길경 추출물에 의한 HCT-116 대장암 세포주에서의 autophagy와 apoptosis 유발 효과

Effects of Platycodon grandiflorum on the Induction of Autophagy and Apoptosis in HCT-116 Human Colon Cancer Cells

Abstract

길경(桔梗, Platycodon grandiflorum)은 도라지의 뿌리로 항염증, 항알러지, 면역 반응, 당뇨, 고지혈증 및 항암 효과 등을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 길경의 항암 효과에 대한 연구는 미미하며, 길경이 유발하는 autophagy에 대한 연구는 되어 있지 않다. 본 연구에서는 HCT-116 대장암 세포주에서 길경 추출물이 autophagy와 apoptosis를 유발하면서 세포 성장을 억제하는지의 여부를 조사하였다. 길경 추출물은 농도 및 시간의존적으로 세포의 증식을 억제하였으며, 길경 추출물에 의해 나타나는 apoptosis는 caspase의 활성이 부분적으로 관여되어 있음을 알 수 있었다. 또한, 길경 추출물의 처리는 autophagy에 의해 나타나는 공포를 형성하면서 autophagy와 관련되어 있는 여러 단백질의 발현 조절 및 LC3 단백질의 축적이 동반되었다. 길경 추출물에 의해 유도되는 autophay와 apoptosis의 관계를 알아보기 위해서 3-MA나 bafilomycin A1을 처리하여 autophagy를 억제하였을 때 apoptosis가 유의적으로 증가됨을 알 수 있었다. 흥미롭게도 bafilomycin A1을 처리한 결과에서 길경 추출물에 의한 세포성장 억제가 뚜렷하게 회복되는 양상을 보였다. 따라서 본 연구의 결과는 HCT-116 세포에서 길경 추출물에 의해 유도된 autophagy는 세포 보호적인 작용이 아닌 autophagic cell death이며, 길경 추출물이 대장암 세포주에서 암세포의 사멸을 유도하는 효과적인 대안이 될 수 있음을 알 수 있었다.

Platycodon grandiflorum (PG) has been known to possess many biological effects, including anti-inflammatory and anti-allergy activity and anti-obesity and hyperlipidemia effects. However, little research has been conducted regarding its anticancer effects, with the exception of its ability to stimulate apoptosis in skin cells. There has also been no study regarding PG-induced autophagy. The modulation of autophagy is recognized as one of the hallmarks of cancer cells. Depending on the type of cancer and the context, autophagy can suppress or help cancer cells to overcome metabolic stress and the cytotoxicity of chemotherapy. Therefore, the present study was designed to investigate whether or not extracts from PG-induced cell death were connected with autophagy and apoptosis in HCT-116 human colon cancer cells. PG stimulation decreased cell proliferation in a dose- and time-dependent manner and induced apoptosis, which was partially dependent on the activation of caspases. PG treatment also resulted in the formation of autophagic vacuoles simultaneously with regulation of autophagy-related genes. Interestingly, a PG-mediated apoptotic effect was further triggered by pretreatment with the autophagy inhibitors 3-methyladenin and bafilomycin A1. However, cell viability recovered quite well with bafilomycin A1 treatment. These findings show that PG treatment promotes both autophagy and apoptosis and that PG-induced autophagic response might play a role in the autophagic cell death of HCT-116 cells.

서 론

대장암은 전 세계적으로 남성에게는 3번째로 여성에게는 2번째로 흔한 암으로 모든 암 사망률의 8%에 이른다. 미국에서는 대장내시경을 통한 초기 진단과 전암병변의 제거로 발병률이 최근 감소하고 있는 반면에, 아시아와 동유럽에서는 발병률이 급증하고 있다[6]. 우리나라의 경우도 암 발생률은 전 세계적인 추세와 같으며, 다양한 치료법의 개발에도 불구하고 전체 사망률도 4위에 이르며, 남녀 모두에서 여전히 증가하고 있는 추세이다.

Autophagy는 자가포식작용으로 세포 내에서 기본적으로 일어나는 생리적 과정으로 항상성 유지, 발달 과정, 면역 기능, 노화 및 다른 병리적인 기능에도 영향을 미치고 있어 autophagy의 조절 장애가 암을 비롯한 방대한 질병 발생 및 치료에 영향을 미칠 것으로 생각되고 있다[4, 11]. Autophagy에 의해 유도된 세포사를 autophagic cell death 및 세포예정사(programmed cell death) type II라고도 하며, autophagy를 이용한 암 치료법 개발이 진행되고 있으나, autophagy의 암에서의 작용은 매우 복잡하여 종양의 종류, 단계, 및 유전적 차이에 따라 다르게 나타나는 것으로 보인다[1, 7]. Apoptosis는 세포예정사 type I으로 불리며 세포내의 자발적인 파괴양상으로 과도하거나 부족한 경우에 허혈, 신경퇴행성질환, 자가면역질환, 바이러스 감염 및 종양의 성장과 재발에 기여를 한다[6]. 최근에는 autophagy와 apoptosis의 복잡한 상호 작용에 관한 연구가 주목을 받고 있는데, 몇몇의 apoptosis의 경우autophagy의 억제제나 유도제로 작용하여 많은 항암제에 대해 저항성의 변화를 일으키거나 임상적 적용을 가능하게 하는 작용을 하는 것으로 알려져 있으므로 다양한 상황에서 autophagy와 apoptosis에 관한 연구가 더 필요한 실정이다[16].

본 실험에 사용한 길경(桔梗, Platycodon gradiflorum)은 길경과에 속한 다년생 초본인 도라지의 뿌리를 건조한 것으로 한 의학적으로 성질은 평(平)하고, 맛은 고신(苦辛)하다[9]. 길경의 주요 활성성분은 사포닌으로 platycodn D와 platycodon D3 등을 포함한 24가지가 함유되어 있으며 항염증, 항알러지, 면역 반응, 당뇨, 고지혈증 및 항암 효과 등을 가지고 있어 최근 많은 관심을 받고 있다[13]. 하지만 종양에 대한 연구는 적은 편이며 길경 사포닌이 아닌 길경 추출물 자체에 대한 연구도 미미하고, 특히 길경이 유발하는 autophagy에 대한 국·내외 연구는 이루어져 있지 않다. 이에 이번 논문에서는 길경 추출물이 대장암 세포주인 HCT-116 세포주에서 세포사를 일으키는 기전으로 autophagy와 apoptosis를 유발하고, autophagy를 억제했을 경우 apoptosis는 더욱 증가하면서 세포의 증식은 감소하였음을 밝히는 바이다.

 

재료 및 방법

시료준비

본 연구에 사용된 길경은 옥천당㈜(울산, 한국)에서 건조된 국산을 구입하여, 추출에 적합하도록 세절한 후 약재 무게의 10배에 해당하는 증류수로 100°C에서 3시간 동안 추출하여 사용하였다. 이후 추출액을 Whatsman No.2 filter paper (Sigma- Aldrich Chemical Co., St. Lousi, MO, USA) 로 거른 후 동결건조기를 사용하여 분말로 만들어 증류수에 100 mg/ml의 농도로 녹인 후 고압증기멸균기에서 멸균 처리하였다. 이 준비된 길경 추출물은 무균실험대 안에서 Sartorius AG (Weender Landstr, Germany)에서 구입한 Minisart® Syringe filter (0.2 μm)를 사용하여 거른 후 사용하였다.

시약 및 항체

세포배양을 위한 Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), RPMI-1640 배지, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT), 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iodide (PI), 3-methyladenin (3-MA), bafilomycin A1은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Lousi, MO, USA)에서, z-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (z-VAD-fmk)은 Calbiochem(San Diego, CA, USA)에서 구하였다. Autophagy 관련 항체는 Cell Signaling (Beverly, MA, USA)의 autophagy antibody sampler kit를 구입하였고, 나머지 1차 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

세포배양

실험에 사용한 대장암 세포주(HCT-116)는 생명공학연구소 (KRIBB, 대전, 한국)에서 분양 받았으며, 암세포의 배양을 위해 RPMI-1640 배지와 10%의 FBS 및 1%의 penicillin이 포함된 성장배지를 사용하였으며, 37℃ 및 5% CO2조건 하에서 배양 하였다.

MTT assay를 이용한 세포 생존율의 측정

세포 배양용 6 well plate에 1.5×105개/ml로 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화 시킨 후, 길경 추출물을 각 well 당 적정 농도로 처리하였다. 약물 처리 24시간 및 48시간 후 MTT 시약을 0.5 mg/ml 농도로 희석하여 200 ul 분주하고 37℃에서 2시간 동안 다시 배양하였다. 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 2 ml씩 각 well에 분주하여 생성된 formazan을 모두 녹인 후 96 well plate에 20 ul씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포의 형태 관찰

세포 배양용 6 well plate에 1.5×105개/ml 세포를 분주한 후, 다양한 농도의 길경 추출물을 처리하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 48시간 동안 배양시켰다. 도립 현미경을 이용하여 50배 및 200배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 형태 변화를 관찰하여 가장 대표적인 사진을 촬영하였다.

Trypan blue-excluding cells

길경 추출물 비처리군 및 12, 24, 48시간 처리한 세포를 원심 분리하여 세포만 분리한 후 배지 1 ml을 넣어 고루 섞이게 후 10 ul를 다른 e-tube에 옮긴 후 trypan blue 10 ul와 섞어주었다. 그 후 hemocytometer의 양쪽에 각각 10 ul을 분주하여 trypan blue가 염색된 세포를 수를 측정하였다. 한 처리군 당이 과정을 3번 반복하여 평균으로 값을 표시하였다.

DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰

Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 길경 추출물이 처리된 세포를 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 500 ul을 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 fixing solution을 제거하고 PBS 200ul에 부유시킨 후 세포가 포함되어 있는 PBS 80 ul를 slide glass 위에 떨어뜨리고 1,000 rpm에서 5분간 cytospin하여 세포를 slide glass에 부착하였다. 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2~3회 정도 세척하고 PBS가 마르기 전에 0.2%의 Triton X-100 (Amresco, Solon, OH, USA)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정한 후 2.5 ug/ml 농도의 DAPI 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.

Flow cytometry 분석

HCT-116 세포에서 길경 추출물이 유발하는 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 다양한 농도의 길경 추출물을 48시간 동안 처리하여 세포들을 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS를 이용하여 2~3회 정도 세척하였다. 준비된 세포는 Cycle TEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4°C, 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포 로 분리한 후 FACS Calibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.

Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석

길경 추출물 처리에 따른 번역 수준에서의 유전자 발현 변화 관찰을 위하여 준비된 세포들을 모은 다음, 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM pheny- methylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 용해시켰다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Herculs, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad, Hercules, California, USA)를 섞어서 protein sample을 만들었다. 정량한 후, 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시켰다. 분리된 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 1시간 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 antibody를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 antibody에 맞는 2차 antibody (PBS-T로 1:1,500으로 희석하여 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시킨 후, enhanced chemiluminoesence solution (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 이용하여 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.

면역형광법

Autophagosom이 형성된 증거로 사용되는 LC의 punta를 측정하기 위해서, 멸균된 multi well plate에 세포를 분주한 뒤에 세포가 완전히 부착하면 길경 추출물을 24시간 처리한 후 배지를 깨끗하게 제거하였다. 4℃ 조건에서 각 30분간 PBS에 희석시킨 3.7% formaldehyde로 고정, 0.2% Triton X-100으로 핵에 구멍을 내는 과정을 시행한 후 PBS로 세척하였다. 2% BSA/PBS-T로 1시간 반응시켜 세포의 반응을 억제한 후 실온에서 LC3 단백질으로 2시간, 2차 항체로 1시간씩 각각 반응시키고 PBS-T로 세척하였다. 그 후 DAPI solution으로 핵을 염색한 후 crystal mounting으로 고정하고 형광 현미경을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 LC3 단백질의 발현 양상 변화를 관찰하였다. 이 영상을 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.

통계 처리

모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였고, Sigma-Plot (systat Software Inc., San Joes, CA, USA)을 이용하여 Student t-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.

 

결과 및 고찰

길경 추출물에 의한 HCT-116 대장암 세포주의 증식 억제

길경 추출물의 대장암 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 2 mg/ml의 농도까지 48시간 동안 처리한 후 MTT assay 를 시행하였다. Fig. 1에 나타낸 바와 같이, 길경 추출물 농도가 0.75 mg/ml까지는 세포의 증식에 미치는 효과가 거의 없다가 1 mg/ml에서 세포의 성장이 30%이하로 급격히 감소함을 MTT assay와 현미경 사진에서의 세포의 밀도 감소로 알 수 있었다. 따라서 1 mg/ml의 농도로 길경 추출물을 12시간 간격으로 처리한 후 세포 성장 억제와 세포사의 정도를 측정한 결과, 24시간에서 48시간 사이에 급격히 세포 성장이 억제되고 세포사가 증가하였다(Fig. 2). 이상의 결과로 길경 추출물은 HCT-116 대장암 세포주의 성장을 억제하나, 이 성장 억제가 흥미롭게 길경 추출물의 농도별, 시간별 처리에 의해 급격한 변화가 있는 부분이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1.Suppression of cell growth and proliferation by Platycodon grandiflorum (PG) treatment in HCT-116 human colon cancer cells. A) HCT-116 cells were seeded at an initial density of 1.5× 105 cells per ml in 6 well plates. Cell viability was checked 48 h after indicated concentrations of PG by MTT assay. The data is reported as a mean ± S.D. of three independent experiments (*, p<0.05 versus untreated control). B) Morphologic changes were directly photographed (magnification, x50).

Fig. 2.Induction of apoptosis by PG exposure in HCT-116 cells. A) Cells were stimulated with 1 mg/ml of PG for the marked times. Cell viability was measured by MTT assay. B) Cell death was detected by hemocytometer counting of trypan blue-excluding cells. Each point shows the mean ± SD of three independent experiments (*, p<0.05 versus untreated control). C) Morphologic changes were directly photographed at the indicated times (magnification × 50).

길경 추출물 처리에 의한 apoptosis 유발

세포자멸사는 세포예정사의 첫 번째 형태로 항암 치료의 효율을 높이기 위한 방안으로 많은 연구가 이루어지고 있다[8]. 따라서 길경 추출물의 세포 성장 억제 효과 및 세포사 유발 효과가 apoptosis 유발과 관련이 있는지를 알아보기 위해 flow cytometry 분석을 통한 DNA content의 변화와 핵의 형태적 변화 및 apoptosis와 관련이 있는 주요 단백질의 발현 변화를 조사하였다. PI 염색을 후 flow cytometry를 통한 세포 주기를 분석한 결과, 1 mg/ml의 농도의 길경 추출물을 48시간 처리하였을 때 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도가 유의적으로 증가하였다(Fig. 3A). 또한 DAPI 염색을 통한 핵을 형태를 형광현미경으로 관찰하였을 때에도 정상 세포에서는 보이지 않던 apoptosis의 특징적인 핵의 단편화를 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 길경 추출물에 의한 단백질 발현 조절을 살펴보기 위해 Western blotting을 시행한 결과, 세포자멸사를 촉진하는 중요 단백질 중 하나인 Bid의 단편화로 인한 전구체의 발현 감소를 관찰할 수 있었다. 하지만 세포자멸사를 억제하는 단백질인 Bcl-2 단백질의 발현도 증가하였는데 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다. 다음은 많은 apoptosis가 시스테인 단백분해효소의 무리인 caspase의 단계적인 활성화에 의해 일어나는 것으로 잘 알려져 있기에[9], 길경 추출물에 의한 apoptosis에도 caspase의 활성증가가 관여하는지를 조사하여 보았다. 여러 caspases 중 실행 caspase로 알려진 caspase-3의 단백질 발현 변화를 확인해 본 결과, 전구체의 형태로 존재하고 있던 것이 길경 추출물의 처리에 의해 활성형 형태로 변화되면서, caspase의 기질이면서 DNA의 복구에 관여하는 poly ADP ribose polymerase (PARP)의 감소 및 뚜렷한 분절도 관찰되었다(Fig. 3C). 따라서 Caspase가 직접적으로 길경 추출물에 의한 apoptosis 유도에 작용하는지 알아보기 위해, pancaspase inhibitor인 Z-VAD-fmk (50 μM)를 1시간 선처리하여 세포주기를 측정하였다. 1 mg/ml의 길경 추출물을 48시간 처리한 군에서 Z-VAD-fmk의 선처리로 증가하였던 sub-G1의 수치가 50% 정도 회복되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 미루어 보아, 길경 추출물은 apoptosis를 유도하고 이러한 유도는 부분적으로 caspase의 활성화와 관련이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 3.Inhibition of PG-induced apoptosis by pan-caspase inhibitor in HCT-116 cells. A) HCT-116 cells were treated by PG for various times. The cells harvested and flow cytometer analysis was performed for analysis of DNA content. Population of sub-G1 was shown. Columns represents the mean ± SD of three independent experiments (*, p<0.05 versus untreated control). B) Western blot analysis of the expressions of Bcl-2, Bid, casapase-3, and PARP was performed. A representative Western blot (n=3) is shown. C) Cells were stained with DAPI and cell morphological characterization was analyzed using fluorescence microscope (magnification x50). D) Cells were incubated for 1 hr in the absence or presence of 50 μM Z-VAD-fmk, and then treated with or without PG (1 mg/ml). 24 hr or 48 hr after PG treatment, cells were evaluated for the sub-G1 DNA content using a flow cytometry. Data are mean ± SD from three independent experiments and are presented as fold change compared with vector control (*, p<0.05 versus untreated control).

길경 추출물에 의한 autophagy 유발

위의 실험에서 sub-G1기의 세포가 증가하기는 하나 세포 성장 억제 정도에 비하면 수치가 크게 높지 않았고, 실험 과정 중 길경 추출물 처리 시 정상 세포군에서는 발견할 수 없었던 세포의 크기가 커지고 다양한 크기의 공포가 생기는 특징적인 세포의 형태 변화가 보여(Fig. 4A), 이러한 형태 변화가 세포예정사의 다른 형태인 autophagy 유도와 관련이 있는 지를 살펴 보기 위해 autophagy 발현 시 조절되는 단백질의 발현을 Western blotting으로 확인하여 보았다. Autophagy는 세포질 내 물질들을 재사용 및 분해를 위해 autophagosome을 형성한 후 라이소좀과 결합하여 autolysosome을 만드는 다단계로 진행되며, 각 단계에는 여러 가지 autophagy-related gene (Atg)들이 면밀하게 조화를 이루는 것으로 알려져 있다[7, 12]. Fig. 4B에서 알 수 있듯이, 초기 autophagosome의 생성에 관여하는 Atg5과 Beclin-1은 길경 추출물 1 mg/ml이 처리된 후 12시간부터 단백질 발현이 증가하였다가 시간이 지날수록 감소하는 양상을 보였다. 한편, 이중막(double membrane)의 autophagosome의 형태를 갖추기 위해서는 microtubule-associated protein a light chain 3 (LC3)의 단백질의 변형이 필요하고 Atg3는 이 과정을 촉진한다. 길경 추출물 자극 후 12시간에서 24시간에서 Atg3의 발현이 확연히 증가하였다가 48시간 될 무렵에는 오히려 발현이 감소하였는데 이는 LC3 I이 LC3 II로 변환되는 양상과 동일하게 진행되었다. 다음으로 LC3 단백질의 직접적인 축적을 관찰하기 위하여 면역형광법을 시행한 결과, 길경 추출물을 처리하지 않은 대조군에서는 LC3단백질이 세포질에 넓고 고르게 분포되어 있다가, 1 mg/ml의 길경 추출물을 24시간 처리한 후에 관찰한 세포군에서는 LC3의 단백질의 응축으로 결집되어 있는 범위가 좁아지면서 형광이 진해지는 것을 볼 수 있었다(Fig. 4C). 이 실험을 통해 길경 추출물은 HCT-116 대장암 세포주에서 초기부터 autophagy 를 뚜렷하게 일으킴을 알 수 있었다. 또한, autophagy가 세포에서 일어나는 일련의 진행되는 과정임을 감안해 볼 때, 길경 추출물에 의한 autophagy가 초기에 증가되었다가 후기로 갈수록 감소되는 것으로 보인다.

Fig. 4.Induction of autophagic formation by PG treatment on in HCT-116 cells. A) HCT-116 cells were incubated with PG 1 mg/ml for the indicated amounts of time. Morphologic changes with formation of autophagic vesicles were directly photographed (magnification, ×200). B) Western blots were detected with antibodies against autophagy related proteins. C) The punctate patterns of LC3 localization was analyzed 24 hr after PG by immunofluorescence microscopy (magnification ×50).

3-MA를 이용한 초기 autophagy 억제에 의한 apoptosis 유도 촉진

Autophagy의 조절이 항암 치료의 효과를 증진시키는데 큰 잠재력이 있기 때문에, 길경 추출물에 의도된 autophagy가 세포 보호적인 작용을 하는지 autophagic 세포사에 관계되어 있는지 알아보았다. 이를 위해서 autophagosome이 생성되기 전에 작용하는 autophagy 억제제인 3-MA [15]를 이용하여autophagy와 apoptosis의 상관관계를 알아보았다. Fig. 5A에 나타내었듯이, 3-MA 선처리 후 세포 성장 정도를 MTT assay 로 측정했을 때는 유의성 있는 변화가 없었지만, 세포주기의 sub-G1기 빈도를 측정하였을 때는 48시간 길경 추출물 처리군에서 sub-G1기가 2배 정도로 증가되었다(Fig. 5B). 또한, Fig. 5C에서 보듯이, 3-MA 처리에 의한 세포의 형태 변화에는 약간의 공포 감소를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 autophagy 단계의 초기 억제제인 3-MA 처리에 의해서 apoptosis 유도는 촉진되나 세포 성장에는 크게 영향을 미치지 못 함을 알 수 있었다.

Fig. 5.Promotion of PG-induced apoptosis by autophagy inhibition using 3-MA. A) MTT assay and B) flow cytometry anaylsis was performed in HCT116 cells treated with 1 mg/ml PG for 24 hr or 48 hr in the absence or presence of 3-MA (1 mM, pretreated for 1 hr. The data is reported as a mean ± S.D. of three independent experiments Columns represents the mean ±SD of three independent experiments (*, p<0.05 versus untreated control). C) Morphologic changes were directly photographed at the indicated times (magnification ×200).

Bafilomycin A1을 이용한 후기 autophagy 억제에 의한 apoptosis 유도 촉진

다음은 autophagosome이 라이소좀과 결합하여 autolysosome이 되는 것을 억제하는 bafilomycin A1을 처리하여 후기autophagy 과정을 억제하였을 때의 apoptosis 유도와 세포 성장에 관한 영향을 조사해 보았다. 이를 위하여 1 mg/ml의 길경 추출물을 노출시켰을 때, 1 nM의 bafilomycin A1보다 10 nM의 농도에서 세포 성장률이 2배 정도로 회복되었다(Fig. 6A). 또한 autophagy 억제가 apoptosis에 미치는 효과를 알아 보기 위해, 세포 주기를 측정한 결과 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도 증가가 확연하게 일어났다(Fig. 6B). 세포의 형태 변화에서도 길경 추출물에 의해서 뚜렷하게 보였던 공포가 bafilomycin A1에 처리에 의해서는 감소하면서 세포의 응축이 동반 되었다(Fig. 6C). 이러한 결과는 bafilomycin A1의 선처리로 autophagy의 후기 단계를 억제하였을 경우 apoptosis 유도를 증가시키나 길경 추출물에 의해 감소하였던 세포 성장 억제가 감소됨을 의미한다.

Fig. 6.Promotion of PG-induced apoptosis by autophagy inhibition using bafilomycin A1. A) Cell viability was determined by MTT assay and B) sub-G1 was checked by flow cytometry after treatment with different time of 1 mg/ml PG in the absence or presence of 1 or 10 nM bafilomycin A1 (Baf A1). The histogram is showed the mean ± SD from three independent experiments and are presented as fold change compared with vector control (*, p<0.05 versus untreated control). C) Morphologic changes were directly photographed at the indicated times (magnification ×200).

본 연구의 결과에서 길경 추출물의 처리는 HCT-116 대장암 세포의 증식을 억제하였으며 이는 apoptosis와 autophagy 유도와 연관성이 있음을 알 수 있었다. 단백질의 발현 변화 시간이나 세포의 형태적 변화 및 sub-G1기의 증가 시간 등을 감안하여 볼 때, 길경 추출물에 의한 두 가지의 세포예정사의 과정 중 autophagy가 조금 더 빨리 일어나는 것으로 보인다. 이는 autophagic cell death가 autophagy의 생존에서 두 가지 역할을 수행함에도 불구하고, 몇몇의 암세포에서 항암제 사용 시apoptosis보다 선행되어 나타난다는 다른 결과들과 상통한다 [2, 3]. 아울러 3-MA나 bafilomycin A1에 의한 autophagy 억 제 시 길경 추출물 처리에 의한 sub-G1기 세포 빈도가 2배정도로 뚜렷하게 증가되는 것으로 보아 길경 추출물에 의한 autophagy가 apoptosis를 억제하고 있는 것으로 볼 수 있다. 또한 bafilomycin A1 처리에 의한 결과를 보면 apoptosis는 증가 하나 세포의 성장 억제는 오히려 감소하여 길경 추출물에 의해 감소하였던 세포의 증식이 많이 회복됨을 보였는데, 이것은 HCT-116 대장암 세포주에서 길경 추출물에 의해 발생한 autophagy가 세포 보호적인 효과가 아닌 autophagic cell death를 일으키는 것으로 생각된다. 길경 추출물에 의해 발생하는 autophagy와 apoptosis에 대한 추가적인 기전 연구가 필요하겠지만 본 연구의 결과는 길경 추출물이 autophagy와 apoptosis를 동시에 유도함으로써 HCT-116 대장암 세포의 증식을 억제 시킬 수 있다는 것을 보여준다. 따라서 이 결과는 길경 추출물의 새로운 항암제로써의 가능성을 보인 기초적인 증거로써 활용될 수 있을 것으로 사료된다.