Anti-oxidative and Anti-cancer Activities by Cell Cycle Regulation of Salsola collina Extract

솔장다리 추출물의 항산화 활성 및 세포주기조절에 의한 항암 활성 분석

Abstract

Salsola collina, also known as Russian thistle, is widely distributed in and around waste facilities, roadsides, and drought and semi-drought areas, and is used as a traditional folk remedy in Chinese medicine for the treatment of hypertension. In this study, we have evaluated the anti-oxidative and anti-cancer activities of the ethanol extract of S. collina Pall. (EESC), and the molecular mechanisms of its anti-cancer effects on human colon carcinoma HT29 cells. EESC exhibited anti-oxidative activity through DPPH radical scavenging capacity and showed cytotoxic activity in a dose-dependent manner in HT29 cells. After EESC treatment, HT29 cells altered their morphology, becoming smaller and irregular in shape. EESC also induced cell accumulation in the G2/M phase in a dose-dependent manner, accompanied by a decrease of cell population in the G1 phase. The G2/M arrest by EESC was associated with the increased expression of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor p21 and Wee1 kinase, which phosphorylates, or inactivates, Cdc2. EESC treatment induced the phosphorylation of Cdc2 and Cdc25C, and inhibited cyclin A and Cdc25C protein expression. In addition, S arrest was induced by the highest concentration of EESC treatment, associated with a decrease of cyclin A and Cdk2 expression. These findings suggest that EESC may possess remarkable anti-oxidative activity and exert an anti-cancer effect in HT29 cells by cell cycle regulation.

본 연구에서는 명아주과 수송나물속 솔장다리(Salsola collina Pall.) 추출물의 항산화 및 항암 활성을 분석하였다. 먼저 솔장다리의 에탄올 추출물의 DPPH radical scavenging activity를 분석한 결과, $IC_{50}$가 $4.82{\mu}g/ml$로 나타나 강한 항산화능을 보유하였음을 확인하였다. 또한 대장암 세포주(HT29), 폐암 세포주(A549), 간암 세포주(HepG2)를 사용하여 솔장다리 추출물의 암세포 사멸효과를 분석한 결과, $IC_{50}$가 각각 43.8, 64.1, $92.5{\mu}g/ml$로 강력한 세포사멸효과를 나타냈으며 특히 HT29에 대한 강한 사멸효과를 보였다. 솔장다리 추출물의 항암 활성 기전 분석을 위해 세포주기를 분석한 결과, 대장암세포인 HT29의 G2/M arrest를 유도하였으며 최고 농도인 $60{\mu}g/ml$까지 S기 세포수가 증가하였다. 세포주기관련 단백질의 발현 분석 결과, 솔장다리 추출물을 처리한 경우, G2기에서 M기로의 전이에 필수적인 단백질인 Cdc25C와 cyclin A의 발현이 감소되었고, 반면 Cdc25C와 Cdc2의 불활성화 형태인 p-Cdc25C, p-Cdc2는 증가하였다. 또한 p21과 Wee1의 발현도 증가되었다. 하지만 p53의 발현량은 변화가 없었다. 이러한 결과는 솔장다리 추출물을 처리한 경우, p53 비의존적으로 p21의 발현이 증가되어 cyclin A/Cdc2 complex의 활성이 조절되고, 이어서 G2/M phase의 check point에 작용하는 Wee1의 발현증가 및 Cdc25C, Cdc2의 인산화에 의한 불활성화를 통하여 G2/M arrest가 유도되는 것을 시사한다. 또한 솔장다리 추출물 처리에 의해 S기 진행을 조절하는 Cdk2의 발현량도 감소하여, cyclin A/Cdk2 complex가 감소되어 S기의 세포수가 증가한 것으로 보인다. 따라서 본 연구 결과를 통해 솔장다리 추출물이 높은 항산화 활성을 지니며 암세포의 세포주기를 조절하여 높은 항암 활성을 보유함을 확인하였다.

서 론

우리나라 통계청에서 발표한 2012년 사망원인통계 자료에 의하면 3대 사망원인은 암, 심장 질환, 뇌혈관 질환으로 총사망자의 47.1%를 차지하고, 그 중 암은 30.4%로 가장 높은 사망률을 나타낸다고 보고하였다. 특히 대장암의 경우, 그 사망률이 전년대비 5.7% 증가하였으며 여성 암환자의 경우 폐암에 이어 두 번째로 높은 발병률을 보이며 해마다 그 발생률이 점차 증가하고 있다. 또한 전 세계적으로도 사망원인의 네 번째를 차지하고 있다[40]. 대장암의 발병원인은 정확히 알려져 있지는 않으나 흡연, 서구화된 식습관, 비만, 스트레스, 유전적 요인 등의 관련성이 보고 되고 있다[3, 8, 20].

암환자의 약 70~80%가 항암제 치료 중 오심, 구토 등 부작용을 경험하며, 이러한 부작용 증상에 대하여 1990년대 말부터 NK1 receptor antagonist인 aprepitant나 2세대 sertron계인 palonsetron 등을 사용 중이지만 항우울제로 분류되는 aprepitant 성분은 또 다른 부작용을 낳을 우려가 보고되고 있다[7, 19]. 또한 현재 항암제로 쓰여지고 있는 여러 물질들은 강한 독성을 가져, 암세포뿐만 아니라 정상세포까지 영향을 미치는 등 부작용이 많은 실정이다. 따라서 암의 치료뿐 아니라 예방을 위해 가능한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요한 현실이다. 따라서 최근 몇 십년간 새로운 항암제 개발을 위한 분자 마커(molecular marker)가 빠르게 개발되고 있으며 다양한 growth factor, 신호전달관련 인자, 세포 사멸 유도 및 세포주기조절 관련 인자들을 타겟으로 하여 많은 연구가 진행되고 있다[14, 15, 26]. 또한 부작용 및 독성이 적은 항암제의 개발을 위하여 천연물, 특히 식물 유래 천연물로부터 항암성분을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 다양한 성분들이 혼합되어 있는 천연물의 특징을 이용하여 천연물의 조추출물 또는 용매분획물을 사용하는 의약품 개발 및 단일 화합물이나 합성된 유도체 등을 통한 새로운 의약품 개발이 시도되고 있다[37]. 또한 이들 천연물을 이용한 의약품 개발은 천연물 내 존재하는 다양한 성분들의 상호작용을 통하여 다수의 타겟에 작용할 수 있어, 다양한 질환에 대한 조합치료가 가능하도록 하는 장점을 가진다.

정상 세포는 두 개의 세포로 분열되는 과정에서 G1, S, G2, M (mitosis) 주기를 가진다. G1기는 세포를 분열하기 위한 준비단계로 checkpoint가 존재하여 분열에 필요한 인자들이 부족하거나 DNA에 damage가 있을 때 G1기에 머무르게 하여 다음단계인 S기로 이행하지 못하게 한다. DNA 복제가 이루어지는 S기를 지나면 두 번째 check point가 존재하는 G2기에 의해 M기로의 이행을 조절하게 되며 M기로의 진행이 이어지면 증폭된 염색체는 전기(Prophase), 중기(Metaphase), 후기(Anaphase) 및 말기(Telophase)를 거쳐 세포분열을 완성한다[36]. 이러한 세포주기는 각 checkpoint 단계에서 적절히 조절되지 않으면 세포분열을 적절하게 제어하지 못하고 이상증식을 야기하여 암의 원인이 되기도 한다[29, 32]. 실제로 암세포는 정상세포와 달리 세포주기 제어를 벗어나 세포 자멸사 기전을 회피하고, 무한대로 분열하는 능력을 가지며, 따라서 암세포의 세포주기를 조절함으로써 강력한 항암효과를 가질 수 있고 이러한 세포주기 제어에 의한 항암활성에 관하여 활발하게 연구되고 있다[16].

세포주기의 조절에 관여하는 checkpoint에서는 Cyclin-dependent kinase (CDKs)와 cyclin complex의 활성화에 의해 다음 단계로의 진행이 일어나며 이러한 CDK/cyclin complex의 활성을 억제하며 세포주기를 조절한다[18, 35]. 특히 G2/M checkpoint인 Cdc2 (CDK1)는 cyclinB1과 complex를 이루어 mitosis 단계로의 진행을 유도하며 특정 kinase와 phosphatase에 의한 인산화/탈인산화 작용에 의해 활성이 조절된다[22]. Wee1 kinase에 의해 Cdc2의 Tyr-15 잔기가 인산화되어 Cdc2의 불활성화가 일어나며, 이러한 inactive form Cdc2는 Cdc25C phosphatase에 의해 탈인산화되면서 활성화 형태로 전환된다[6, 10, 33]. 또한 CDK 억제제 p21 (WAF1/CIP1)은 종양억제유전자인 p53의 발현 증가에 의해 유도되며, p21에 의해 CDK/cyclin complex의 활성이 억제된다[13, 31].

솔장다리(Salsola collina Pall.)는 중국 북동부, 남서부 지역에 널리 분포되어 있으며 중국에서는 고혈압, 두통, 현기증 치료를 위하여 음식 혹은 민간요법으로 사용되어지고 있으며, 현재까지는 솔장다리 추출물의 성분규명에 관한 연구만 되어있을 뿐, 솔장다리의 생리활성에 관하여는 보고되어진 바가 없다[23]. 따라서 본 연구에서는 솔장다리 에탄올 추출물을 사용하여 솔장다리의 항산화능 및 인체대장암세포주인 HT29에 대한 항암활성에 관하여 분석하였다.

 

재료 및 방법

시료 준비

솔장다리 에탄올 추출물(Ethanol extracts of Salsola collina Pall., EESC)은 한국생명공학연구원, 해외생물소재 허브센터에서 구입(분양번호; FBM123-061)하여 사용하였으며, ethyl alcohol 95.0% GR급을 사용하여 45℃에서 sonicator를 이용하여 3일동안 반복하여 추출하고 농축 후 동결 건조시킨 시료로서 적정 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해하였으며 −20℃에서 보관하여 사용하였다.

DPPH radical 소거 활성 측정을 통한 항산화능 분석

솔장다리 추출물의 항산화능 분석을 위하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거법을 이용한 전자공여능 측정을 수행하였다[25]. EESC를 농도별(2.56-320 μg/ml)로 메탄올에 녹여 준비한 후 96 well plate에 메탄올에 용해된 1.5 × 10−4 M DPPH 40 μl와 각 시료 160 μl를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시킨 후, microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 free radical 소거활성을 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(IC50)를 계산하였다. 양성 대조군으로는 대표적인 항산화제인 ascorbic acid를 사용하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다. 억제능의 백분율 공식은 다음과 같다.

DPPH radical scavenging activity (%)={1−(A−B)/C}×100

A: sample absorbance 520 nmB: color control absorbance 520 nm (without DPPH)C: negative control absorbance 520 nm (without sample)

세포배양

본 연구에 사용한 인체 대장암 세포주 HT29, 폐암 세포주 A549 및 간암 세포주 HepG2는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

암세포 사멸 효과분석

수용성의 tetrazolium salt (WST, water soluble tetrazolium salt)를 이용한 dehydrogenase assay 이용하여 EESC에 대한 세포독성을 측정하였다. 3-5×104 cell의 HT29, A549 및 HepG2 세포를 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, EESC를 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 이때 대조군은 0.1% DMSO를 처리하였다. 48시간 배양 후 WST assay reagent (Daeillab, Seoul, Korea)를 well당 500 μl 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복실험을 하여 그에 대한 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.

세포 형태 변화 관찰

EESC 처리에 따른 HT29 세포의 형태 변화 관찰을 위하여 6-well plate에 1×105 cell의 HT29 세포를 분주하여 24시간 동안 배양 후, 적정 농도의 EESC를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 HT29 세포의 형태변화를 위상차현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision program을 사용하여 사진 촬영을 하였다.

세포주기변화 분석

HT29 세포에서 EESC의 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위하여, HT29 세포에 EESC를 농도 별로 처리한 다음 CycleTEST™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포주기변화를 분석하였다. 먼저 6-well plate에 HT29 세포를 5×105 cell의 농도로 분주하여 부착시킨 후, EESC를 다양한 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 세포를 회수하고 PBS로 세척한 다음, ribonuclease A를 실온에서 10분간 처리하고 propidium iodide (PI) 용액을 첨가하여 4℃에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 Flow cytometry (Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

DAPI 염색에 의한 핵의 형태변화 관찰

EESC를 처리한 HT29 세포를 회수하여 cytospin (Thermo scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 슬라이드 위에 부착시키고 4% formaldehyde 용액으로 상온에서 10분간 고정한 다음, PBS로 세척 후 0.5% triton X-100으로 상온에서 10분간 permeabilization시켰다. PBS로 3회 세척한 다음 1 μg/ml의 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액을 이용하여 염색하였다. 차광한 상태로 상온에서 20분간 염색한 다음, PBS로 세척 후 Anti-fade mounting 용액을 사용하여 mounting하고, 형광현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 400배 배율로 핵의 형태변화를 관찰하고 Axio Vision Program을 이용하여 촬영하였다.

세포주기 관련 단백질 발현 분석

EESC의 항암 활성 기전을 밝히기 위해 세포주기 중 G2/M기 조절에 관여하는 단백질 발현을 Western blot hybridization으로 분석하였다. 농도별로 EESC를 처리한 HT29 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후, lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 μg/ml leupeptin, 1mM PMSF]를 첨가하여 4℃에서 20분간 반응시킨 다음 15,000 ×g로 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. Bradford assay로 추출한 단백질의 농도를 결정한 후 30 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 항체와 hybridization하였다. Membrane washing 후 Horse radish peroxidase (HRP)가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, San Leandro, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. p53, Cyclin A, Cyclin B1, Cdc2, phospho-Cdc2 (Tyr15), Cdc25C, Wee1 및 actin의 일차항체와 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse 등 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였으며, 대상 단백질인 p21, phospho-Cdc25C의 일차항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

통계분석

모든 결과는 mean±SD (Standard deviation)로 나타내었으며, 분석된 실험 데이터의 통계적 유의성은 대조군과 각 시료처리군의 실험데이터로부터 Student’s t test를 통하여 검증하였다.

 

결과 및 고찰

EESC의 항산화능 분석

활성산소는 노화, 암, 관절염 등에 직 간접적으로 생체 장애를 일으키는 원인으로 잘 알려져 있으며 따라서 항암활성을 포함한 다양한 생리활성 후보소재의 항산화능의 보유 유무의 확인은 매우 중요하다[39]. 이러한 항산화작용의 지표로 전자공여능 분석이 널리 사용되고 있으며, 전자공여작용은 인체 내에서 생성되는 프리라디칼의 전자를 공여하여 프리라디칼에 의한 노화와 질병을 억제하는 작용으로, 식물 추출물의 항산화능 측정에 많이 사용되고 있다. 특히 DPPH는 비교적 안정한 free radical로써 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색이 되며, 이러한 원리를 이용하여 식물이나 식품 추출물 또는 단일 화합물의 항산화능 측정법으로 이용된다[42]. EESC의 항산화능을 DPPH radical scavenging activity 측정을 통해 분석한 결과, Table 1에 제시한 바와 같이 EESC의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 억제능이 증가하여 2.56 μg/ml에서는 DPPH radical 억제능이 39.4%, 12.8 μg/ml에서는 87.84% 그리고 64 μg/ml에서는 95%까지 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 억제능 50%일 때의 EESC의 농도(IC50)는 4.82 μg/ml로 양성 대조군인 ascorbic acid의 IC50인 1.31 μg/ml보다는 다소 높았으나, 추출물인 것을 감안하면 매우 강력한 항산화 활성을 지니는 것을 알 수 있었다.

Table 1.DPPH radical scavenging activity by ethanol extract of S. collina Pall.

EESC의 암세포 사멸 효과

EESC가 강력한 항산화 활성을 지니는 것을 확인하였으므로 다음으로 암세포에 대한 사멸효과를 보이는 지 알아보았다. EESC의 다양한 암세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 인체 대장암 세포 HT29, 폐암세포 A549 및 간암세포 HepG2에 EESC를 처리하여 WST assay를 사용하여 세포사멸 효과를 확인하였다. 그 결과 Fig. 1A에 제시한 바와 같이 암세포주의 종류에 따라 암세포 사멸효과의 정도가 다른 것을 확인할 수 있었다. HT29 세포의 경우, 30 μg/ml의 EESC 농도에서부터 세포증식이 억제되었으며, 43.8 μg/ml의 EESC 농도에서는 50% 사멸효과(IC50)를 보여 세 종류의 암세포주 중 가장 강력한 세포사멸효과를 보였다. 또한 A549 세포의 경우 40 μg/ml의 EESC처리에 의해 사멸효과를 보이기 시작했으며 64.1 μg/ml의 IC50를 보였다. 반면, HepG2의 경우는 60 μg/ml의 EESC 농도에서부터 세포증식 억제를 보였으며 EESC 처리 최고 농도인 70 μg/ml에서도 70% 정도의 세포사멸효과를 보여 세 종류의 암세포 중 가장 효과가 약한 것을 알 수 있었다. 각 암세포에 대한 세포사멸 효과의 IC50는 Fig. 1B에 나타내었다. 이상의 결과를 바탕으로 이후 실험은 인체 대장암 세포주 HT29를 사용하여 진행하였다.

Fig. 1.Effects of EESC on cell growth in various cancer cell lines. (A) Human colon carcinoma HT29 cells, human lung carcinoma A549 cells, and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were treated with various concentrations of EESC for 48 h. Cytotoxic effect of EESC was determined by WST assay. Results are expressed as percentage of the vehicle treated control ± SD of three independent experiments. *, p < 0.05, **, p < 0.005 and ***, p < 0.001 compared with DMSO treated cells. (B) IC50 values of human cancer cells are shown.

HT29의 세포형태에 미치는 EESC의 영향

다음으로 EESC 처리가 HT29 세포의 형태 변화를 유도하는 지 관찰하기 위하여 HT29 세포에 EESC를 농도별로 처리한 후 세포의 형태변화를 위상차 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, Fig. 2에서와 같이 EESC의 처리 농도에 따라 세포밀도가 점차 감소하여 세포증식이 억제됨을 알 수 있었다. 또한 40 μg/ml의 EESC를 처리하였을 때부터 점차적으로 세포 형태가 불규칙적으로 변하고, 무리를 이루어 자라는 형태가 단일세포형태로 변하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터 EESC의 처리에 의해 HT29의 세포 형태에 변화가 일어남을 확인하였다.

Fig. 2.Morphological changes by EESC in HT29 cells. Cells were treated with indicated concentration of EESC for 48 h, and then visualized by light microscopy. Magnification, ×200

EESC에 의한 세포주기 변화 분석

현재까지 다양한 암세포에서 정상세포와는 달리 G1기 및 G2기의 checkpoint에 의한 정상적인 세포주기 조절에서 벗어나 비정상적으로 무한 증식이 일어난다는 것이 보고되어 있다[17]. 또한 최근에는 이러한 암세포의 세포주기제어에서 벗어나는 분자적 기전에 관하여 활발히 연구되고 있으며, 새로운 항암제 연구를 위하여 암세포의 세포주기를 제어하는 신물질을 찾는 노력들이 활발히 진행되고 있다[37]. 따라서 본 연구에서는 EESC에 의한 HT29 세포의 증식억제 현상이 세포주기 조절에 의한 것인지 살펴보았다. HT29 세포에 EESC를 농도별로 처리한 후 PI 염색을 하여 세포주기의 변화를 Flow cytometry로 분석하였다. 그 결과, Fig. 3A에서 보여지는 바와 같이, EESC 농도의존적으로 G2/M기의 세포비율이 증가되는 것을 확인하였으며, 최고 농도인 60 μg/ml의 EESC를 처리하였을 때 G2/M기뿐 아니라 S기의 세포비율도 증가되는 것을 알 수 있었다. 또한 G2/M arrest가 유도되면서 상대적으로 G1기의 세포 분포는 점차 감소됨을 확인하였다. 이러한 EESC 처리에 따른 세포주기별 세포비율은 정량화하여 Fig. 3B에 나타내었다. 대조군에서 16.86%였던 G2/M기 세포분포는 EESC 최고 농도인 60 μg/ml에서는 24.9%의 세포가 G2/M기에 정체되어 있음을 확인하였다. 또한 대조군에서 26.15%였던 S기의 세포분포는 최고 농도인 60 μg/ml에서는 34.23%로 증가되었다. 반면, G1기의 세포분포는 51.87%에서 36.93%로 감소하였다. 따라서 이와 같은 결과는 EESC에 의해 HT29 세포의 G2/M arrest가 유도됨을 시사하며 최고 농도에서는 S기 및 G2/M기에서 세포주기가 정지되는 것으로 사료된다[4, 45].

Fig. 3.Induction of G2/M arrest in EESC-treated HT29 cells. HT29 cells were cultured and treated with EESC for 24 h. Cells were harvested, and then stained with propidium iodide for 30 min and analyzed by flow cytometry. DNA-flourescence histogram (A) and quantitative data of cell distribution (B) are shown. M1, SubG1 phase; M2, G1 phase; M3, S phase; M4, G2/M phase.

다음으로 EESC에 의한 세포주기 정지에 따른 핵 내의 변화를 관찰하기 위하여 HT29 세포에 EESC를 농도별로 처리한 다음 DAPI 염색을 수행하였다. 그 결과, Fig. 4에서와 같이 EESC 처리 농도가 증가할수록 핵 내 농축된 염색체가 관찰되었으며, 특히 M (mitosis)기의 단계 중 전중기(Prometaphase, Arrow in Fig. 4), 및 후기(Anaphase, Arrowhead in Fig. 4) 단계에 있는 세포들이 증가하는 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과들은 EESC 처리에 의해 G2/M arrest가 일어나 mitosis가 완전히 일어나기 전 단계의 세포가 많이 관찰되는 것을 의미한다[9].

Fig. 4.Conformational changes in nuclear chromatin of HT29 cells by EESC treatment. EESC-treated cells were fixed with 4% formaldehyde, permeabilized with 0.5% Triton X-100 and stained with DAPI for 20 min. Stained cells were observed by fluorescence microscopic analysis and imaged using Axio Vision Program. EESC-treated HT29 cells showed the dense nuclear chromatin in the prometaphase (Arrow) and in the anaphase (Arrowhead) of mitosis. Scale bar, 20 μm.

EESC가 세포주기 관련 단백질 발현에 미치는 영향

세포주기를 조절하는 checkpoint는 G1/S기 및 G2/M기에 존재하며, 이 때 CDK/cyclin complex가 checkpoint의 중요한 인자로 작용하게 되고, 이러한 CDK/cyclin complex의 활성 여부에 따라 세포증식이 촉진되고 억제되기도 한다[1]. G1/S기 checkpoint 중에서 S기에서 세포주기진행을 조절하는 인자는 cyclin A/CDK2 complex이며, G2/M기에서는 Cdc2 (CDK1)와 cyclin A 및 cyclin B가 중요한 인자로 작용한다[28, 34, 41]. 특히 G2 후기와 초기 M기에서는 활성화된 cyclin A/Cdc2 complex에 의해 M기로의 진행이 촉진되며, M기에서는 cyclin B/Cdc2 complex에 의해 조절된다[5, 27]. 따라서 EESC에 의한 HT29의 세포주기 조절 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, S기 및 G2/M기 checkpoint 관련 인자들의 항체를 사용하여 Western blot analysis를 수행하였다. 그 결과, EESC 농도의존적으로 G2/M checkpoint 관련단백질인 Cdc2의 인산화가 증가되었으며, cyclin A의 발현양이 감소하였다(Fig. 5A). 그에 반해 cyclin B1의 발현은 증가되었으나, inactive Cdc2와 complex를 이루어 M기의 진행을 저해할 것으로 사료된다[24, 43]. 또한 CDK inhibitor인 p21의 발현도 EESC 농도의존적으로 증가하였다(Fig. 5B). phospho-Cdc2는 Cdc2의 불성활성화 형태로 Cdc2의 ATP binding site에 인산기가 결합하여 cyclin A/Cdc2 complex의 활성을 억제하고, p21은 cyclin/CDK complex에 결합하여 활성을 억제하는 단백질로 알려져 있다[44]. 따라서 이러한 결과들로부터 EESC를 처리에 의한 G2/M arrest는 Cdc2의 불활성화에 의한 G2/M checkpoint인 cyclin A/Cdc2 complex의 활성화 저해에 의한 것이라 사료된다. 반면, p21의 발현을 유도하는 것으로 알려진 p53의 발현은 EESC처리에 의해 아무런 변화가 관찰되지 않았으며(Fig. 5B), 이는 EESC에 의한 p21의 발현 유도는 p53-independent 한 것임을 시사한다[21, 46]. 또한 S기 checkpoint 관련 단백질인 Cdk2의 발현 또한 감소하였으므로(Fig. 5A), 이전의 세포주기분석 결과와 같이 S기의 세포분포가 증가하는 것은 cyclin A/Cdk2 complex의 감소에 의해 S기에서 G2기로의 진행이 억제되어 나타난 결과일 것으로 사료되나 자세한 기전은 추후 연구가 필요할 것이다[4, 45].

Fig. 5.Effects of EESC on the expression of cell cycle-related proteins in HT29 cells. HT29 cells were treated with various concentrations of EESC for 24 h. The cells were lysed and cellular proteins were then separated by SDS-PAGE, followed by Western blot analysis using antibodies against S-G2/M transition-related proteins (A) and p53 and p21 (B). Actin was used as an internal control. Numerical bottom panel of each band indicates the fold change in the band intensity compared with that of control.

EESC의 G2/M arrest 유도 기전 분석

G2/M checkpoint의 중요한 단백질인 Cdc2는 인산화/탈인산화에 의해 그 활성이 조절되는데, Wee1 인산화효소에 의해 인산화되어 불활성화된 Cdc2는 Cdc25C 탈인산화효소에 의해 탈인산화되면서 활성화 형태가 된다[10, 33]. 또한 Cdc25C는 DNA damage에 의해 활성화되는 CHK1/CHK2 인산화효소에 의해 인산화될 때 불활성화된다. 이러한 Cdc25C는 Cdc25 family 중 하나로, 식도암, 직장암, 유방암 등 다양한 종류의 암세포에서 과발현이 관찰되며 이러한 Cdc25C의 발현억제는 M기로의 진행을 저해시켜 암세포의 성장을 억제한다는 보고가 있다[2, 30]. 앞서 EESC 처리에 의해 세포주기 관련 단백질인 Cdc2의 인산화가 증가되는 것을 확인하였으므로, EESC의 정확한 G2/M arrest 유도 기전을 분석하기 위하여 Cdc2의 활성을 조절하는 분자들의 단백질 발현 양상을 확인하였다. Fig. 6에서와 같이 Cdc2의 인산화를 일으키는 Wee1 kinase의 발현이 증가되고, Cdc25C의 발현은 감소하였다. 또한 Cdc25C의 불활성화를 일으키는 인산화는 증가되었으며, Cdc25C의 인산화를 유도하는 CHK2의 활성화 형태인 phospho-CHK2 발현도 증가되었다(Fig. 6). 이러한 결과들은 EESC 처리에 의해 CHK2가 활성화되고, 활성화된 CHK2가 Cdc25C를 인산화시켜 불활성화시키고, 따라서 Cdc2의 탈인산화에 의한 활성화가 억제되는 것을 시사한다. 반면 EESC 처리에 의해 증가된 Wee1 kinase는 Cdc2를 인산화시켜 Cdc2를 불활성화 시키고, 최종적으로 G2기에서 M기로의 세포주기진행을 저해하는 것이라 사료된다[11, 12, 38].

Fig. 6.Effects of EESC on the expression of upstream signal proteins leading to G2/M arrest in HT29 cells. EESC-treated cells were harvested and lysed, and the proteins were subjected to Western blot analysis using antibodies against Cdc25C, p-Cdc25C, Wee1, CHK2, and p-CHK2. Actin was used as an internal control. Numerical bottom panel of each band indicates the fold change in the band intensity compared with that of control.

현재 전세계적으로 증가하고 있는 암의 발병률 및 사망률에 비해 효과적이고 부작용이 적은 암 치료제의 개발은 아직도 부족한 실정이며, 따라서 기존의 항암제에 비해 효과적이며 암세포에 대한 특이성이 높은 새로운 작용기전의 항암제 개발의 요구가 대두되고 있다. 특히 세포주기 제어가 비정상적으로 작동되어 무한증식능력을 가지는 암의 특성을 고려하여, 세포주기조절 인자를 타겟으로 하여 세포주기조절 인자들의 활성을 제어함으로써 암세포화를 막는 치료법에 관해 많은 관심이 집중되고 있으며, 그를 위한 다양한 기전의 항암활성을 가지는 소재에 관한 연구개발이 활발하게 진행 중이다. 따라서 본 연구는 솔장다리 추출물의 뛰어난 항산화 및 항암활성을 확인하고 대장암세포의 세포주기 조절에 의한 항암기전을 해석하여, 새로운 기전의 항암활성 보유 소재의 개발을 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다. 또한 본 연구결과를 바탕으로 하여 나아가 동물실험 등을 통한 실질적인 솔장다리 추출물의 항암활성에 관한 연구도 지속되어야 할 것이다.

 

요 약

본 연구에서는 명아주과 수송나물속 솔장다리(Salsola collina Pall.) 추출물의 항산화 및 항암 활성을 분석하였다. 먼저 솔장다리의 에탄올 추출물의 DPPH radical scavenging activity를 분석한 결과, IC50가 4.82 μg/ml로 나타나 강한 항산화능을 보유하였음을 확인하였다. 또한 대장암 세포주(HT29), 폐암 세포주(A549), 간암 세포주(HepG2)를 사용하여 솔장다리 추출물의 암세포 사멸효과를 분석한 결과, IC50가 각각 43.8, 64.1, 92.5 μg/ml로 강력한 세포사멸효과를 나타냈으며 특히 HT29에 대한 강한 사멸효과를 보였다. 솔장다리 추출물의 항암 활성 기전 분석을 위해 세포주기를 분석한 결과, 대장암세포인 HT29의 G2/M arrest를 유도하였으며 최고 농도인 60 μg/ml까지 S기 세포수가 증가하였다. 세포주기관련 단백질의 발현 분석 결과, 솔장다리 추출물을 처리한 경우, G2기에서 M기로의 전이에 필수적인 단백질인 Cdc25C와 cyclin A의 발현이 감소되었고, 반면 Cdc25C와 Cdc2의 불활성화 형태인 p-Cdc25C, p-Cdc2는 증가하였다. 또한 p21과 Wee1의 발현도 증가되었다. 하지만 p53의 발현량은 변화가 없었다. 이러한 결과는 솔장다리 추출물을 처리한 경우, p53 비의존적으로 p21의 발현이 증가되어 cyclin A/Cdc2 complex의 활성이 조절되고, 이어서 G2/M phase의 check point에 작용하는 Wee1의 발현증가 및 Cdc25C, Cdc2의 인산화에 의한 불활성화를 통하여 G2/M arrest가 유도되는 것을 시사한다. 또한 솔장다리 추출물 처리에 의해 S기 진행을 조절하는 Cdk2의 발현량도 감소하여, cyclin A/Cdk2 complex가 감소되어 S기의 세포수가 증가한 것으로 보인다. 따라서 본 연구 결과를 통해 솔장다리 추출물이 높은 항산화 활성을 지니며 암세포의 세포주기를 조절하여 높은 항암 활성을 보유함을 확인하였다.