Optimized Germination Conditions and Human p53 Expression of Rice Embryo

쌀눈 발아의 최적조건 확립 및 p53 항암 유전자의 발현

Abstract

Rice embryo is more abundant than endosperms in nutrients such as proteins, lipids, and vitamin B1. In this study, we constructed p53 plasmid that could be expressed in a plant system, and investigated optimal germination conditions in a variety of media. For construction of p53 plasmid, we performed p53 amplification from pCDNA-p53, subcloned to TA cloning vector, and then reconstructed into pGEM-CaMV plant expression vector. On the other hand, we prepared a variety of imbibition buffers and complete media for efficient germination of the rice embryo. Imbibition buffers prepared with different concentrations of salt or detergent showed no significant effect on germination efficiency. We prepared further culture media, such as solid agar, liquid media, and paper towel to establish the optimal conditions. Rice embryo showed germination rates of more than 70% in the solid medium, more than 60% in the paper towel medium, but less than 25% in liquid media, although germination rate did not differ with varying concentrations of salt and sucrose in culture media. Under the optimal germination conditions, we introduced the p53 plasmid using imbibition method, and finally detected human p53 gene expression in the germinated rice embryo. This method might present a novel, practical approach for evaluating efficient gene expression utilizing imbibition method in rice embryo.

쌀의 쌀눈은 배유에 비해 단백질, 지방, 비타민 B1 등의 영양분을 더 많이 함유하고 있다. 본 연구에서는 식물에서 발현 할 수 있는 p53 플라스미드를 제작하였으며, 여러가지의 배지에서 쌀눈 발아의 최적조건을 확립하였다. p53 플라스미드는 pcDNA-p53 플라스미드에서 p53을 얻어내어 TA 벡터에 subcloning을 한 후 식물 플라스미드인 pGEM-CaMV에 p53을 삽입하여 식물에서 발현 가능한 pGEM-CaMV-p53 플라스미드를 제작하였다. 그리고 효율적인 p53 유전자의 도입을 위하여 최적의 팽윤버퍼의 조성 및 배지의 조건을 확립하였다. 팽윤방법을 통한 유전자의 도입에서 팽윤버퍼는 염과 detergent의 서로 다른 농도로 조성하였지만, 이 버퍼조성 사이에서의 쌀눈 발아율의 유의한 차이는 확인되지 않았다. 또한 팽윤된 쌀눈의 발아를 극대화 시키기 위하여 고체한천배지, 액체 배지, 페이퍼 타올 배지의 3가지 조건에 대해서 발아실험을 진행하였다. 그 결과 고체배지에서의 발아율은 70% 정도로 가장 높고 액체배지에서의 발아율은 20% 정도로 가장 낮았으며, 페이퍼 타올배지에서의 발아율은 60% 정도였다. 앞서 확인한 최적의 발아조건에서 쌀눈에 p53 플라스미드를 도입하였고, 그 결과 쌀눈에서의 human p53 발현을 확인 할 수 있었다. 따라서, 팽윤방법에 의한 쌀눈에서의 효율적인 유전자 발현은 쌀의 새로운 부가가 치를 창출할 수 있을 것이다.

서 론

쌀은 우리나라 뿐만 아니라 전세계의 50%가 넘는 인구의 주식으로 사용될 정도로 중요한 곡물이다[11]. 쌀은 일반적으로 왕겨가 20% 내외, 쌀겨가 3% 내외, 쌀눈이 4% 내외로 구성되어 있다[19]. 쌀은 주로 탄수화물로 이루어져 있으며, 단백질과 지방산 및 비타민 등이 풍부하고, 다량의 항산화물질도 함유되어 있다. 이러한 성분들은 생체 내 우수한 기능을 나타낸다고 알려져 있다[4]. 특히 쌀눈은 배유와 비교하여 단백질, 지방, 비타민 B1이 많이 들어있다. 그러나 쌀눈은 도정 과정에서 쌀겨와 함께 제거되며, 쌀눈과 쌀겨가 제거되고 남은 것을 백미라 한다. 이 때문에 백미는 특히 쌀눈의 비타민 B1이 부족하여 백미만을 섭취할 시 각기병과 같은 비타민 B1결핍증에 걸릴 수 있으므로 쌀눈이 부착된 배아미를 섭취해야 할 필요가 있다[8]. 또한, 현재 우리나라에서 쌀은 입맛의 고급화, 건강식품 선호, 수입 개방 확대 등으로 인해 소비가 감소하였으며, 감소된 소비에 비해 과잉생산 되고 있다. 그러므로 단순히 쌀을 영양 및 에너지 공급차원에서 생산하는 것으로는 경쟁력이 부족하다. 따라서 에너지 공급원으로써의 쌀이 아닌 기능적인 면이 부각된 건강 보조식품이나 의학적으로 이용 될 수 있도록 개발 및 생산되어야 경쟁력이 생길 수 있다[1, 5]. 이에 따라 쌀, 특히 쌀눈의 기능적인 측면에 대한 여러 연구가 진행되고 있다. 쌀눈의 기능성에 대한 연구를 보면 쌀눈의 이화학적 성분에 대한 분석, 쌀눈을 활용한 건강기능성 식품을 이용한 고지혈증을 유발시킨 흰쥐에서 지질대사와 항산화 효소 활성의 변화, 쌀눈 기름의 섭취가 당뇨병 환자의 혈당, 혈청 지질 및 혈압에 미치는 영향 등 여러 방면으로 연구가 진행되고 있다[2, 3, 13].

p53은 대표적인 종양억제유전자로 잘 알려져 있으며 정상 세포에서의 apoptosis와 세포주기 조절에 관여한다. p53에 돌연변이가 일어나면 정상세포가 암으로 변이가 된다. p53돌연변이에 의한 암세포화는 전체 암의 50%에 해당하는 것으로 연구되었다[10]. 정상세포가 DNA손상을 입게되면 p53은 p21을 통하여 세포주기를 정지시킨다. 또한, 세포가 복구할 수 없는 손상을 입게 되면 Bax, Bcl-2, Caspase와 같은 단백질들을 발현시켜 apoptosis를 유도하는 것으로 알려져 있다[18]. 이를 통하여 p53은 암의 발생뿐만 아니라 암의 조절에서도 매우 중요한 역할을 수행한다는 것이 강조되고 있고, p53에 대한 연구를 통해 암을 근본적으로 해결할 수 있다는 긍정적인 전망을 내놓을 수 있다.

본 연구에서는 쌀눈에 팽윤방법을 이용하여 항암유전자인 p53을 도입하는 효율적인 방법을 연구하였으며, 이 때 요구되는 쌀눈 발아의 최적 조건을 연구하였다. 또한 연구한 최적의 발아조건을 토대로 한 실험에서 실제로 human p53 단백질이 쌀눈에서 정상적으로 발현하는지 확인하였다.

 

재료 및 방법

벡터와 플라스미드

본 연구에서 CaMV-35S 프로모터가 삽입된 플라스미드는 총 2종류로 β-glucuronidase (GUS)가 삽입된 pGEM-CaMV-GUS와 Green Fluroscence proteins (GFP)가 삽입된 pGEM-CaMV-GFP 이다. 이 플라스미드들은 울산대학교 한인섭 교수, 포항공대 황인환 교수로부터 제공받았다. 본 연구에서 사용된 치료용 단백질인 human p53 유전자는 연구진이 가지고 있던 pcDNA-p53 플라스미드로부터 확보하였다.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Human p53 유전자의 정제를 위해 PCR기법을 이용하였다. 이를 위해 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 human p53 유전자의 염기서열을 확인한 후 Coding Region에 해당하는 부분의 프라이머를 제작하였다. 프라이머의 서열은 S1 (5′-gagatctagaggatccatggaggagccgcagtcagatcctagcg-3′), AS1 (5′-tctcgcggccgcgagctcgtggtgatggtgatgatggtctgagtcaggcccttctgt- 3′)이다. 프라이머를 제작할 때, human p53 유전자의 정제를 효율적으로 하기 위해서 프라이머 sequence에 His tag를 첨가하였다. PCR은 94℃ 30초, 57℃ 40초, 72℃ 1분간 30 cycle을 실행하였다. 증폭된 human p53 유전자는 1% 아가로스 겔 전기영동을 진행한 뒤 human p53이 있는 부분만을 잘라내어 겔 조각을 얻어내고, 이 겔 조각을Mutiple elution kit(BioSolution, Republic of Korea)을 사용하여 human p53을 정제하였다.

클로닝과 제한효소

PCR과 Gel Elution과정을 통해 얻은 human p53 유전자를 TA 벡터에 ligation하여 pBT-53 플라스미드를 확보하고 이를 통하여 subcloning 과정을 거쳤다. 본 연구에서 사용된 제한효소는 XbaI과 NotI이다. 이렇게 얻은 pCaMV-p53 플라스미드는 형질전환과정에 의해 800 μg이상의 양으로 증폭하였다.

현미 및 발아조건

현미는 강원도 홍천 지방에서 생산된 오대 현미를 구매하여 사용하였다. 구매한 현미를 정제수로 5~6회 씻어내고 증류수로 채워 상온에서 약 2일 정도 암조건에서 배양시켜 발아율을 확인하였다. 팽윤실험에 사용할 현미눈은 냉장고에 5일 이상 냉장건조 시킨 후에 각 현미에서 쌀눈을 스카펠로 각각 떼어내었다.

버퍼와 배지

떼어낸 쌀눈에 유전자를 도입하기 위해 팽윤방법을 이용하였다[21]. 팽윤방법에 사용한 버퍼의 종류는 5가지로 1X SSC(Saline-Sodium Citrate), 0.5X SSC, 0.5X SSC+20% PEG(Polyethylene Glycol), DW, DW+20% PEG다. 고체배지는 한천배지로 5가지의 다른 농도조성의 0.6% 한천배지를 제작하였다(1X MSO+3% sucrose, 0.5X MSO+3% sucrose, 0.25X MSO+3% sucrose, 0.5X MSO+1% sucrose, 0.25X MSO+1% sucrose). 액체배지는 총 3가지의 농도 조성으로 제작하였다(1X MSO+3% sucrose, 0.5X MSO+3% sucrose, 0.25X MSO+3% sucrose). 페이퍼 타올에 적신 액체배지는 앞선 3가지 액체배지에 2가지 조건을 추가하여 진행하였다(0.5X MSO+1% sucrose, 0.25X MSO+1% sucrose).

쌀눈에서의 단백질 추출과 웨스턴 블로팅

발아된 쌀눈을 막자 사발에 모아 모두 분쇄한 후 1.5 ml Micro Centrifuge tube에 옮겨주었다. 이 tube에 Extraction 버퍼(50 mM NaPO4, 10mM β-mercaptoethanol)을 넣어 12,000 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하여 상층액만 취했다. 추출한 상층액을 10% SDS-Polyacrylamide겔에 전기영동을 하였고, 나일론 멤브레인으로 트랜스퍼한 뒤 human p53 단백질에 대한 웨스턴 블로팅을 시행하였다.

 

결 과

식물 플라스미드로의 human p53 유전자의 subcloning

현미의 쌀눈에 유전자 도입을 위하여 벡터는 CaMV 35S 프로모터를 포함하고 있는 것을 사용하였다. CaMV 35S 프로모터는 식물에서 조직 특이성이나 발생적 특이성이 나타나지 않기 때문에 식물세포 및 조직에서 유전자 발현 연구를 위해 많이 이용되는 프로모터이다. Human p53 유전자는 본 연구진이 가지고 있던pcDNA-p53 플라스미드를 PCR을 통해서 human p53 유전자만을 증폭시킨 후에 일루션을 통하여 순수하게 분리하였다(Fig. 1B). 이후 정제한 human p53유전자와 TA 벡터를 ligation하여 pBT-53 플라스미드를 확보하였다. 이 subcloning플라스미드와pGEM-CaMV 벡터를 제한효소(XbaI/NotI)를 이용하여 pBT-53에선 human p53만을 다시 얻어내고, pGEM-CaMV에선 벡터를 얻어내어 라이게이션을 통하여 pGEM-CaMV-p53 플라스미드를 얻을 수 있었다(Fig. 1A). pGEM-CaMV-p53 플라스미드가 제대로 클로닝 되었는지를 확인하기 위해서 두 제한효소(XbaI/NotI)로 이 플라스미드를 잘라 영동 후 확인결과 human p53유전자와 벡터가 정확한 크기로 잘려진 것으로 보아 pGEM-CaMV-p53 플라스미드를 제대로 확보한 것이 확인되었다(Fig. 1C).

Fig. 1.Human p53 gene cloning into plant expression vector. (A) Human p53 gene was amplified from pCDNA-p53 plasmid, subcloned into TA cloning vector, and then constructed into pGEM-CaMV-His-p53. (B) The amplified human p53 PCR band was detected in agarose gel electrophoresis. (C) Successful pGEM-CaMV-His-p53 constructs were confirmed by using a restriction enzyme digestion (XbaI/NotI).

쌀눈 분리 및 팽윤 방법을 이용한 유전자 도입

쌀에서 분리한 쌀눈에 pGEM-CaMV-p53 플라스미드를 도입하기 위하여 스카펠을 이용하여 쌀에서 쌀눈을 분리하여 사용하였다. 분리한 쌀눈에 human p53 유전자 도입을 위해서 쌀눈을 팽윤버퍼에 상온에서 한 시간 정도 배양하였다. 버퍼는 정제된 플라스미드 10μl (1 μg/ml)와 1X SSC 버퍼 500 μl, 20% DMSO로 구성된 것을 사용하였다(Fig. 2A). 팽윤버퍼에 배양한 쌀눈들은 겸자를 이용하여 한천으로 만든 고체배지에 옮겨주고 상온에서 5일 동안 배양한 뒤쌀눈이 발아가 된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 이 후, 효율적인 발아를 위해서 팽윤버퍼의 최적 조건에 대해서 실험을 진행하였다. 버퍼의 조성은 총 5가지로1X SSC, 0.5X SSC, 0.5X SSC+20% PEG, DW, DW+20% PEG이다. 그 결과 쌀눈의 발아율은 75, 72, 74, 70, 73%로 유의한 차이는 없었다.

Fig. 2.Establishment of imbibitionbuffer condition.(A) This figure typically showed rice embryo in appropriate imbibition buffer. (B) The rice embryo could be germinated in solid agarat 5 day. (C) We tried to decide optimized imbibition buffer condition using a variety of salt or detergent. Rice embryo was cultivated in buffer of different compositions. (buffer 1; 1X SSC, buffer 2; 0.5X SSC, buffer 3; 0.5X SSC + PEG, buffer 4; D.W, buffer 5; D.W + PEG).

쌀눈 배양을 위한 최적의 배지조건 확립

앞서 확인한 최적의 팽윤버퍼에서 배양된 쌀눈에서 유전자의 발현 및 발아를 극대화하기 위해서 적합한 배지의 조성에 대해서 실험하였다. 본 연구에서 사용된 배지의 종류는 크게 3종류로 고체한천배지, 액체배지, 페이퍼 타올배지에서의 발아율을 확인하였다. 고체배지는 5가지의 서로 다른 MSO 및 sucrose의 농도배합을 가진 0.6% 한천배지를 사용하였다. 팽윤버퍼에서 고체한천배지로 쌀눈들을 옮겨주고 상온에서 3일 동안 배양한 이 후, 발아율을 확인하였다. 그 결과 각각의 배지는 72, 78, 73, 70, 73%의 발아율을 보였고 이를 토대로 0.5X MSO+3% sucrose+0.6% 한천배지가 가장 최적 조건의 배지임을 확인하였다(Fig. 3A). 고체한천배지에서 효율성을 높이기 위해 상대적으로 대량으로 배양 할 수 있는 액체배지로 실험을 진행하였다.액체배지는 3가지의 농도배합을 사용하였다. 액체배지에서의 배양은 액체배지 10 ml당 200개의 쌀눈을 접종하여 배양하였다.그 결과 발아율은 22, 25, 23%로 모든 조건에서의 발아율이 고체한천배지에서보다 현저하게 낮았다(Fig. 3B). 다음으로 액체배지의 낮은 발아율을 보완하고, 고체보다 제작이 용이한 페이퍼 타올배지에 대한 실험을 진행하였다. 페트리디쉬에 페이퍼 타올을 3~4장 깔고 총 5가지의 조건을 달리한 액체배지로 페이퍼 타올을 충분히 적신 후에 고체배지와 동일하게 쌀눈을 하나씩 옮겨 배양하였다. 발아율 확인 결과 63, 67, 65, 68, 63%로 0.5X MSO+0.3% sucrose배지가 가장 효율적인 것으로 나왔다. 이는 고체배지에서의 발아율보다 낮은 수치이다(Fig. 3C). 따라서, 배유가 없는 쌀눈에서 정상적인 발아를 위해서는 고체배지가 가장 최적의 조건이라고 할 수 있다.

Fig. 3.Relative germination rate in different culture medium (A) Solid agar is made up 5 different compositions (Number 1; 1X MSO + 3% sucrose, Number 2; 0.5X MSO + 3% sucrose, Number 3; 0.25X MSO + 3% sucrose, Number 4; 0.5X MSO + 1% sucrose, Number 5; 0.25X MSO + 1% sucrose). (B) Liquid media is made up 3 different compositions (Number 1; 1X MSO + 3% sucrose, Number 2; 0.5X MSO + 3% sucrose, Number 3; 0.25M MSO + 3% sucrose). (C) Paper towel was soaked to liquid media (Number 1; 1X MSO + 3% Sucrose, Number 2; 0.5X MSO + 3% Sucrose, Number 3; 0.25X MSO + 3% sucrose, Number 4; 0.5X MSO + 1% sucrose, Number 5; 0.25 MSO + 1% sucrose).

배양된 쌀눈에서의 p53 유전자 발현 확인

현미에서 분리해낸 쌀눈에서의 human p53 유전자의 발현을 확인하기 위해 본 연구에서 확인된 최적조건의 팽윤버퍼와 고체한천배지에서 배양하였다. Human p53이 도입된 쌀눈을 확인하기 위해 배지에서 발아된 쌀눈을 중 3개를 막자 사발로 옮긴 후에 분쇄하여 단백질을 추출하였고 분해한 쌀눈을 전기영동 및 웨스턴 블로팅 과정을 통하여 p53의 발현 유무를 확인하였다. 이 때 각 쌀눈에서의 단백질 발현량의 차이가 있는지 확인하기 위해서 전기영동을 진행한 후 쿠마시 블루염색법을 진행하였다. 그 결과 쌀눈들 사이에서의 전체 단백질 발현량은 차이가 없었다(Fig. 4A). 최종적으로 p53 단백질의 발현유무를 확인하였을 때, 쌀눈 3개 중 2개에서 human p53 단백질의 발현을 53 kDa에서 확인할 수 있었다(Fig. 4B).

Fig. 4.Human p53 protein expression in germinated rice embryo. (A) Extracted protein from germinated rice embryo was confirmed with coomassie blue staining. (B) It was detected human p53 protein expression from the extracted protein using western blot analysis.

 

고 찰

쌀의 영양학적 가치를 살리면서도 영양과잉시대에 뒤떨어지는 쌀의 경쟁력을 항암유전자의 도입으로 그 가치를 더 높이는 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 human p53 유전자를 식물인 쌀눈에서 발현을 할 수 있도록 CaMV 35S 프로모터를 포함하고 있는 벡터에 클로닝하였다. 또한 단순히 발현의 여부 확인뿐만 아니라 효율적인 human p53 단백질의 발현을 위해서 팽윤버퍼와 종류별 배지의 최적조건을 확립하고자 하였다. 팽윤버퍼는 5가지의 조건을 설계하였는데, 이5가지 사이의 차이는 염의 농도차이, Detergent의 유무이다. 염의 유무측면에선 SSC를 첨가한 버퍼가 일반 증류수가 첨가된 버퍼에서 쌀눈에서의 human p53 발현율이 더 높게 나타났고, Detergent의 유무 측면에선 PEG가 첨가된 버퍼가 발현율이 높게 나타났다. 이는 플라스미드가 쌀눈의 세포 내로 이입될때 Detergent가 이 과정을 더 효율적이게 해준다고 할 수 있다. 그러나, 실험결과 각 버퍼의 조성 차이에 의한 쌀눈 발아율의 유의한 차이는 확인할 수 없었다. 본 연구에서는 비교적 소량의 쌀눈을 대상으로 진행된 조건이기 때문에 추후 대량으로 유전자 팽윤을 시킬 경우 버퍼의 조성은 달리 해야 할 것이다.

팽윤된 쌀눈의 발아율을 극대화 시키기 위해서 여러 가지조건의 배지에 대해서 실험을 하였다. 실험결과 다른 조건의 배지보다 고체한천배지에서 발아율이 높은 것으로 나타났다. 고체한천배지에서는 배지 위에 쌀눈들이 일정 간격으로 배양되었기 때문에 산소 등 여러 발아에 필요한 요소를 확보하는데 있어서 보다 용이하였기 때문에 가장 높은 발아율을 나타난 것으로 사료된다. 하지만 고체한천배지에서는 배양을 대량으로 할 수 없고, 배지를 생산하는 데에도 다른 종류의 배지보다 비효율적이라는 단점이 있다. 이를 보완하기 위해 액체배지에 약 200개의 팽윤된 쌀눈을 배양하는 실험을 진행하였다. 액체배지는 대량으로 배양할 수 있기 때문에 효율적이고 고체한천배지에 비해 상대적으로 제작이 간단하여 경제적이므로 추후 대량생산과정에서 꼭 필요한 조건이다. 그러나, 본 연구에서 액체배지 상에서의 발아율은 가장 낮았다. 이는 쌀눈이 발아에 필요한 요소들을 획득하기에는 액체배지가 고체한천배지보다 불리한 조건을 갖기 때문이라 사료된다. 고체한천배지의 높은 발아율이라는 장점과 배지의 제작이 고체한천배지에 비해 간단하다는 액체배지의 장점을 살리기 위하여 페이퍼 타올을 이용한 배지에 대한 실험을 진행하였다. 페이퍼 타올배지에서는 고체한천배지와 비교해보면 발아율이 낮게 나타났으나 액체배지에 비하면 보다 높은 발아율을 나타내었다. 하지만 페이퍼 타올 배지도 대량으로 배양하기에 비효율적이라는 한계가 존재하며, 앞으로 대량생산체제에서 최적의 조건을 가진 배지에 대한 연구는 계속해서 진행되어야 한다.

본 연구에서 확립된 버퍼와 배지의 최적조건에서 human p53 유전자가 도입된 형질전환 쌀눈에서의 p53 단백질 발현을 확인하였다. 3개의 쌀눈 중 2개에서 human p53 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅을 통하여 관찰하였다. 이를 통해 본 연구에서는 정량화된 p53 유전자의 도입률을 얻을 수는 없으나, human p53단백질이 정상적으로 쌀눈에서 발현한다는 것은 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 보아 형질전환 된쌀눈을 먹음으로써 항암 단백질인 p53을 섭취할 수 있다는 가능성을 제시한다. 본 연구에서는 인위적으로 정제된 p53유전자를 얻어내어 만들어진 플라스미드를 직접 쌀 배아에 도입하였기 때문에 이 과정에서의 돌연변이 발생 가능성은 현저하게 낮아 안정적일 것이다. 하지만 형질전환 된 쌀눈으로부터 얻은 p53이 생체활성을 나타내는 것에 대해서는 의문점이 있을수도 있다. 유사한 연구사례를 살펴보면, 락토페린을 생산할 수 있는 형질전환 벼 추출물을 쥐에게 경구투여 한 결과 면역 반응 생리 활성 효과가 나타난 사례가 있어[15], 본 연구에서의 p53 단백질 생체활성 여부에 대해서도 긍정적으로 접근할 수 있을 것이다. 앞서 언급된 대량생산체제에서의 문제점과 쌀눈에서 발현된 human p53 단백질의 생체활성에 대한 문제점이 향후 추가적인 연구를 통하여 개선 및 해결이 된다면 쌀눈을 매개로 하는 항암유전자의 발현이 다른 단백질의 도입 가능성을 제시하며, 쌀의 부가가치를 높일 수 있는 기술로 이어질 것이다.