Cancer Prevention Effect of Epigallocatechin-3-gallate through Regulate in C-terminal Src Kinase (CSK) Signaling Pathway

녹차성분 EGCG의 CSK 단백질 조절을 통한 암예방 효과

Abstract

A great interest is emerging about green tea as a tool against human cancer proliferation or inflammation, as pointed out by recent reports describing the inhibitory action of epigallocatechin gallate (EGCG) on angiogenesis, urokinase, metalloproteinases, and induction of inducible nitric oxide synthase. We proposed that EGCG may regulate a multi target signaling having wider spectra of action than those actions of single enzymes. CSK (c-terminal Src kinase) protein is a non-receptor tyrosine kinase involved in the cross-talk and mediation of many signaling pathways that promote cell proliferation, adhesion, invasion, migration, and tumorigenesis. Based on the knowledge that CSK activation is important for cancer proliferation we hypothesized that CSK could be a target of EGCG. Here we showed that EGCG effectively suppressed the growth of CSK MEF cell when compare with CSK knockout MEF cell growth. These results indicate that EGCG could be used as a chemoprevention to modulate CSK signal pathway in inflammatory processes and tumor formation.

재료 및 방법

시약 및 시료 −모든 배지는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)의 권장 배지를 사용하였고, fetal bovine serum(FBS) 시약은 Gemini Bio-Products(Calabasas, CA, USA)로 부터 구입하였다.

CNBr-Sepharose 4B, glutathione-Sepharose 4B, [γ-32P]ATP는 Amersham Biosciences에서 구입하여 사용하였다.

[3H]EGCG(13Ci/mmolin ethanol containing 8 mg/ml ascorbic acid)는 Dr. Yukihiko Hara(Food Research Laboratory, Mitsui Norin Co. Ltd., Fujieda, Shizuoka, Japan)로 부터 제공받아 사용하였다. 재조합 CSK와 poly-(Glu4-Tyr) peptide는 Upstate Biotechnology, Inc.(Charlottesville, VA)로 부터 구입하였다. ATP immobilized agarose 4B는 Fluka(St. Louis)에서 구입하여 사용하였다. EGCG, EC, ECG, EGC는 Dr. Chi-Tang Ho(Rutgers University, Piscataway, NJ)로부터 제공받아 사용하였다.

세포배양 − Jurkat(clone E6-1) human T cell leukemia 세포와 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포는 Dr. Zigang Dong(Cellular & molecular biology, Hormel institute, Austin, MN, USA)로 부터 제공받아 사용하였다. Jurkat와 CSK knockout MEF 세포는 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.

결합력 및 Kd측정 − GST-CSK의 결합력을 측정하기 위하여 GST fusion 단백질을 glutathione-Sepharose 4B beads와 한 시간 동안 상온에서 반응시켜 immobilization 하였다. 결합력 측정은 4℃에서 reaction buffer가 포함된 500-μl reaction mixture와 1 μg의 GST-CSK-Sepharose 4B 또는 GST-Sepharose 4B와 0.5 μCi의 [3H]EGCG를 반응시켰다. 농도 의존적 분석을 위해서 EGCG 농도를 3 pM에서 50 μM까지 사용하였다. Kd 측정은 Prizm 4.0 program(Graphpad Inc., San Diego, CA)을 사용하여 nonlinear regression 분석을 이용하였다.

EGCG-Sepharose 4B와 L-[35S] Methionine-labeled CSK단백질 Pulldown Assays − Full-length CSK유전자(pcDNA4/HIS/Max-CSK)를 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System(Promega) 이용하여 L-[35S] methionine과 함께 in vitro translation 시켜서 라벨을 만들었다. 35S-label CSK 단백질을 reaction buffer(50 mM Tris, pH 7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.01% Nonidet P-40, 2 μg/ml bovine serum albumin, 0.02 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1×proteinase inhibitor)에서 EGCG-Sepharose 4B beads와 반응시켰다. Bead는 완충용액(50 mM Tris, pH 7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.01% Nonidet P-40, 0.02 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)으로 5번 세척한 후 bead와 결합한 단백질을 autoradiography 또는 immunoblotting으로 분석하였다.

Kinase Assay − CSK kinase assay는 30℃에서 2시간 동안 25 μl reaction mixture(50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MnCl2, 1 mM EGTA, 2 mM dithiothreitol, 0.01% Brij), 0.2 μg의 재조합 CSK, 1 μg의 kinase substrate(poly(Glu4-Tyr) peptide, biotin conjugate) Upstate Biotechnology, Inc.(Charlottesville, VA)와 1 μg의 unactive LCK 단백질 (millipore, MA,USA) 그리고 EGCG(0.5-20 μM), 100 μM ATP, 1 μCi의 [γ-32P]ATP를 반응시켰다. ECG, EGC, EC는 10 μM로 처리하였다. 반응 종결 후 scintillation counter를 이용하여 결과를 분석하였다. LCK 단백질의 인산화를 확인하기위해 anti-phospho-LCK(Tyr505) 항체(millipore, MA, USA)를 이용하였다.

세포 성장 측정 −세포(6×105)를 96-well plate에 24시간 동안 배양한 후 각각의 EGCG 농도(0, 0.5, 1, 5, 10, or 20 μM)에서 72시간 동안 배양하였다. EGCG의 세포 성장억제 효과를 측정하기 위하여 the Cell-Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay kit(MTS)(Promega, Madison, WI)를 이용하였다. 시약을 각 well에 첨가하여 흡광도를 492 nm 파장에서 96-well plate reader(Labsystem Multiskan MS, Labsystem, Finland)로 결과를 측정하였다. CSK+/+와 CSK-/-세포에서의 20 μM EGCG 처리후 성장률을 3주간 관찰하였다. 본 실험은 focus-forming 방법에 의해 수행하였으며 약 3주후 세포 콜로니를 methaol에 고정 후 0.4% crystal violet으로 염색 후 관찰 하였다

 

결 과

EGCG와 CSK 결합 능력 − CSK는 Src-family kinase의 활성을 촉진하며 다양한 암세포에서 활성화 되었다.14) Kinase screening 실험을 통하여 EGCG 5 μM에 의해서 CSK가 억제됨을 확인하였다. 그래서 우리는 EGCG와 CSK가 서로 상호작용을 할 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. 우선 EGCG와 CSK의 결합 능력을(binding affinity; Kd) GST pull-down assay와 3H-labeled EGCG를 이용하여 확인하였다. EGCG와 CSK의 결합 Kd 값은 0.05±0.04으로 측정되었다(Fig. 2A). 그 다음으로 EGCG와 CSK의 결합을 EGCGSepharose 4B affinity chromatography 실험을 통하여 확인하였다. 그 결과 EGCG와 CSK는 complex를 이루는 것이 확인되었다(Fig. 2B).

Fig. 2.in vitro interaction of CSK with 3H-EGCG. A. specific binding assay for CSK and EGCG. The Kd (dissociation kinetic)value of the EGCG-CSK interaction (Kd=0.05 μM) was obtained by using a GST-CSK affinity-binding assay as described under “Experimental Procedures.” B, in vitro identification of the EGCG-binding site of CSK. The full-length CSK were translated with L-[35S]methionine using TNT and subjected to the EGCG-Sepharose 4B pulldown assay. C, modeling of EGCG binding with the CSK catalytic pocket protein.

또한 EGCG와 CSK 사이의 결합에 대한 구조적 관계를 좀 더 확실하게 파악하고자 우리는 CSK의 x-ray co-crystal 구조를 활용하여 EGCG의 결합 부위를 확인하였다(Fig. 2C).

CSK Kinase 활성에 대한 EGCG의 효과 −다음으로 우리는 EGCG가 CSK의 인산화 또는 kinase 활성을 억제 할 수 있는지 확인하였다. Kinase 활성은 활성 CSK와 기질인poly(Glu4-Tyr)펩타이드를 이용한 in vitro kinase assay를 통하여 측정하였다. 그 결과, EGCG는 농도의존적으로 CSK kinase 활성을 억제하였으며, 4 μM의 농도에서 50% 활성억제(IC50)를 보였다(Fig. 3A).

Fig. 3.Effect of EGCG or analogue on CSK kinase activity and phosphorylation of LCK. A-B, EGCG inhibits CSK kinase activity in vitro. Kinase activity of CSK was assayed under the conditions described under “Experimental Procedures.” C, posphorylation of LCK on regulate CSK by treatment EGCG(20 μM). (+): Positive control-recombiant CSK, and kinase substrate (poly(Glu4-Tyr) peptide, biotin conjugate. Data are represented as means±S.D. of triplicate samples from three independent experiments.

다른 폴리페놀들(ECG, EGC, EC)과 EGCG의 CSK kinase 활성을 비교 실험하였다. EGCG는 다른 폴리페놀들에 비해 가장 강력하게 kinase 활성을 억제하였다(Fig. 3B).

그 다음으로 CSK의 기질로 알려진 lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(LCK)를 이용하여 EGCG가 CSK의 활성에 미치는 영향을 확인하였다. EGCG를 농도 별로 처리하였을 때 LCK의 인산화가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3C).

세포 성장에 대한 EGCG의 효과 −최근 연구에 의하면 EGCG는 암세포 증식을 억제하므로 암 예방의 효과가 있음을 보고하였다.15) 본 실험에서도 EGCG의 세포 증식에 관한 효과를 살펴보고자 하였다. 세포증식 조절에서 CSK와의 관계를 증명하기 위하여 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포를 제작하였다. 두 세포에서 세포 성장에 미치는 EGCG의 영향을 조사하기 위해 MTS assay와 anchorage independent cell growth assay(Soft agar assay)를 실시한 결과 CSK knockout된 MEF 세포(CSK-/-)에서는 EGCG 처리와는 관계없이 세포 증식이 이루어졌으며, CSK+/+ MEF 세포에서는 EGCG 처리 농도 의존적으로 증식이 억제 되었다(Fig. 4 A,B). EGCG는 CSK pathway를 통하여 세포 증식을 조절함을 알 수 있다.

Fig. 4.EGCG inhibition of Cell growth and focus formation mediated by CSK knockout MEF cell lines. A-B, CSK knockout MEF cell growth was assessed by Cell-Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay (MTS) and focus forming assay in the presence of increasing amounts of EGCG.

 

고 찰

본 실험의 결과로 EGCG가 CSK의 kinase 활성을 조절할 수 있음을 확인하였다. 아직까지 암에서 CSK의 명확한 기능이 밝혀져 있지 않은 상태에서 이런 EGCG의 조절은 암의 메커니즘에서 CSK의 역할을 설명할 수 있는 증거를 제시할 수 있다.

현재까지 진행된 CSK에 대한 연구를 살펴보면, embryonic carcinoma cell line인 P19에서 CSK의 발현이 높은 것이 확인되었다. 이 세포주에서 CSK는 세포 부착 분자에 의해 매개되는 cell-to-cell interaction에서 중요한 역할을 하는 Src family kinase들을 조절함으로써 neural differentiation에 관여한다고 알려져 있다.16) 다른 연구 그룹에서는 2개의 정상 대장 세포주와 18개의 대장암 세포주에서 CSK의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 대장암 세포주에서 정상 세포주보다 CSK의 발현이 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다.17) 유방암에 관한 CSK의 연구를 살펴보면, 정상 breast 조직과 breast tumor에서 CSK의 kinase 활성을 조사하였다. CSK는 정상 breast 조직과 breast carcinomas, 유방암 세포주에서 높은 발현과 kinase 활성을 나타내었다.18)

EGCG의 암 억제 기전에 대해서는 많은 연구가 이루어져 있다. 암 환자에서 암 전이는 주된 사망 원인이다. 전이의 복잡한 여러 단계의 과정을 거치며 암세포의 기저막 침윤은 초기의 중요한 단계이다. EGCG의 항암작용이 암세포 기저막 침윤에 중요한 urokinase plasminogen activator(uPA), matrix metalloproteinase(MMP), 활성산소 등의 억제를 통해 작용됨이 보고 되었다.

암세포의 침윤에서 중요한 hydrolase인 uPA는 기저막과 세포 외 기질의 분해를 촉진한다. uPA는 유방, 난소, 전립선, 위장관계 암 등 대부분의 침윤성 암에서 과발현되고 전이에 필수적인 역할을 하며, 예후를 예측하는데 중요한 지표가 된다. 동물모델실험에서 uPA 억제는 종양의 크기를 줄이거나 암 생성을 억제하였다. EGCG가 인간 섬유육종 세포주(human fibrosarcoma cell line)인 HT-1080 세포를 이용한 실험에서 uPA의 발현을 억제한다는 보고가 있다.19) 이 연구에서 EGCG는 uPA의 promoter 활성을 억제하고 uPA의 mRNA의 안정화에 영향을 주었다. 다른 보고에서는 인간 구강암 세포주(human oral cancer cell line)인 OC2 세포를 이용하여 실험한 결과, OC2 세포의 이동과 침윤활동이 EGCG에 의해서 억제되었고, 그 과정에서 MMP-2/9, uPA의 발현이 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다20) 하인두암 세포(hypopharyngeal carcinoma cell)에서는 HGF(hepatocyte growth factor)에 의해서 유도되는 종양의 성장, 이동, 침윤과정에서 발현이 증가되는 MMP-9과 uPA가 EGCG에 의해서 억제되는 것을 확인하였다.21)

MMP-2와 MMP-9는 암 및 주위조직에서 발현이 증가되어 기저막의 분해를 통해 세포침윤을 돕는다. 최근 몇몇의 MMP 억제제가 항암제로서 개발되고 임상시험 중에 있지만 근골격통 등의 부작용이 나타나 사용이 제한되고 있다.22) EGCG의 MMP 억제 작용에 대해 많은 연구들이 보고 되고 있으며,23) 일정량의 EGCG를 처치한 경우 MMP를 억제하여 종양세포의 침윤을 50% 정도 감소시킴이 보고 되었다.24) 최근 연구에 의하면, 신경교종(glioma) 세포주인 U251 세포에 EGCG를 처리하면 세포의 침윤과 성장이 억제되는데 이 때 MMP2/9의 mRNA 발현이 낮아진다고 보고되었다.25) 다른 연구에서는 유방암 세포주인 MCF-7과 MDA-MB-231 세포에서 EGCG가 MMP2/9의 활성을 억제시켜 TIMP-3(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-3)의 발현을 증가시킴으로써 세포 침윤을 억제한다는 것을 밝혔다.26)

EGCG는 활성산소를 소거하는 항산화 활성을 갖는 것으로 알려지고 있다. 종양세포는 암세포의 침윤과 전이와 관련된 reactive oxygen species(ROS)를 다량 생성한다. ROS는 세포 내 중요한 신호전달자이며, 결국 MMP 등 침윤과 관련된 유전자 발현을 촉진한다. 보고된 연구에 의하면 hypoxanthine-xanthine oxidase system으로 생성된 ROS가 암세포의 침윤을 증가시킨다고 하였다.27) Ascorbic acid에서 유래한 지용성 asc-2-Ophosphate-6-O-palmitate(Asc2P6Plm) 혹은 carotenoid는 항산화작용을 통해 암세포의 침윤을 억제하였다.28) 뿐만 아니라, superoxide를 제거하는 효소인 Cu-Zn superoxide dismutase의 처치가 생쥐연구에서 암의 폐 전이를 억제하였다. 이상의 결과들은 EGCG와 같은 항산화제가 잠재적으로 항전이 약물로의 개발가능성이 있음을 시사한다.

녹차의 EGCG가 혈관신생을 억제함을 증명하기 위해 융모 요막(chorioallantoic membrane) 측정법을 사용한 연구에서, EGCG는 FGF(fibroblast growth factor)로 성장이 촉진되는 모세 혈관 내피 세포의 증식을 억제하였으며, 특히 EGCG의 세포성장 억제는 내피세포에만 국한되었고, 암세포, 섬유모세포, 혈관 편평 세포 등에서는 별다른 효과를 나타내지 않았다.29) 최근 연구에서 SD rats에 thioacetamide를 처리하여 유도된 MMP-9과 FGF-2의 발현이 EGCG에 의해 억제됨을 확인하였다.30)

사람 대장암세포에서, EGCG는 extracellular-regulated kinase(ERK)-1과 ERK-2의 활성과 vascular endothelial growth factor(VEGF) 발현을 차단함으로써 혈관신생을 억제하였다. EGCG가 ERK-1과 ERK-2의 활성을 억제하는 분자적 기전은 아직 정확하지 않다. 앞서 언급한 바와 같이, EGCG가 강력한 금속이온 결합제로 알려져 있으며, 많은 수용체 kinase는 2가 양이온이 필요하기 때문에, EGCG는 이러한 양이온을 결합함으로써 수용체 인산화를 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 연구에 의하면 EGCG가 전사인자인 activator protein-1(AP-1)를 억제하여 유전자발현을 조절함을 보고하였다.31) VEGF 유전자 promoter는 여러 AP-1 결합부위를 가지기 때문에 EGCG는 전사인자인 AP-1의 활성을 감소시킴으로써 VEGF의 발현을 억제할 수 있다. 이상 종합해 볼 때, EGCG는 ERK-1과 ERK-2의 활성을 억제하거나, VEGF promoter에 전사인자 AP-1의 결합을 억제하여 VEGF 발현을 조절할 수 있다.

Epidermal growth factor(EGF) 신호 전달계는 신생혈관조절 유전자인 VEGF와 IL-8의 발현을 조절하는 상위 조절인자로 알려지고 있다. EGFR 항체를 이용한 연구에서 췌장암 유발생쥐에서 VEGF, IL-8 발현 및 혈관신생 억제를 보여주었다.32) 또한 EGCG는 EGF가 EGFR에 결합하는 것을 차단하여 EGFR 인산화 활성을 억제하였다.33) EGCG가 EGFR 신호 전달계를 억제하는 정확한 기전은 잘 알려지지 않고 있지만, EGF 신호전달 억제는 EGCG의 항암효과가 암세포 성장억제와 함께 혈관신생 조절에 의해 일부분 매개될 수 있음을 제시한다.

다른 연구에서는 EGCG가 p53 비의존적인 경로로 VEGF 및 MMP-9의 활성을 조절할 수 있는 것으로 나타났으며, p53 비의존적인 경로에서는 EGCG가 AMPK의 활성을 통해 암세포의 전이를 억제하는 것을 확인하였다.34)

EGCG는 구강 암의 화학적 예방요법(chemoprevention) 측면에서 많은 연구가 되어 왔다. 최근의 연구에 의하면 구강 암종 세포주(oral squamous cell carcinoma; OSCC)와 동물 모델에서 EGCG가 세포독성을 가짐을 확인하였고 이때의 분자적 작용 기작에 대해서도 밝혀졌다. In vitro 실험을 통하여 밝혀진 바에 따르면 EGCG는 세가지 조절 기작을 가지는 것으로 알려졌다. 첫 번째는 세포 주기 정지나 apoptosis를 통한 세포성장 억제이다. 두 번째는 NF-κB(nuclear factor-κB)나 AP-1(activator protein-1) 같은 전사인자를 조절하는 것이다. 마지막으로는 matrix metalloproteinase의 생성을 억제하여 세포의 이동이나 침윤을 억제시키는 것이다. 다른 동물모델에서는 폴리페놀이 oxidative stress를 줄이고 phase Ⅱ enzyme 활성이 유도되는 동안 phase Ⅰ enzyme의 활성을 억제시키는 것으로 나타났다.35)

또한 최근 연구에 의하면 EGCG가 유방암, 피부암, 대장암을 포함하는 암의 성장을 억제한다는 사실이 밝혀졌다.36) 또한 종양 생성 과정에도 관여한다고 보고하였다. 이런 모든 기능들은 암 발생 과정(개시, 촉진, 발달)의 예방 및 억제에 유용할 것으로 생각된다. 즉, EGCG를 조절하면 암의 발생 및 성장을 조절할 수 있음을 의미한다고 할 수 있다.

본 연구에서는 EGCG가 CSK 활성을 조절한다는 사실을 확인하였으며 EGCG는 암종 중에서 C-Src family kinase 발현이 높은 암종의 경우 암 예방에 있어서 효과적으로 작용할 수 있음을 제시한 결과이다.