Anti-Oxidative and Anti-Obesity Effects of Amomum Cardamomum L. Extract

백두구 추출물의 항산화 및 항비만 효과

Abstract

In this study, the anti-oxidative and anti-obesity activities of Amomum cardamomum L. methanol extract (ACME) were evaluated using DPPH radical scavenging activity assay, pancreatic lipase enzyme inhibition assay, and the cell culture model system. ACME exhibited DPPH radical scavenging activities dose-dependently, with $IC_{50}$ of DPPH radical scavenging activities of ACME being $25.15{\mu}g/ml$. Furthermore, ACME effectively suppressed pancreatic lipase enzyme activity dose-dependently. ACME also significantly suppressed adipocyte differentiation, lipid accumulation, triglyceride (TG) contents, and triggered lipolysis activity on 3T3-L1 preadipocytes in a dose-dependent manner, without cytotoxicity. Their anti-obesity effect was modulated by the cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymidine (CCAAT)/enhancer binding proteins ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), $C/EBP{\beta}$ and the peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$) gene and protein expressions. Taken together, these results provide an important new insight that A. cardamomum L. possesses anti-oxidative and anti-obesity activities such as pancreatic lipase inhibition, anti-adipogenic, and lipolysis effects. There is therefore potential for its use as a promising component in the field of nutraceuticals and the identification of the active compounds that confer the anti-oxidative and anti-obesity activities of ACME might be an appropriate next step.

본 연구에서는 백두구(A. cardamomum L.) 메탄올 추출물(ACME)의 항산화 및 항비만 활성을 DPPH radical 소거능과 췌장 lipase 효소 활성 억제능, 그리고 세포실험계를 이용하여 분석하였다. 그 결과 ACME는 DPPH radical을 농도 의존적으로 소거하였으며 DPPH radical 소거능의 50% 저해농도($IC_{50}$)는 $25.15{\mu}g/ml$로 나타났다. 또한 ACME는 농도 의존적으로 lipase 효소 활성을 유의적으로 억제시켰으며, 3T3-L1 preadipocyte를 이용하여 지방세포 분화 및 지방생성, 생성된 지방의 분해에 미치는 영향을 분석한 결과 ACME는 지방세포 분화, 세포 내 지방 축적, TG 함량 등을 독성 없이 농도의존적으로 억제하였으며 지방세포 내 중성지방을 유의적으로 분해시키는 것으로 나타났다. 이러한 백두구의 지방세포 분화 억제능은 핵심 작용 인자인 $C/EBP{\alpha}$, $C/EBP{\beta}$, 그리고 $PPAR{\gamma}$의 유전자 및 단백질 발현조절에서 기인함을 확인하였다. 이러한 결과는 백두구가 보유한 항산화능과 췌장 lipase 활성 저해능, 지방세포 분화 억제능, 지방세포 내 지방 분해능을 통한 항비만 활성을 처음으로 밝혀낸 것이며 추후 계속적인 연구를 통해 활성 물질의 규명이 필요할 것으로 판단된다.

서 론

비만은 신체 에너지 소비량보다 과잉으로 에너지를 섭취하였을 때 점차적으로 체지방이 피하조직이나, 장간막에 축적되어 체중이 증가하는 상태로 유전적, 영양적, 환경적 및 사회적 요인 등 다양한 원인들이 관여하는 복합증후군이다[7]. 비만의 발생 원인으로는 과도한 식이섭취, 신체활동 부족, 그릇된 생활 습관, 내분비 기능 이상 질환 및 유전적인 소인 등이 있으며 비정상적인 지방세포의 크기 및 숫자 증가로 지방축적을 일으키게 된다[3, 15]. 이는 adipokine의 생산과 분비를 통하여 adipogenesis 과정으로 분화가 일어나게 하며 지방세포의 크기 증가(hypertrophy)와 숫자 증가(hyperplasia)는 비만뿐만 아니라 염증, 당뇨 등 만성대사 질환에 영향을 미치게 된다[2, 8, 14, 23]. 따라서, 체중 감소를 위해서는 운동, 식이요법, 약물투여, 외과적 수술 등의 방법이 수행되고 있으며 이중 식이요법은 비만의 예방과 치료에 가장 근본적이며, 중요한 방법이다[16].

비만은 지방전구세포의 분화 및 지방생성과정에 의하여 지방세포의 세포 내 중성지방(triglyceride, TG)의 축적으로 발생하므로 이러한 지방생성기전을 조절하는 것이 비만 억제의 효과적인 치료 방법으로 알려져 있다[4, 5]. 잘 알려진 대표적인 비만 치료제인 orlistat의 경우 췌장 및 위장에서 분비되는 지방 분해 효소인 lipase의 활성을 억제하여 섭취한 지방 중 약 30%의 흡수를 차단 함으로서 체중의 감소에 도움을 주는 것으로 알려져 있다[13]. 이에 최근 천연물을 이용한 유용 비만 소재 개발의 많은 연구가 천연 유래 lipase 활성 저해제로서의 작용 가능성 탐색에 초점을 맞추고 있다.

지방세포의 분화는 세포 형태 및 유전자 발현의 다양한 변화가 동반되는 복합적인 과정을 통하여 일어나게 된다. 지방세포는 몸에 필요한 에너지를 축적하여, 필요시 중성지방을 분해시켜 이용한다. 하지만 최근 연구에 의하여 지방조직은 에너지 축적의 기능뿐만 아니라, 내분비 기관으로 지방대사, 당 대사를 포함한 체내 에너지대사를 조절하는 기능을 수행하는 역할을 하는 것으로도 알려져 있다[9, 11, 17]. 지방세포는 mesenchymal precursor에서 preadipocyte를 거쳐 지방세포로 분화되며, 분화과정 동안 형태적, 생화학적 변화를 통하여 체내 지방을 축적하며, 지방 조직은 크기의 증가, 새로운 preadipocyte로부터 분화되고 이는 지방 조직세포에 특징적으로 발현되는 유전자들의 조절부위에 작용하는 transcription factor들이 지방세포로 분화되는 과정에서 발현된다[10].

3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화될 때 cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymidine (CCAAT)/enhancer binding protein의 종류인 C/EBPβ, C/EBPδ가 insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)와 같은 호르몬 자극으로부터 초기 분화가 시작되며 이는 상호 작용 또는 단독으로 peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) 및 C/EBPα의 발현을 조절하게 된다[4, 6, 21, 22, 27-30]. C/EPBα는 PPARγ와 분화 초기에 발현이 유도되어 분화 후기가 되면 다양한 adipogenic 유전자들의 발현을 유도하여, 분화된 지방세포에서 발현 양이 현저하게 증가되는 양상을 나타낸다[19, 23, 24].

한편 전 세계적으로 비만 치료제의 개발을 위한 다양한 연구가 수행되고 있는 가운데 현재 시판되고 있는 비만 치료제들의 부작용들이 보고되면서 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 일고 있어 우수한 효능과 함께 안전성이 높은 물질의 개발이 요구되고 있다. 이에 특히 천연 유래 소재로부터 독성 및 부작용이 없는 항비만 효능 보유 소재를 발굴하기 위한 많은 노력이 집중되고 있다[12, 16, 19, 22].

백두구(Amomum cardamomum L.)는 생강과에 속하는 다년생 초본인 백두구와 자바백두구의 과실을 지칭하는 것으로, 다골(多骨), 백구(白寇), 각박(殼泊)이라고도 불리며 주로 성숙한 과실의 과피를 제거한 것을 백두구라고 한다. 백두구의 과실은 길이 1-2 cm, 지름 5-10 mm 크기로 거의 원구형을 이루고 있으며 바깥면은 엷은 황백색 내지 황갈색이고 3줄의 둔한 능과 여러 개의 세로줄이 있으며, 윗쪽은 움푹 들어갔고 아랫쪽은 과병이 붙었던 흔적이 있다. 가을에 황녹색을 띤 성숙한 과실을 채취하여 과병과 과피를 제거하고 햇빛에 말려 사용한다. 백두구는 캄보디아, 베트남, 태국이 주산지이며, 자바백두구는 인도네시아가 주산지이나, 상기 2종 모두 중국의 남부지방에서 재배한다. 소화기계 질환에 자주 쓰이며, 몸안의 습을 없애고 몸을 따뜻하게 하여 기를 잘 통하게 하고 구토를 멈추는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 위액분비를 촉진하고 위장의 운동을 강화하여 장내 이상발효를 억제하고 가스를 잘 나가게 하여 입맛을 돋구고 소화불량 및 식적 등을 없앤다. 만성위염으로 인한 위통이나 트림, 구토 등의 증상에 좋으며, 술독을 제거하는 작용이 있다. 보고된 생리활성으로는 항암[1, 20] 및 항산화[18] 효과 등이 있으나 백두구의 항비만 활성에 대해서는 보고된 바 없다.

이에 본 연구에서는 한방에서 약재로 사용되고 있는 백두구 추출물의 항비만 효과 및 그 기전을 알아보고 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인해 보고자 하였다.

 

재료 및 방법

백두구 추출물의 제조

실험에 사용한 백두구는 부산광역시 소재 ㈜대한생약제품에서 구입하여 사용하였다. 백두구 10 g을 측량하여 분말로 파쇄한 후 시료 부피 5배의 methanol (MeOH)을 가하여 75°C에서 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 감압농축기(N-1000S-W, EYELA, Japan)로 농축하고 동결 건조(FDU2100, EYELA, Japan)한 후 중량법으로 각각의 수율을 계산하였다.

DPPH radical 소거 활성 측정을 통한 백두구 추출물의 항산화능 분석

전자공여작용은 인체 내에서 생성되는 free radical의 전자를 공여하여 free radical에 의한 노화와 질병을 억제한다. 따라서 전자공여능은 항산화작용의 지표로서 사용되고 있으며 특히 식물 추출물의 항산화능 측정에 많이 사용되고 있다. 이러한 전자공여능은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) radical 소거능 분석을 이용하여 측정하였다. DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 식물체의 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있는 방법이다[15].

백두구 추출물을 농도별(12.8-1,600 μg/ml)로 MeOH에 녹여 준비한 후, 96 well plate에 MeOH에 용해된 1.5 × 10−4 M DPPH 40 μl와 각 시료 160 μl를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시키고, multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 처리 농도별 free radical 소거 정도를 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(Inhibitory Concentration, IC50)를 계산하였다. 대표적인 항산화제로 DPPH radical 소거 활성 측정 시 양성 대조군으로 주로 사용되는 ascorbic acid를 함께 비교 분석하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.

백두구 추출물의 pancreatic lipase 효소 활성 저해능 분석

Lipase는 주로 췌장에서 분비되어 TG를 glycerol과 fatty acid로 가수분해하는 효소로서 지방소화효소인 pancreatic lipase의 활성 저해능은 시료가 보유한 항비만 활성을 예측하기에 매우 유용한 시험법이다[9]. 본 연구에서는 백두구의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 시료가 보유한 lipase 효소 활성 저해능을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 1.5 ml tube에 0.25 M Tris (pH 7.7), 250 mM CaCl2, 5 mM 4-nitrophenyl dodecanoate (PNPD)로 구성된 효소액과 기질을 넣고 잘 섞어준 후 37°C에서 5분간 예열하고, 0.25 M Tris (pH 7.7)에 녹인 lipase와 시료를 넣어 37°C에서 10분간 반응시킨 후 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응액을 4°C, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여, 분리한 상층액을 96-well tissue culture plate에 분주하고 multi-plate reader를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정한 후, 10분간 반응시킨 시료의 흡광도로부터 0분 반응 시료의 흡광도를 뺀 값을 control 대비 백분율로 나타내었다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.

세포 배양 및 시료 처리

백두구의 항비만 활성을 세포실험계에서 분석하기 위해 항비만 활성 분석에 사용되는 대표적인 cell model system인 3T3-L1 preadipocyte를 American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA)로부터 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone (DEX), 10 μg/ml의 insulin (이하 MDI)를 처리하여 adipogenesis를 유도하고 백두구 추출물에 의한 항비만 활성을 분석하였다[25].

세포 독성 유무 분석

항비만 활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인함과 동시에 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 water soluble tetrazolium (WST) assay를 수행하였다. 1 × 105 cell을 24-well tissue culture plate에 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 후 multi-plate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.

Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석

3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화는 상기의 MDI를 처리하여 유도하였다. 12-well tissue culture plate에 well 당 2 × 105개의 세포를 분주하고 2일 후 10% FBS가 든 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도 별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 insulin과 시료를 처리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 경과 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화 정도 및 시료에 의한 분화 억제 정도를 200배 배율로 관찰하여 촬영한 후, 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 Oil Red O staining을 통해 분석하였다. 지방세포 분화 및 시료 처리가 완료된 세포를 1× phosphate buffered saline (PBS)로 씻어준 다음 10% formalin으로 고정하고 Oil Red O staining solution을 처리한 후 30분간 염색하였다. 염색 완료 후 100% isopropanol을 사용하여 염색된 지방을 추출하고 multi-plate reader를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통한 지방세포 분화 관련 유전자 발현 조절능 분석

백두구가 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 6-well tissue culture plate에 3 × 105개의 세포를 분주하고 지방 생성 억제능 분석과 동일한 방법으로 시료를 처리한 후 RNA를 분리하여 각 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 완료된 배양 세포의 total RNA를 TRIzol® (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 추출한 후 NanoVue plus spectrophotometer (GE healthcare, WI, USA)를 이용하여 정량하고 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 분석의 internal control로는 housekeeping gene인 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였으며 실험에 사용한 대상 유전자의 염기서열은 Table 1에 제시한 바와 같다.

Table 1.Primer sequences used for RT-PCR.

Western blot hybridization을 통한 지방세포 분화 관련 단백질 발현 조절능 분석

상기의 RT-PCR 분석에서와 같은 방법으로 실험을 수행한 후 시료 처리가 끝난 세포에서 단백질을 분리하여 지방 생성 관련 단백질의 발현 변화를 Western blot hybridization으로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 cell lysate를 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 일차 항체와 hybridization하였다. 실험에 사용한 C/EBPα와 C/EBPβ의 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하였고, PPARγ 및 actin의 일차 항체와 horse radish peroxidase가 부착된 anti-goat, anti-rabbit, anti-mouse등의 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Membrane 수세 후 이차 항체로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 분석하였다.

지방세포내 중성지방 제거량 측정(lipolysis assay)

백두구가 보유한 지방세포 내 중성지방 제거능(lipolysis activity)은 아래와 같이 수행하였다. Confluence 상태의 3T3-L1 지방전구세포를 2일간 배양한 다음 MDI를 첨가한 DMEM 배지로 2일간 배양하고 10 μg/ml이 든 DMEM 배지에 4일간 추가 배양하였다. 이러한 과정을 통해 지방세포 분화가 완료된 3T3-L1 cell에서 백두구 추출물을 농도별로 처리한 다음 48시간 후 중성지방 분해에 의해 배지에 방출된 glycerol 양을 glycerol-3-phosphateoxidase (GPO)-TRINDER kit (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.

통계 분석

각 실험의 결과는 평균(mean) ±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었고, 각 데이터의 통계 분석은 unpaired Student’s t-test를 통해 p 값이 0.05 미만(p < 0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

 

결과 및 고찰

백두구 추출물의 pancreatic lipase 활성 억제능 분석

백두구의 lipase 활성 억제능 보유 유무를 알아보기 위해 각 추출물의 농도별 처리에 따른 lipase의 활성 변화를 분석하였다. 그 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/ml의 처리에 의해 시료 비처리 대조군 대비 백두구 추출물은 84.2, 65.3, 59.0, 53.1, 44.7, 25.5%의 lipase 활성을 나타내며 lipase의 활성을 농도의존적으로 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 백두구가 lipase inhibitor로 작용하여 항비만 활성을 보유할 가능성을 시사하였다.

Fig. 1.Lipase enzyme inhibition activity of ACME. The effects of ACME on pancreatic lipase activity. Values are represented as the mean ± SD (n = 3) *p < 0.01 vs vehicle control (0).

백두구 추출물이 3T3-L1 preadipocyte의 세포 생존율에 미치는 영향

시료의 지방 생성 억제능의 평가를 위해 먼저 백두구 추출물이 3T3-L1 preadipocyte의 세포 생존율에 미치는 영향을 WST assay를 이용하여 분석하였다. 그 결과 Fig. 2A에서 제시된 바와 같이 50-500 μg/ml의 시료처리에서 세포독성을 전혀 유발하지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 백두구가 세포독성을 유발하지 않는 낮은 독성의 안전성이 높은 소재임을 의미한다. 이에 백두구 추출물의 지방 생성 억제능의 분석을 독성이 없는 것으로 확인된 농도 범위에서 수행하였다.

Fig. 2.Effect of ACME on 3T3-L1 cell proliferation (A), morphological change and lipid accumulation (B), and TG contents (C). (A) Cells were treated with the indicated concentrations of ACME for 72 h and viability was determined by WST assay. Data are expressed as the mean ± SD of triplicate experiments. (B) Differentiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was initiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 5% FBS in presence and absence of ACME. After day 8, cells were fixed and stained with Oil red O. The morphological change and lipid droplet accumulation were visualized using by inverted microscopy (×200). (C) TG contents were determined by Oil red O staining after treatment of ACME. TG contents was measured at 500 nm by multi-plate reader. Data are expressed as the mean ± SD of triplicate experiments. *, #Significantly different from the undifferentiated cell control (Con) and untreated cell control (0), respectively (p < 0.05).

백두구 추출물이 MDI로 유도한 3T3-L1 preadipocyte의 adipogenesis에 미치는 영향

백두구 추출물의 항비만 활성 보유 유무를 알아보기 위해 MDI로 분화를 유도한 3T3-L1 preadipocyte의 adipogenesis에 백두구 추출물이 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 Fig. 2B와 2C에서 제시된 바와 같이 농도의존적인 지방세포 분화 억제능이 관찰되었고 특히 200 μg/ml에서 강한 활성을 보여 Oil Red O staining 결과 염색된 지방의 수가 급격히 감소됨을 확인할 수 있었다. 지방 생성의 억제 정도를 정량적으로 평가하기 위해 염색된 지방을 추출하여 TG 생성량의 정도를 측정한 결과 50에서 200 μg/ml의 시료 처리 범위에서 농도의존적으로 감소됨을 보여 200 μg/ml의 처리에 의한 억제능이 33%로 나타났다.

백두구 추출물이 adipogenesis 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향

지방전구세포가 지방세포로 분화되는 adipogenesis의 과정에는 초기, 중기, 후기의 각 단계별로 중요한 분화 조절자들이 관여한다. MDI 처리 초기에는 가장 먼저 c-fos, c-jun, c-myc 등의 유전자 발현이 증가하며 이와 함께 C/EBPβ와 δ의 발현 또한 유도된다. C/EBPβ와 δ는 preadipocyte가 MDI 등의 분화 인자에 노출되었을 때 분화 초기에 가장 먼저 작용하는 전사 인자(transcription factor)로 MDI의 경우 C/EBPβ는 DEX에, C/EBPδ는 IBMX에 의해 활성이 유도되는 것으로 알려져 있다. 이러한 C/EBPβ와 δ의 활성은 분화 중기 및 후기에서 작용하는 PPARγ와 C/EBPα의 발현 매개인자로서, 활성화된 PPARγ와 C/EBPα는 단독 혹은 상호작용을 통해 지방세포 특이적 유전자의 발현(adipocyte specific gene expression)을 유도하여 지방 세포 분화 및 지방 형성을 완성한다[15]. 따라서 이와 같은 지방 세포 분화에 관여하는 주요 인자들의 발현 조절 유무는 소재가 보유한 지방 생성 억제능 및 그 작용 기전을 판단하는 주요 지표 중 하나이다.

본 연구에서는 백두구가 보유한 지방 생성 억제능의 작용기전을 알아보기 위하여 백두구 추출물이 adipogenesis에 관여하는 주요 핵심 조절자인 C/EBPα, C/EBPβ, 그리고 PPARγ의 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 Fig. 3에 제시된 바와 같이 MDI 처리에 의해 지방세포 분화가 일어난 대조군에서는 세 인자의 유전자 및 단백질 발현이 유의적으로 증가되었으며 추출물의 처리에 의해 농도의존적인 감소를 보였으나 그 정도 및 양상은 각 인자에 따라 차이를 보였다. 먼저 C/EBPα의 경우 유전자 발현은 50 μg/ml의 처리에서부터 농도의존적으로 억제되어 200 μg/ml에서는 미분화 대조군과 유사한 정도의 낮은 발현을 보였다. 이는 단백질 발현에서도 유사한 양상을 보여 200 μg/ml의 처리에서 단백질 발현 또한 미분화 대조군과 유사한 정도로 억제되었다. C/EBPβ의 경우, 유전자 발현의 억제 정도는 낮았으나 단백질 발현에서 농도의 증가에 따른 발현 저해가 관찰되었다. 한편 PPARγ의 경우 유전자 발현은 모든 시료 처리군에서 급격한 감소를 보여 50 μg/ml에서부터 미분화 대조군과 유사한 정도로 억제됨을 보였으나 단백질 발현은 큰 변화를 보이지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 백두구 추출물이 보유한 지방세포분화 억제능이 adipogenesis에 관여하는 핵심 인자의 유전자 및 단백질 발현 저해를 통해 나타나며 그 중에서도 특히 세 인자 중 가장 늦은 시점에 발현되어 지방세포분화 조절자로서 작용하는 C/EBPα의 발현 조절을 통해 나타나는 것으로 판단된다. 한편, 백두구에 의한 세 인자의 유전자와 단백질 발현 양상이 일부 차이를 나타내는데 이는 통상적으로 유전자와 단백질의 발현 양상이 유사한 형태를 보이기는 하나 항상 일치하는 것은 아니며 또한 유전자의 발현 및 활성 시간과 단백질 발현이 유도되는 시점의 차이에서 기인할 가능성을 시사한다[26].

Fig. 3.Effect of ACME on adipogenesis related gene and protein expressions. (A) Modulation of adipogenic transcription factors by ACME was evaluated by RT-PCR. GAPDH was used as an internal control. (B) Modulation of adipogenesis related protein expressions by ACME was evaluated by Western blot analysis. Actin was used as an internal control. The data are representative of three independent experiments.

백두구 추출물의 중성지방 제거능(lipolysis activity)

백두구가 지방세포분화를 억제할 뿐만 아니라 생성된 지방의 제거에도 효과적인지를 판단하기 위해 지방세포 내 중성지방 제거능을 lipolysis activity를 통해 분석하였다. 그 결과 Fig. 4에 제시한 바와 같이 MDI로 분화시킨 지방세포에 백두구 추출물을 처리한 결과 세포 내 축적되어 있던 중성지방의 분해를 통해 배지로 방출된 glycerol의 양이 농도의존적으로 증가되는 것으로 나타났다. 배지를 제거한 후 Oil Red O staining을 수행한 후 현미경 관찰 및 남아있는 TG 양을 측정한 결과 방출된 glycerol의 양과 비례적으로 세포내에 남아있는 TG의 양이 감소되는 것으로 나타나 백두구 추출물이 지방세포 내에 축적되어 있는 중성지방을 농도의존적으로 제거하는 것을 확인하였다.

Fig. 4.Stimulatory effect of ACME on glycerol release in MDI-induced 3T3-L1 adipocytes (A), morphological change and lipid accumulation (B), and TG contents (C). (A) Amount of released glycerol in culture media was measured after ACME treatment. Glycerol contents were measured 540 nm by multi-plate reader. (B) Differentiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was initiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 5% FBS. After day 8, MDI-induced adipocytes were treated with ACME for 48 h. Cells were fixed and stained with Oil red O. The morphological change and lipid droplet accumulation was visualized using by inverted microscopy (×200). (C) TG contents were determined by Oil red O staining after treatment of ACME. TG contents was measured at 500 nm by multi-plate reader. Data are expressed as the mean ± SD of triplicate experiments. *,#Significantly different from the undifferentiated cell control (Con) and untreated cell control (0), respectively (p < 0.05).

이러한 결과를 통해 백두구 추출물이 높은 항산화능을 보유함과 동시에 lipase 효소활성 억제능, 지방세포 분화 억제능, 지방세포 내 중성지방 제거능을 통한 항비만 활성을 보유함을 확인하였다. 이러한 결과는 백두구 추출물의 항비만 활성을 처음으로 밝혀낸 것으로 그 의미가 크다. 백두구의 주요 성분으로 α-borneol, α-camphor, α-numulene, numulene epoxide, 1.8-cineol, α-terpinene, β-terpinene, α-pinene, β-pinene, caryophyllene, myrcenal, carvone, terpinele-4-o, sabinene 등의 정유, 방향 성분이 알려지고 있으나 이에 대한 구체적인 문헌 및 연구 결과는 알려진 것이 없으며 상기에 제시한 단일 물질의 항비만 활성 또한 규명된 바는 없다. 다만 앞서 언급한 백두구의 항암[1], 항염증[18], 면역 조절[20] 등의 활성 성분이 대부분 정유, 방향 성분임을 감안할 때, 항비만 활성의 주요 성분 또한 유사할 것으로 생각된다. 추후 계속적인 연구를 통해 백두구가 보유한 항비만 활성 물질의 규명이 필요할 것으로 판단된다.