Analysis and Stability Test of the Extracts from Epimedii Herba, Atractylodis Rhizoma Alba and Polygalae Radix for Toxicity Study

음양곽, 백출 및 원지의 독성평가를 위한 성분분석 및 안정성 시험

Abstract

A simple and reliable reverse phase HPLC method was developed to determine pharmacologically active marker compounds of Epimedii Herba, Atractylodis Rhizoma Alba, and Polygalae Radix. The stability test of water-extracts of the three natural medicines has been evaluated for six months. However, no significant changes in the content of the marker compounds of each extract were observed during the time of investigation.

재료 및 방법

실험재료 −본 연구에 사용한 3종의 음양곽, 백출 및 원지는 유통되는 생약을 기원별, 산지별로 구입하여 기원, 성상, 색상, 냄새 등을 기준으로 생약감별 자문위원회(동국대학교, 이제현 교수; 영남대학교, 이승호 교수; 경북대학교, 김정아 교수; 계명대학교, 정길생 교수; 대구가톨릭대학교, 민병선 교수)의 감별을 거쳐 선별하였고 선정된 시료는 대구가톨릭대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다(음양곽, CUD-1484-1; 백출, CUD-3064-1; 원지, CUD-2025-1). 음양곽(Epimedii Herba), 백출(Atractylodis Rhizoma Alba) 및 원지(Polygalae Radix)는 모두 중국산을 사용하였다. 각 생약은 식품의약품안전청 고시 2003-17, 안전성 유효성심사규정에 준한 표준탕제 제조법에 따라 열수추출하고 이를 농축한 후 동결 건조하여 사용하였다.31)

시약 및 기기 − Icariin, atractylenolide Ⅲ 및 tenuifolin은 한국한방진흥원 천연물물질은행에서 제공받아 사용하였다. HPLC system은 Waters사 binary pump controller Waters 1525, 717 auto-sampler, dual λ absorbance detector Waters 2478를 사용하였으며, column은 Agilent Technologies사의 Agilent Eclipse XD8-C18(5 μm, 4.6×150 mm)를 사용하였다. HPLC 용매는 Burdick & Jackson사의 MeOH 및 acetonitrile을 사용하였고, H2O는 Milli-Q로 처리한 물을 사용하였다.

표준액 조제 − Icariin, atractylenolide Ⅲ 및 tenuifolin의 표준품을 정확하게 측정한 후 70% MeOH로 1 mg/mL 농도로 녹여 4℃에 보관하고 사용 전에 희석하여 표준액으로 사용하였다. 분석용 표준액은 membrane filter로 여과한 후 사용하였다.

검액의 조제 − 음양곽 40 kg, 백출 20 kg, 원지 40 kg을 추출 탱크에 넣고, 물을 시료의 10배로 첨가하여 100℃에서 2시간 전탕한 후, 농축 동결 건조하여 각각 6.8, 9.6, 8.4 kg의 물 추출물을 얻었다. 추출물 100 mg을 정확히 측정한 후 70% MeOH 10 mL을 넣고 sonicator로 60분 추출한 후 membrane filter로 여과하여 검액으로 사용하였다.

지표물질 정량 −문헌 등의 자료 및 HPLC 분석 자료를 토대로 지표물질을 선정하였고, Table I과 같은 조건으로 분석하였다. 각각의 지표성분은 검량선을 작성하여 생약 추출물의 함량을 평가하였다.

직선성, 검출한계 및 정량한계(Linearity, LOD, LOQ) − Icariin, atractylenolide Ⅲ 및 tenuifolin의 검량선은 2.5~ 200 μg/mL, 1.25~250 μg/mL 및 5~250 μg/mL로 피크면적에 대하여 각각 작성하여 계산하였다. 상관계수를 구하여 직선성의 양호를 판단하였고, LOD(limit of detection, 검출한계)와 LOQ(limit of quantitation, 정량한계)는 신호(signal) 대잡음(noise)의 비를 이용하여 각각 4과 10을 기준으로 계산하였다.

추출물 안정성 실험 − 3종의 생약의 열수 추출물을 동결건조한 분말의 안정성 실험을 위해 시료를 실온과 냉장에 6개월 보관하면서 0, 1, 2, 4, 6 개월에 각각의 시료를 설정된 HPLC 조건에서 분석하였다. 각각의 시료는 일정 양씩 3개의 EP-tube에 취하고 60분간 sonication 후 membrane filter로 여과한 후 HPLC로 분석하였다.

 

결과 및 고찰

음양곽, 백출 및 원지의 독성실험을 위해서는 정확한 생약의 감별과 각 추출물의 주요성분 함량분석 및 추출물의 안정성 확인은 중요한 요소이다. 3종의 생약재의 독성시험을 위해서 함량변화와 HPLC peak의 profile을 통한 추출물의 안정성을 확인하였다. 본 연구에서 안정성이 확보된 생약 추출물은 13주 반복투여 독성시험으로 각 생약재에 대한 안전성 실험이 수행될 예정이다. 따라서 독성시험을 위한 생약재 자체의 동정과 추출물의 안정성은 독성시험 전에 확보되어야 하는 필수요소이다.

생약재의 감별 − 3종의 생약에 대한 정확한 감별을 위해 생약전문가 5인을 감별고문으로 초빙하여 선별하였다. 국산 음양곽(E. koreanum Nakai)은 고가로 시중에서는 유통되지 않고 중국산 음양곽(E. brevicornum, E. pubescens, E. wushanense, E. saggitatum)이 유통되어 이들 중 icariin 함량이 0.5% 이상 함유된 음양곽을 선정하였다. 백출은 삽주(A. japonica Koid. ex Kitam)와 중국산 백출(A. macrocephala Koid.)이 유통되고 있으나 대부분 중국산 백출이 차지하고 있어 중국산 백출을 선정하였고, 원지는 중국산 원지(P. tenuifolia Willdenow)가 유통되고 있어 뿌리가 굵고 매운맛이 강한 것을 선정하였다.

생약 추출물 지표성분 정량 −일반적으로 생약의 분석에서 지표성분은 그 약리활성을 대표하거나 각 생약의 특이한 활성을 갖는 성분을 선정하는 것이 원칙이나, 활성성분이나 특이성분을 설정하기 어려운 경우에는 주성분을 지표성분으로 한다.1) 본 연구에서 사용된 3종의 생약의 지표성분 선정은 그 생약의 대표적인 생리활성을 보이며 주성분잘 알려진 것으로 하였다. 즉, 음양곽(Epimedii Herba)은 flavonoid glycoside계 화합물 icariin을 지표성분으로,32) 백출(Atractylodis Rhizoma Alba)은 주요성분으로 sesquiterpenoid계 성분 atractylenolide Ⅰ과 atractylenolide Ⅲ 등이 있으나, 물 추출물에서 정량이 가능한 atractylenolide Ⅲ를 지표물질로 선정하였다.33) 그리고 원지(Polygalae Radix)는 triterpenoid계 saponin인 tenuifolin을 지표물질로 선정하였으며34) 각 화합물의 구조는 Fig. 1과 같다. 3가지 생약의 지표성분 HPLC 분석은 Table I의 조건으로 분석 가능하였으며 추출물 분석에 다른 성분의 피크에 의한 방해를 받지 않았다(Fig. 2). 상기의 분석 조건으로 각 지표성분의 검량선을 작성한 결과 음양곽의 icariin은 2.5~200 μg/mL 농도에서 직선성이 0.9992, 백출의 atractylenolide Ⅲ는 1.25~250 μg/mL 농도에서 직선성이 0.9994, 원지의 tenuifolin은 5~ 250 μg/mL농도에서 직선성이 0.9974 이상으로 높은 직선성이 확인되었다(Table II).

Table I.HPLC conditions of Epimedii Herba, Atractylodis Rhizoma Alba, and Polygalae Radix

Fig. 1.Chemical structures of maker compounds (Icariin isolated from Epimedii Herba; atractylenolide Ⅲ isolated from Atractylodis Rhizoma Alba; tenuifolin isolated from Polygalae Radix).

Fig. 2.HPLC chromatogram of standard compounds and extracts: (A) Standard compound of Epimedii Herba; (B) Extract of Epimedii Herba; (C) Standard compound of Atractylodis Rhizoma Alba; (D) Extract of Atractylodis Rhizoma Alba; (E) Standard compound of Polygalae Radix; (F) Extract of Polygalae Radix.

열수추출물 안정성시험 −음양곽, 백출 및 원지의 물 추출물에 대한 안정성 자료를 얻고자, 각각의 추출물을 실온과 냉장에 보관하고 6개월간 일정 기간 간격(1, 2, 4, 6 개월)으로 육안 관찰하고 유효성분 함량 평가하였다. 육안 관찰에서는 실온과 냉장 장기보관시험 조건에서 색 등의 변화가 관찰되지 않았으나, 6개월 장기보관에 원지의 추출물은 실온에 저장한 시료가 함습에 의한 점성이 있는 형태로 변했고 음양곽과 백출의 추출물은 외부적인 변화가 관찰되지 않았다.

Table II.Calibration data of HPLC-UV

Table III.Contents of marker compounds during the period of stability test (n=3)

지표성분의 크로마토그램과 함량은 Fig. 2와 Table III과 같으며 음양곽(Epimedii Herba)의 열수 추출물 HPLC 분석결과 icariin이 상기의 분석 조건에서 분리되었고, HPLC chromatogram과 같이 주성분 중의 하나로 확인되었다. 대한약전에 음양곽의 지표성분에 대한 함량 규정이 되어 있지 않으나 이 실험을 통하여 icariin은 지표물질로 좋은 후보임을 알 수 있다. 음양곽 추출물을 6개월 동안 냉장 조건에서 보관한 시료는 icariin 함량 변화가 없었으나 실온에서 보관한 시료의 icariin 함량이 약 76% 정도로 감소하였다. 그러나 전체적으로 음양곽의 열수 추출물은 안정함을 확인할 수 있었다. 백출(Atractylodis Rhizoma Alba)의 추출물 HPLC 분석 결과 atractylenolide Ⅲ는 상기의 분석조건에서 검출되었으나 미량 검출되었다. 백출의 주요성분은 sesquiterpenoid계 성분으로 알려져 지표물질로 선정하였으나 백출의 열수 추출과 동결건조 과정에서 정유성분이 휘발되었음을 예상할 수 있었다. 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 백출 추출물에 대해 atractylenolide Ⅲ의 함량을 분석한 결과 6개월 동안 보관시료의 atractylenolide Ⅲ함량에는 차이가 없어, 백출의 열수 추출물은 안정한 것으로 확인되었다. 원지(Polygalae Radix)의 지표물질은 tenuifolin으로 선정하였고 Table I의 HPLC 조건에서 분석 가능하였으며 시료에서의 주성분으로 알려진 표준물질 함량은 크로마토그램과 같이 미량 검출되었다. 원지 추출물 6개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료에 대한 분석결과 tenuifolin의 함량에 변화가 없었으며 HPLC 크로마토그램상 불순물로 검출되는 피크가 없어 원지 열수 추출물의 안정성을 확인할 수 있었다.

 

결 론

생약재의 독성실험을 위한 추출물은 식약청고시 2003-17, 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였다. 추출물의 함량분석을 위해 음양곽(Epimedii Herba)의 지표성분은 icariin으로, 백출(Atractylodis Rhizoma Alba)의 지표성분은 atractylenolide Ⅲ로, 원지(Polygalae Radix)는 tenuifolin으로 지표물질로 선정하였다. 각 성분은 HPLC-UV detector와 RP C-18 column으로 분석 가능하였다. 추출생약재의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 6개월간 실온과 냉장 보관하였고, HPLC로 분석하여 각 피크의 패턴과 지표물질의 함량 분석으로 3종 생약의 안정성을 확인한 결과 음양곽, 백출 및 원지 추출물은 안정한 것으로 확인되었다. 본 실험에서 수행한 생약 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 유통과정에 효율적 품질관리 개선에도 활용이 가능할 것으로 기대된다.