Screening of Tyrosinase Inhibitory Activity of Plant Oriental Medicines (1)

식물성 한약의 Tyrosinase 활성 저해 효과 검색 (1)

Abstract

Tyrosinase is a key enzyme to control the biosynthesis of melanin pigments and has two enzyme activities, namely of 1-tyrosine hydroxylase and of 1-dopa oxidase. Thus, tyrosinase is regarded as a target in skin-whitening and therapeutic intervention of local hyperpigmentation diseases. We have tested tyrosinase inhibitory activity on the water extracts of 50 species oriental medicinal plant. Among them, five medicinal plants, Linderae Radix, Clematidis Radix, Cinnamomi Cortex Spissus, Fritillariae Thunbergii Bulbus and Bulbus Fritillariae Cirrhosae were investigated strong inhibition effect. Five medicinal plants were fractionated using organic solvents (methylene chloride, ethyl acetate, n-butanol, water). Cinnamomi Cortex Spissus (ethyl acetate fraction) was investigated strong inhibition effect. Tyrosinase inhibitory activity below $IC_{50}\;40{\mu}g/ml$ is confirmed in five herbal plants that are Linderae Radix, Clematidis Radix, Cinnamomi Cortex Spissus, Fritillariae Thunbergii Bulbus and Bulbus Fritillariae Cirrhosae. Tyrosinase inhibitory levels ($IC_{50}\;{\mu}g/ml$) of each plants were 15.56, 35.02, 25.14, 15.20 and 39.77. We also investigate the effect of effective plant's fraction. in dose of $100{\mu}g/ml$, Cinnamomi Cortex Spissus (P-36) EtOAc fraction significant inhibitory effect over 50%. Clematidis Radix (P-35) and Cinnamomi Cortex Spissus (P-36) MC fraction inhibit tyrosinase each 36.60% and 43.21%. inhibitory rates of Fritillariae Thunbergii Bulbus (P-40) EtOAc and $H_2O$ fraction are 31.40% and 31.51%. Bulbus Fritillariae Cirrhosae (P-45) BuOH fraction regulate tyrosinase activity to 37.71%. We examined tyrosinase inhibitory activity of natural products and these results suggest that several herbs have potential as a new whitening material.

재료 및 방법

재료 −본 실험에 사용한 식물성 한약 50종은 2010년 3월 세화당 한약도매(광주 계림동)에서 구입하였고 순천대한약자원학과(박종철 교수)에서 감정한 것을 사용하였으며, 표준품은 순천대학교 한약자원학과 약효분석학실험실의 표본실에 보관하였다(Table I).

Table I.The list of plant oriental medicines

시약 및 기기 − Tyrosinase(Sigma Chemical Co., St. Louis. U.S.A.)와 tyrosin(Sigma Chemical Co., St. Louis. U.S.A.)을 사용하였으며, 기타 추출 및 활성 측정 시약은 1급 시약을 사용하였다. 동결건조기(Eyela, Japan)와 microplate reader(Emax, U.S.A.)을 사용하였다.

추출물 제조 및 분획 −한약재 각 5 g을 적당히 세절한 후 증류수로 3시간 열탕한 후 추출하였다. 증류수 추출액을 여과한 후 농축하여 동결 건조하였다. 1차 실험에서 tyrosinase 저해 효과가 100 μg/ml 농도에서 70% 이상의 우수한 효과를 보인 5종 한약을 이용하여 각 1.2 kg을 메탄올(MeOH) 3 kg으로 추출하여 회전식감압농축기를 이용하여 농축하였다. 각각의 MeOH 농축물을 10% MeOH에 현탁시킨 후 분획여두에 넣고 메틸렌클로라이드(MC), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(n-BuOH) 순으로 계통분획을 실시하였다(Fig. 1).

Fig. 1.Procedures of fraction of the extracts of oriental medicines.

Tyrosinase 저해 효과 측정 − 50종의 식물성 한약의 물추출물을 대상으로 각각 한약 추출물 3~4 mg에 50 mM K-phosphate Buffer를 1.5~2 ml 넣고 완전 용해시킨 후 각각의 농도별(1000, 500, 250, 100, 50 μg/ml) 시료로 준비하였다. 기질 농도로 L-tyrosine(100 unit, Sigma, U.S.A) 0.3 mg/ml를 potassium phosphate buffer(0.1 M, pH 6.8)로 완전히 녹이고 tyrosinase는 125 unit/ml 농도로 준비하였다. 96 well plate에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 μl와 시료액 20 μl 그리고 tyrosinase(150 U/mL~200 U/mL)액 20 μl를 순서대로 넣었다. 이 용액에 1.5 mM tyrosin 액 40 μl를 넣고 37℃에서 10~15분 동안 반응시켰다. 그리고 이것을 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1M인산염완충액(pH 6.5)을 넣었다. 양성대조군은 kojic acid를 사용하였다.8)

 

결과 및 고찰

식물성 한약 물 추출물의 Tyrosinase 저해 효과 − Tyrosinase는 인체 내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 이 시험은 시험관내에서 tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 평가하는 방법이다.9) 현재까지 천연물로부터 분리된 tyrosinase 활성 억제물질로는 감초에서 분리된 formononetin, glabrene, glabridin, glabrol, 우바우르시의 arbutin, 상백피의 oxyresveratrol, dihydromoriin, artocarbene, 4-prenyloxyresveratrol, 누룩곰팡이의 secondary metaabolite인 kojic acid 등이 있으며, 이중 arbutin과 kojic acid는 현재 미백을 목표로 한 기능성 화장품에 첨가제로 이용되고 있다.10) 또 대표적인 화합물로 phenolic compound, flavonoid, glycolic acid, ferulic acid, isoflavonoids 등이 알려져 있다.3,11)

본 연구는 현재 국내에서 유통되고 있는 한약 중에서 빈용 되는 식물성 한약 50종을 물 추출한 후 각각의 추출물에 대하여 tyrosinase 저해 효과를 검색하여 부작용이 없는 천연물에서 유래한 미백물질을 규명하고자 하였다. 50종의 식물성 한약은 물 추출물로 tyrosinase 저해 효과를 검색한 결과를 Table II에 요약 하였다. 또 5종의 활성이 강한 한약의 유기용매 분획물을 대상으로 하여 tyrosinase 저해 효과를 측정하였다.

Table II.The tyrosinase inhibitory effect of aqueous extracts of plant oriental medicines

Table II의 결과 식물성 한약 50종의 물 추출물 중 tyrosinase저해 효과가 갈근(P-1) 56%, 마황(P-9) 33%, 산두근(P-22) 56%, 오약(P-32) 92%, 위령선(P-35), 육계(P-36) 90%, 절패모(P-40) 98%, 지실(P-42) 35%, 천패모(P-45) 79%로 tyrosinase 활성 저해효과를 나타내었다. 특히, 가장 좋은 효과를 보인 절패모는 이전의 연구에서 절패모 에탄올 추출물에서 세포독성이 아주 적게 나타났으며, 세포수준의 실험결과 멜라닌 생성에 대하여 우수한 억제효과를 나타내었다.12) 그러나 절패모 에탄올 추출물은 일반적으로 멜라닌 합성의 주효소로 알려진 tyrosinase의 활성은 억제하지 않았으며, 멜라닌 합성관련효소인 tyrosinase, TRP-1과 TRP-2의 단백질 발현에도 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.12) 따라서 절패모 에탄올 추출믈의 멜라닌 생성 억제 작용은 일반적인 경로인 tyrosinase 효소 억제 기전을 경유하지 않는 또 다른 경로를 통하여 멜라닌 합성이 조절되고 있음을 시사해 주고 있다. 추후 멜라닌 합성의 과정에 관여하는 다른 기전에 대한 자세한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한, IC50 40 μg/ml 이하 억제활성을 보이는 식물성 한약은 오약(P-32), 위령선(P-35), 육계(P-36), 절패모(P-40), 천패모(P-45) 등 5종으로 확인되었다(Table III).

Table III.The tyrosinase inhibitory effect (

5종 한약 중 tyrosinase 저해 효과가 강한 한약인 오약(烏藥)은 기(氣)를 소통시키고 기체(氣滯)를 소제(消除)하는 효능이 있는 이기약(理氣藥)에 속하며,13) 녹나무과에 속한 상록관목인 오약의 근경을 건조한 것으로, 동의보감에는 성질은 따뜻하며 맛이 맵고 독이 없다. 모든 기병(氣病)과 냉병(冷病)을 낫게 하며 중악(中惡)으로 명치 아래가 아픈 것, 주오(主)와 헛것에 들린 것을 낫게 하고 방광과 신(腎)의 냉기(冷氣)가 등심으로 치미는 것을 낫게 한다. 곽란(霍亂)과 반위(反胃), 구토, 설사, 이질, 옹종(擁腫), 옴, 문둥병을 낫게하고 오줌이 술술 자주 나가는 것, 부인의 혈, 기로 오는 통증 등을 낫게 하며 어린이 뱃속의 여러 가지 충을 죽인다 하였다.14) 성분으로는 linderenol, linderene, linderenone, bilindestenolide, higenamine, magnoflorine 등이 있으며, 약리작용으로 건위정장(健胃整腸), 장관평활근의 운동을 촉진시킨다.15) 임상응용으로는 배꼽주위의 동통, 장명 등의 한통(寒痛) 증상(신경성위장염, 장관유착으로 인한 경도의 통과 장애 등에서 볼 수 있다)에 적용되며, 소장 hernia, 부고환염 등으로 통증이 배꼽주변까지 방산(放散)하는 경우에 사용하고, 허한(虛寒)으로 인한 빈뇨, 기체로 인한 월경통에 사용한다.16) 오약(P-32)의 tyrosinase 저해효과를 나타내는 IC50 μg/ml 값은 15.56이었다(Table III).

위령선(葳靈仙)은 미나리아재비과에 속한 다년생 낙엽성 만경식물인 으아리와 위령선의 근과 근경을 건조한 것으로, 동의보감에서는 여러 가지 풍을 없애며 5장의 작용을 잘하게 하며 뱃속에 냉으로 생긴 체기, 가슴에 있는 담수(痰水), 징가(癥痂), 현벽(痃癖), 방광에 있는 오랜 고름과 궂은 물, 허리와 무릎이 시리고 아픈 것을 낫게 한다. 오래 먹으면 온역과 학질에 걸리지 않는다 하였다.14) 성분으로는 anemonin, anemol 등이 있으며, 약리작용으로 목구멍에 걸린 뼈를 내려가게 해 주며, 식초 추출물은 생선뼈에 대하여 연화작용을 나타낸다. 또한 피부진균의 성장을 억제하고, 해열 진통 작용이 있으며 항 이뇨작용과 요산을 녹이는 작용으로 통풍에 효과가 있다.15)

임상응용으로는 사지관절통·관절의 운동장애·수족마비 등의 증상을 수반하는 만성관절 류머티즘에 사용한다.16) 위령선(P-35)의 tyrosinase 저해효과를 나타내는 IC50 μg/ml 값은 35.02이었다(Table III).

육계(肉桂)는 녹나무과에 속한 상록교목인 육계의 수피를 건조한 것으로, 동의보감에는 성질은 몹시 열하며 맛은 달고 매우며 조금 독이 있다. 신(腎)을 잘 보하므로 5장이나 하초에 생긴 병을 치료하는 약으로 쓴다. 수족소음경에 들어간다. 빛이 자주빛이면서 두터운 것이 좋다. 겉껍질을 긁어 버리고 쓴다 하였다.14) 성분으로는 cinnamaldehyde, cinnamyl acetate, phenylpropyl acetate, cinnamic acid, cinnzeylanine, cinnzeylanol 등이 있으며, 약리작용으로 cinnamaldehyde는 부신에 직접 작용하여 혈중 catecholamine의 농도를 상승시키며, 혈압강하, 심박수 감소, 혈당상승을 유발한다.15) 임상응용으로는 양허(陽虛), 내한(內寒), 신기허약(腎氣虛弱)을 치(治)한다. 허한(虛寒)으로 인한 복통, 식욕부진, 상복부팽만, 구토, 설사 등에 건위작용을 이용한다. 월경지연(月經遲延), 하복부냉통 등의 부인과 증상에 활혈통경진통(活血通經鎭痛)의 효능을 이용해서 쓴다.16) 육계(P-36)의 tyrosinase 저해효과를 나타내는 IC50 μg/ml 값은 25.14이었다(Table III).

천패모(川貝母)는 백합과에 속한 다년생 초본인 천패모, 암자패모, 감숙패모 또는 능사패모의 인경을 건조한 것으로, 동의보감에는 성질은 평하고 맛은 맵고 쓰며 독이 없다. 담을 삭게 하고 심과 폐를 눅여준다. 폐위(肺痿)로 기침하고 폐옹(肺癰)으로 피고름을 뱉는 것을 낫게 하며 속이 답답한 것을 없애고 갈증을 멎게 하며 쇠붙이에 다친 것과 악창을 낫게 한다. 연교와 같이 쓰면 목에 생긴 영류(癭瘤)를 낫게 한다 하였다.14) 성분으로는 nerticine, verticinone, verticilline, apoverticine, fritilline, fritillarine, peimisine, peimiphine, peiminoside, dongbeinine, dongberine 등이 있으며, 약리작용으로 물추출물은 기관지 확장작용과 함께 기관지점막의 분비를 억제한다.15) 임상응용으로는 주로 만성 해수로써 인건·번열·담소·혈담·식욕부진 등의 폐음허(肺陰虛)의 증상이 있을 때 쓰인다. 폐결핵·만성기관지염 등의 해수에 잘 쓰인다.16) 절패모(P-40)와 천패모(P-45)의 tyrosinase 저해효과를 나타내는 IC50 μg/ml 값은 각각 15.20, 39.77이었다(Table III).

5종 한약 추출물의 분획물을 이용한 Tyrosinase 저해 효과 − 50종의 한약 물 추출물에 대한 tyrosinase 저해 효과를 측정한 결과에서 오약(P-32), 위령선(P-35), 육계(P-36), 절패모(P-40), 천패모(P-45) 등 5종이 우수한 효과를 보였다(Table III). 이 한약들에 대해서 MeOH을 용매로 하여 다시 추출하여 분획을 실시하였다(Fig. 1). 그 분획물 들을 이용하여 tyrosinase 저해 효과를 측정하였다(Table IV-VIII).

Table IV.The tyrosinase inhibitory effect of organic solvents fractions of Linderae Radix

Table V.The tyrosinase inhibitory effect of organic solvents fractions of Clematidis Radix

Table VI.The tyrosinase inhibitory effect of organic solvents fractions of Cinnamomi Cortex Spissus

Table VII.The tyrosinase inhibitory effect of organic solvents fractions of Fritillariae Thunbergii Bulbus

Table VIII.The tyrosinase inhibitory effect of organic solvents fractions of Bulbus Fritillariae Cirrhosae

그 결과 100 μg/ml 농도에서 50% 이상의 tyrosinase 저해효과를 나타낸 육계(P-36)는 물추출물에서 90.28%의 강한 저해효과를 나타냈으며, EtOAc 분획물에서 51.43%의 활성을 보여 다른 분획층에 비해 유의적인 활성을 나타내 지용성 분획층에 활성이 있는 것으로 보여진다.

또한 100 μg/ml 농도에서 30% 이상 50% 이하의 tyrosinase 저해 효과를 나타낸 한약은 위령선(P-35)은 물추출물에서 84.47%, MC 분획물에서 36.60%를, 육계(P-36)는 물추출물에서 90.28%의 강한 저해활성을, MC 분획물에서는 43.21%를 나타냈다. 절패모(P-40)는 물추출물에서 98.21%로 식물성 한약재 중 가장 강한 활성을 나타냈는데, EtOAc 분획물에서 31.40%, H20 분획물에서 31.51%로 물추출물에 비해 분획물에서 약한 활성을 보인 것은 절패모에 함유된 성분 상호간의 작용에 의한 것으로 사료된다. 천패모(P-45)는 물추출물에서 78.47%, BuOH 분획물에서 37.71%의 tyrosinase 저해효과를 보였다.

 

결 론

본 논문은 현대인들의 관심이 높은 미백 효과와 관련된 tyrosinase 저해 효과를 50종의 식물성 한약재를 대상으로 실험하였다. 50종의 식물성 한약은 물 추출물과 5종의 활성이 강한 한약의 유기용매 분획물을 대상으로 하여 tyrosinase 저해 효과를 측정하였다.

1. 식물성 한약 50종을 물 추출한 후 각각의 추출물에 대하여 tyrosinase 저해 효과를 검색하였다. IC50 40 μg/ml 이하 억제활성을 보이는 식물성 한약은 오약, 위령선, 육계, 절패모, 천패모 등 5종이었다.

2. Tyrosinase 저해 효과가 우수한 식물성 한약 5종에 대하여 MeOH 추출물을 대상으로 유기용매 분획을 진행하였고, 그 분획물을 실험재료로 하여 각각의 tyrosinase 저해 효과를 검색하였다. 그 결과 100 μg/ml 농도에서 50% 이상의 tyrosinase 저해 효과를 나타낸 한약은 육계의 EtOAc 분획물이었다. 또한 100 μg/ml 농도에서 30% 이상 50% 이하의 tyrosinase 저해 효과를 나타낸 한약은 위령선의 MC 분획물, 육계의 MC 분획물, 절패모의 EtOAc 분획물과 H2O 분획물, 천패모의 BuOH 분획물 등이었다.

이상의 결과를 토대로 tyrosinase 저해 활성이 우수한 식물성 한약을 밝혔으며, 계속적 연구로써 활성 성분 연구가 이루어진다면 새로운 천연 미백제를 개발 할 수 있으리라 기대된다.