) or 400× (B) magnifications.

SAC 처리에 의한 세포주기 억제 효과

HeLa 세포주의 세포주기에 미치는 SAC의 효과를 조사하기 위하여, 각기 다른 농도의 SAC로 처리된 HeLa의 세포주기 단계별 분포를 propidium iodide 염색을 통하여 유세포 분류기로 분석하였다. SAC는 처리된 모든 농도에서 전체 세포 수에 대하여 G0/G1기에 해당하는 세포의 비율이 통계적으로 유의성 있게 감소하였을 뿐만 아니라 처리 농도의 증가에 따라 더 큰 감소율을 보였다(Fig. 5). 즉, HeLa 세포주에 처리된 SAC의 0, 10, 20, 30 및 50 mM 농도에 대하여 G0/G1기에 해당하는 세포의 비율은 각각 69%, 65%, 64%, 65% 및 42%로 나타났다. 이와 반대로, SAC 처리에 의한 S기에 해당하는 세포의 비율은 30 mM을 제외한 모든 농도에서 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. 처리된 SAC의 0, 10, 20, 30 및 50 mM 농도에 대하여 S기에 해당하는 세포의 비율은 각각 11%, 16%, 15%, 12% 및 13%로 나타났다. 한편, G2/M기에 해당하는 세포의 비율은 처리된 SAC의 모든 농도에서 유의적인 변화를 보이지 않았다. 이러한 결과는 SAC 처리가 HeLa 세포주의 세포분열 주기에 영향을 미치며, 특히 G2/M기 단계에서 세포주기의 진행을 억제함으로써 G0/G1기의 감소와 S기의 증가를 초래한 것으로 여겨진다. SAC의 이러한 세포주기 억제효과뿐만 아니라, 본 연구의 유세포 분석 결과는 HeLa 세포에 대한 SAC 처리가 또한 세포사멸을 촉진함을 제시하였다. 즉, DNA 함량이 2n보다 적은 사멸하는 세포 부분에 해당하는 sub-G0기를 분석한 결과, 30 및 50 mM SAC의 처리에서 Sub-G0기에 속하는 세포의 비율이 PBS 대조군(6.9%)과 비교하여 각각 약 2배 및 4.3배 만큼 증가된 14%와 29.5%의 유의성 있는 증가를 나타내었다 (Fig. 5).

Fig. 5.Effects of SAC on cell cycle arrest of HeLa as determined by flow cytometry. A. HeLa cells were treated for 2 days with either PBS (control) or different concentrations of SAC, stained with propidium iodide and DNA contents were analyzed. B. Quantitative cell cycle analysis of HeLa. Values are expressed as means from three independent experiments. * indicates p＜0.05 and ** indicates p＜0.01 as compared to PBS control.

 

고 찰

다른 종류의 암과 마찬가지로 자궁경부암은 특히 개발도상국의 여성에서 진단될 당시 지엽적으로 이미 진전된 상태에서 발견되는 경우가 많으며, 현재 사용되고 있는 cisplatin 및 paclitaxel과 같은 표준 화학요법에 의한 치료 이후에도 재발 위험성이 높은 암 중의 하나이다[28]. 최근 재발되거나 진행된 단계의 자궁경부암의 치료를 위하여 여러 가지 표적약제들이 시험 중에 있으나, 이들을 이용한 화학적 치료법은 암세포의 약제에 대한 저항성 발생과 정상세포에 대한 독성으로 인하여 임상적 적용에 한계를 보여주고 있다. 따라서, 암의 치료를 위한 하나의 새로운 요법으로 자연계에 존재하는 식물로부터 유래된 천연 화합물의 생리적 기능과 작용기전을 밝힘으로써 부작용이 최소화된 천연물 유래 항암제를 치료적 도구로 사용하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 숙성된 마늘추출물로부터 유래된 수용성 유기황 화합물 중의 하나인 SAC는 생체에 대한 독성이 거의 없으며 높은 항암활성을 나타냄에 따라 다양한 암세포에서 연구되어 왔다. 본 연구에서는 자궁경부암세포주인 HeLa에서 SAC에 의한 세포증식 억제효과와 그에 대한 작용기전을 조사하였다. SAC는 20~50 mM의 농도에서 배양된 HeLa 세포주의 형태학적 변화를 초래하였을 뿐만 아니라(Fig. 1A), 농도 및 시간 의존적인 세포증식 억제효과를 보였다(Fig. 1B, 2). 이러한 결과는 이전에 보고된 비소세포 폐암, 유방암, 전립선암 및 난소암 세포주 등에서 유사한 농도의 SAC 처리에 의한 in vitro 세포증식 억제효과들과 일치한다[7, 18, 30, 33]. SAC 처리에 의해 나타난 형태학적 변화인 둥근 다각형 세포구조에서 가늘고 긴 방추형태로의 전환에 대한 구체적인 원인 또는 기전은 명확하게 설명되지 않으나, trypan blue exclusion assay의 결과에서 보여준(Fig. 1B) SAC에 의한 농도 의존적인 세포 viability 억제효과는 SAC가 HeLa 세포주의 생존능력을 저하시킴으로써 정상적인 세포형태에 대한 변화를 초래함에 있어서 최소한 부분적인 원인으로 사료된다. 따라서 이러한 SAC에 의해 유도된 세포 생존능력의 저하는 결국 감소된 세포증식 효과에 기여한 것으로 여겨진다.

세포예정사는 세포의 비정상적인 증식을 억제할 뿐만 아니라 손상된 세포를 조직으로부터 제거함으로써 염증반응과 괴사를 방지한다. 그러나 암세포는 이러한 적절한 세포 사멸기전을 방해함으로써 통제되지 않는 세포증식을 일으킬 수 있으며, 이는 여러 유형의 암에서 나타나는 전형적인 특징으로 알려져 있다. 지난 수 년간 SAC를 포함한 마늘 유래 유기황 화합물들이 인간 백혈구암세포[32], 대장암세포[3], 유방암세포[21] 및 난소암세포[33] 등을 포함한 여러 유형의 암세포들에서 세포자멸을 유도하는 것으로 보고되어 왔다. 본 연구에서는 SAC가 HeLa 세포주의 DNA 분절을 일으켜 세포자멸을 유도한 것으로 나타났다(Fig. 3, 4). 이러한 SAC에 의해 유도된 HeLa 세포주의 DNA 분절은 이전에 보고된[1] 전립선암세포주 PC-3에서 마늘 유래 유기황 화합물 DADS에 의한 DNA 분절 효과와도 일치한다. 그러나 이러한 결과와는 달리, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene에 의해 발암이 유도된 hamster 협낭에서 SAC가 DNA 분절을 유도하지 않고 세포사멸을 초래한다는 Balasenthil 등[2]의 보고와 SAC가 DNA 분절 억제를 통하여 쥐의 간세포에서 chromium에 의해 유도된 세포사멸을 감소시킨다는 Kalayarasan 등[15]의 상반된 보고는 SAC의 작용이 세포가 유래된 species 뿐만 아니라 표적 조직세포의 유형 및 세포의 특이적인 생리적 상태(in vitro 및 in vivo 상태에서의 정상세포 또는 암세포)에 따라 다른 기전을 통하여 세포사멸을 유도하거나 또는 사멸로부터 보호효과를 나타낼 수 있음을 시사한다. 따라서 한 세포주 또는 특정 동물모델로부터 얻어진 결과에 기초한 SAC 매개 세포 증식 또는 사멸에 미치는 효과를 다른 유형의 세포주 또는 동물모델에 동일하게 적용하는 것은 적절하지 않으며 각 세포 유형에 따른 독립적인 연구의 필요성을 제시한다.

암세포 증식의 또 다른 특징들 중의 하나는 세포주기를 통제하는 checkpoint의 상실이다. Checkpoint는 G1/S기 또는 G2/M기에서 활성화되어 각각 손상된 DNA의 복제를 방지하거나 또는 유사분열 동안 손상된 염색체의 분리를 차단함으로써 세포주기의 각 단계별 특이적 과정들을 완성시키고 유전적인 통합성을 유지하는 중요한 기능에 관여한다[11]. 이전의 연구들은 세포주기 checkpoint의 상실이 암의 발병기전 및 화학적 항암요법의 효과에 영향을 미침으로써 암의 진행과 연관되어 있음을 제시하였다[17, 22]. 본 연구의 결과, HeLa 세포에 대한 SAC의 처리는 S기에 해당하는 세포의 축적과 함께 G0/G1기의 세포를 감소시킴으로써, G2/M기 단계에서 세포주기 진행의 억제를 초래하는 것으로 나타났다(Fig. 5). 이러한 결과는 마늘 유래 유기황 화합물을 처리한 이전의 몇몇 암세포주에 대한 연구에서 세포주기의 진행이 cyclin-dependent kinase (cdk) 및 cyclin을 포함하는 다수의 세포 신호전달분자 및 histone의 발현과 활성 조절을 통하여 G2/M기 단계에서 억제된다는 이전의 보고와 일치한다[11]. Lew 등[18]의 보고에 의하면, 전립선암세포주 PC-3에서 DATS의 처리는 cell division cycle (cdc) 25의 인산화를 통하여 G2/M 기의 세포주기 억제를 유도하였으며, Druesne 등[9]은 대장암세포주 HT-29에서 DADS의 처리가 히스톤 단백질의 아세틸화 및 cdk1 inhibitor p21의 유도를 통한 다른 기전에 의해 G2/M 기의 세포주기가 억제됨을 보고하였다. 한편, SAC에 의한 HeLa 세포주의 G2/M기 억제기전을 나타내는 본 연구의 결과와는 달리, Ng 등[26]에 의하면, 간암세포주 MHCC97L에서 SAC의 처리가 cdc25c, cdc2 및 cyclin B1의 발현 감소를 통하여 S기를 억제시켰으며, Xu 등[33]의 연구에서는 난소암세포주 A2780에서 SAC의 처리가 PI3K/Akt/NF-κB 경로의 활성 억제를 통하여 G1/S기의 억제를 유도하였음을 보고하였다. 이러한 결과는 SAC를 포함한 마늘 유래 유기황 화합물들이 암세포의 유형에 따라 다른 분자적 기전을 통하여 세포주기의 조절에 관여함을 시사한다.

결론적으로, 본 연구에서는 자궁경부암세포주 HeLa에 대한 SAC 처리가 세포사멸을 촉진할 뿐만 아니라 세포주기의 억제를 유도하여 세포증식을 감소시킴을 제시하며, 이에 대한 자세한 분자적 기전은 향후 추가적인 연구를 통해 규명되어야 할 것으로 사료된다.