Optimization of Pretreatment of Persimmon Peel for Ethanol Production by Yeast Fermentation

효모를 이용한 에탄올 생산을 위한 감껍질 전처리조건의 최적화

Abstract

A response surface method based on a central composite design experiment was used to determine the optimum conditions for pretreatment of persimmon peel. It was mathematically predicted that the maximum amount of reducing sugars would be obtained at an $H_2SO_4$ concentration of 1.77% (w/v) and a heat treatment time of 26.4 min. A reducing sugar concentration of 63.23 g/l was obtained under the optimum pretreatment conditions determined by RSM. Under anaerobic growth conditions, Saccharomyces cerevisiae NK28 produced 15.52 g/l of ethanol with a yield of 0.34 g ethanol/g glucose from pretreated persimmon peel, which corresponded to 14% and 26% enhancements in ethanol productivity and ethanol yield, respectively, compared with those obtained in aerobic growth conditions. This study suggests that persimmon peel might be a useful substrate for bioethanol production by yeast fermentation.

본 연구에서는 감가공 과정에서 매년 막대한 양으로 발생하는 감껍질을 이용하여 에탄올을 생산하기 위하여 묽은 황산으로 감껍질을 전처리하는 조건을 중심합성계획법과 반응표면분석법을 통하여 최적화하였다. 감껍질의 최적 전처리 조건은 황산농도 1.77%와 열처리 시간 26.4분이었으며 RSM 모델에서 예측한 수준과 비슷한 수율로 환원당을 생성하였다. 감껍질 전처리물을 이용한 효모발효에서 혐기적 배양조건에서 15.52 g/l의 에탄올이 생산되는 것을 확인하였다. 본 연구를 통하여 매년 막대한 양으로 발생하는 감껍질을 활용하는 방안 중의 하나로써 효모를 이용한 에탄올 생산의 가능성을 제시하였다.

재료 및 방법

실험재료

감껍질은 경상북도 청도의 감 고부가가치화 클러스터 사업단에서 제공받은 2012년산 감껍질을 실험실용 건조기(JSR, Korea)를 이용하여 65°C에서 48시간 동안 건조하여 분쇄기(HMF-3000S, Hanil, Korea)로 분쇄한 후 –20°C에 보관하였다.

전처리 방법

분쇄한 감껍질은 농도별로 제조한 황산용액(1.4, 1.5, 1.75, 2.0, 2.1% (w/v))과 10% (v/v) 비율로 혼합하여 실온에서 1시간 동안 침지한 후 121°C에서 열처리하였다[27]. 전처리된 시료는 상온으로 냉각시킨 후, 원심분리(16,000 ×g, 10 min)하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 CaCO3를 사용하여 pH 5.5로 중화시킨 후 원심분리(16,000 ×g, 10 min)하여 상등액을 회수한 후 멸균된 여과지(0.45 μm, Advantec, USA)로 여과하여 –20°C에 보관하였다.

실험설계

감껍질의 전처리조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 이용하였다[21]. 전처리 조건은 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD) [31]을 이용하여 황산농도(0.5-3.0% (w/v))와 열처리시간(15-30분)의 범위를 설정하였다. 독립변수로서 황산농도(X1, %) 및 가열처리 시간(X2, min)을 설정하고 종속변수는 전처리 후 생성된 환원당의 농도(YR, g/l)로 지정하여 실험을 설계하였으며 Table 1에 나타냈다. 실험 결과의 분석은 Design Expert 8.0 (stat-Ease, USA)를 사용하였다.

Table 1.Code and level of variables used for central composite design of pretreatment.

분석방법

본 연구에 사용된 효모는 키위로부터 분리한 S. cerevisiae NK28 [15]이며, 균체 성장속도는 흡광광도계(GE Healthcare, Sweden)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.

전처리를 통하여 생성된 환원당의 정량은 DNS(3, 5-dinitrosalicylic acid)법[23]을 사용하였다. 전처리 된 감껍질에 함유된 당류의 정성분석은 Bio-LC(HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 이용하여 분석하였다. CarboPacTM PA1 (Dionex) 컬럼을 사용하였으며, 이동상으로는 18 mM NaOH를 1.0 ml/min의 유속으로 사용하였다. 전처리 된 감껍질에 함유된 발효 저해제 중 furfural, 5-Hydroxymethylfurfural 및 acetic acid의 분석은 HPLC (Shimadzu, Japan)를 사용하였으며 Rezex ROA-Organic Acid H+ (Phenomenex, USA) 컬럼 및 0.6 ml/min 유속의 0.005 N 황산용액을 이동상으로 사용하였다.

발효조건

S. cerevisiae NK28은 5 ml의 YEPD (yeast extract 1% (w/v), peptone 2% (w/v), glucose 2% (w/v))에 접종하여 35°C에서 12시간 동안 배양한 후, 전처리 과정에서 생산되는 저해제들이 효모의 성장에 영향을 미치는 것을 고려하여 전처리물에서 12시간 동안 전배양하였다. 100 ml의 감껍질 전처리물(총환원당 63.23 g/l, pH 5.5, Table 3)이 포함된 500 ml의 플라스크에 초기 세포흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 접종하여 35°C에서 96시간 동안 배양하였다. 호기적 배양은 진탕배양기의 교반속도를 200 rpm으로 유지하였으며, 혐기적 조건은 100 ml 배지에 oxyrase(Bioworld, USA) 1 ml을 첨가하고 스크류 타입의 마개를 이용하여 플라스크를 밀봉한 후 진탕배양기에서 배양하였다.

 

결과 및 고찰

반응표면분석법을 이용한 감껍질 전처리 최적화

중심합성 계획법에 따라 Table 1과 같은 각 독립변수의 범위를 설정한 후, Design Expert를 이용하여 Table 2와 같이 13가지의 전처리 조건을 설정하고 감껍질을 전처리하였다. 황산농도(X1)와 가열처리시간(X2)을 독립변수로 설정하고 종속변수(환원당 생성량, Yp)에 대한 회귀방정식을 얻어 전처리조건에서 독립변수의 상호영향 및 최적 전처리조건을 구하였다. 중심합성 계획에 따라 얻은 13개의 실험값을 이용하여 아래와 같은 식을 구하였다

Table 2.Central composite design for optimization of persimmon peel pretreatment using response surface method.

전처리 조건에 대한 contour map 및 반응표면은 Fig. 1에 나타내었으며 환원당 생성량에 대한 식 (1)의 결정계수(R2)는 0.98로 황산농도와 가열처리시간에 따라 환원당 생성량이 증가하였으며, 황산농도보다는 가열처리시간이 환원당 생성에 영향을 상대적으로 크게 미치는 것으로 나타났다(Fig. 1). 최대 환원당 생성량은 63.05 g/l로 예측되었으며, 이때 전처리조건은 황산농도 1.77% 및 가열처리시간 26.4분이었다. 최적의 조건으로 예측된 전처리조건에서 감껍질을 전처리한 결과 약 63.23 g/l의 환원당이 생성되는 것을 확인하였다. 전처리물에 포함된 주요 당함량은 Table 3에 나타냈으며 glucose, xylose 및 fructose가 전체 환원당 중 약 89%에 해당하였다.

Fig. 1.Contour (A) and response surface (B) plots showing the influences of sulfuric acid concentration and pretreatment time on reducing sugar formation from persimmon peel.

Table 3.*Data were obtained from persimmon peel which was pretreated with 1.77% sulfuric acid at 121°C for 26.4 min.

바이오매스를 산과 열을 이용하여 전처리 하면 환원당 외에도 5-HMF, furfural 등의 발효 저해제가 생산된다[6, 12]. Furfural의 경우 1 g/l 이상을 포함하고 있을 경우 에탄올 발효에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며[6, 13], acetic acid는 5 g/l 이상을 포함할 경우 에탄올 발효를 저해하는 것으로 알려져 있다[25]. 묽은 황산을 이용한 감껍질의 전처리 과정에서 생산되는 발효 저해제는 furfural (0.22 ± 0.02 g/l), 5-HMF (0.04 ± 0.01 g/l) 및 acetic acid (2.89 ± 0.04 g/l)가 검출되어 에탄올 생산을 위한 효모의 성장에 크게 영향을 미치지 않을 것으로 판단되었다.

효모발효를 통한 에탄올 생산

반응표면분석법을 통하여 설정한 전처리조건을 이용하여 감 껍질 전처리물을 제작하여 에탄올 생산을 위한 배지로 사용하였다. 감껍질 전처리물 100 ml에 S. cerevisiae NK28을 접종한 후 호기 및 혐기조건에서 균체 성장속도, 환원당 소모량 및 에탄올 생산속도를 측정하였다(Fig. 2). 호기적 배양에서 S. cerevisiae NK28은 49.1 g/l의 환원당을 소모하였으며, 약 13.3 g/l의 에탄올을 생산하였다(Fig. 2A). 에탄올 생산성은 0.14 ± 0.01 g/l·h이었으며, 수율은 0.27 ± 0.01 g/g 로 나타났다. 혐기배양에서는 환원당을 약 45.26 g/l를 소모하여 15.52 ± 0.36 g/l의 에탄올이 생산되었으며, 에탄올 생산성은 0.16 ± 0.01 g/l·h로 호기배양보다 생산성이 약 14% 증가하였다. 혐기적 배양에서는 호기적 배양보다 환원당의 소모량이 감소하였고, 에탄올 수율은 0.34 ± 0.01 g/g 로 호기적 배양보다 약 26% 증가하였다(Fig. 2B).

Fig. 2.Profiles of cell growth (▲), ethanol production (●), and reducing sugar consumption (◆) of S. cerevisiae NK28 grown in sulfuric acid-pretreated persimmon peel. Averages and standard errors were obtained from three independent aerobic (A) and anaerobic (B) cultivations.