The Effect of the Hot Water Extract from Taraxacum coreanum Nakai on Hepatocarcinogenesis Induced by N-nitrosodiethylamine in Rats

흰민들레 열수추출물이 N-nitrosodiethylamine로 유발된 흰쥐의 간암 발생에 미치는 효과

Abstract

The present study was carried out to investigate the hepatoprotective effect of hot water extract of Korean white dandelion (Taraxacum coreanum Nakai) on liver cancer induced in rats by a single dose of N-nitrosodiethylamine (NDEA). The animals were divided into three groups. The animals in the normal (Nor) group were fed basal diet. Control (Con) group were administered with NDEA (200 mg/kg, i.p.). Hot water extract of Korean white dandelion (KDDA, KDDB) group treated with hot water extracts of Korean white dandelion (30, 60 mg/kg/day) for 8 weeks after NDEA. Serum AST and ALT were measured, enzyme activity of liver were examined by spectrophotometer and histological alternation of liver were examined by light microscopy. KDDA and KDDB group were decreased the increase of serum AST, ALT level induced by NDEA. The activities of SOD and CAT were significantly increased in KDDA, KDDB then in the Con. In the histological observation, KDDA and KDDB group were structure of liver lobula and nuclear shape was relatively cleared. In addition, the cytoplasm staining was similar to those of the Nor group. vacuolization of cytoplasm was not observed. These results suggest that administration of hot water extract of Korean white dandelion suppress or retard liver cancer induced by NDEA in rats.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 흰민들레는 2011년 4~5월 전라남도 나주와 화순 지역에 자생하는 것을 채집하여 조선대학교 이용보 교수님의 감정을 받아 실험에 사용하였다. 흰민들레는 선별하고 세척한 후 100 g을 균질기로 고속 2분, 저속 3분간을 3회 반복하여 조직을 파쇄하여 증류수 1 L를 가한 다음 75~80℃의 가열맨틀상에서 24시간 추출하였다. Filter paper(Whatman NO. 1)로 여과하여 여과된 여액을 감압 농축한 후 동결건조하여 얻어진 분말을 4℃ 냉장고에 보관하였다.

실험동물 −체중 210±10 g의 웅성 흰쥐(Sprague-Dawley strain)를 샘타코(오산, 대한민국)로부터 구입하여 온도 23±2℃, 습도 50±5%의 환경조건을 유지시킨 Animal cage(HB-404AS)에서 식이와 음용수를 제한없이 공급하면서 일주일간 적응시켜 사용하였다.

실험군 설정 및 시료 투여 −정상군(Nor)은 통상적인 사료와 물을 공급하였으며, 다른 군의 모든 실험동물은 Nnitrosodiethylamine(NDEA, Sigma Chemical Co., USA) 200 mg/kg을 0.9% 식염수 1 mL에 용해하여 1주 간격으로 2회 복강투여 하였다. 대조군(Con)은 간암이 유발된 후부터 식염수 0.5 mL을 실험기간 동안 매일 구강 투여하였다. 실험군은 NDEA을 투여한 2주 후부터 8주 동안 흰민들레 열수추출액 건조분말을 생리식염수 0.5 mL에 용해하여 각각 30, 60 mg/kg(KDDA, KDDB)을 구강 투여하였다.

혈청내 Transaminase 활성측정 −실험 24시간 전부터 절식시킨 흰쥐를 urethane으로 마취한 다음 개복한 후 심장에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 시험관에 넣어 실온에서 30분간 방치한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. Aspartate aminotransferase(AST)와 alanine aminotransferase(ALT)의 활성 측정은 자동분식기용 kit 시약(아산제약)을 사용하여 생화학자동분석기(photometer 5010, Germany)에서 측정하였다.

간 효소활성도 측정 −신속히 분리한 간을 증류수로 3회 세척한 후, sucrose buffer[0.25M sucrose, 1 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid)와 10 mM tris buffer(pH 7.4)]를 간조직 시료에 4배 용량으로 첨가하여 세절한 다음 균질액을 얻기 위하여 homogenizer(JANKE & KUNKEL, ULTRA-TURRAX T25, Germany)를 이용하여 4℃에서 균질화 하였다. 이 균질액을 10,000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 superoxide dismutase(SOD) 활성을 측정하기 위한 효소원으로 이용하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad assay를 이용하였으며, -70℃의 deep freezer에 보관하면서 실험에 이용하였다. SOD 활성도는 SOD assay kit(Dojindo, Japan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정후 SOD 활성도를 계산하였다. 또한 catalase 활성도 측정은 Aebi28)의 방법에 준하여 50 mM 인산칼슘 완충액(pH 7.0)에 10 mM H2O2와 추출액을 가한 후 240 nm에서 2분간의 흡광도 변화를 관찰하였다. 이때 1분 동안에 1 μM의 H2O2를 분해하는 효소의 양을 1 unit으로 하였다.

조직학적 관찰 −흰쥐의 간 조직을 적출하고 Bouin 용액을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100%로 ethanol 농도를 상승시켜 탈수한 다음 xylene으로 투명화 과정을 거친 후 paraffin으로 포매하였고, 포매된 조직은 microtome을 사용하여 5 μm 두께로 박절하였다. 조직 절편을 slide glass 위에 부착시키고 xylene으로 paraffin을 제거한 다음 100, 90, 80% ethanol 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 함수과정을 거쳤다. 일반적인 간조직의 변화를 관찰하기 위해 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하였고, 교원섬유의 관찰을 위하여 van Gieson 염색을 시행하였다. 그리고 Canada balsam으로 봉입한 후 카메라 부착 광학현미경(BX51, Olympus, Japan)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.

통계처리 −실험 결과는 Mean±SE로 표시하였고, 대조군과 실험군과의 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's test로 검정하여 p<0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

 

결과 및 고찰

혈청 중 효소의 변화 − AST와 ALT는 심장근과 간세포내에 있는 특성효소로서 조직세포의 손상에 의해 혈청 중의 활성도가 증가되어지며, 이러한 활성도의 상승은 간담도 질환, 심장질환에서 일어나고 특히 만성간염의 경우에는 현저하게 증가된다.29) 본 실험에서 AST의 활성은 대조군이 76±3.92 U/l으로 정상군 58±4.33 U/l에 비하여 유의적으로(*p<0.05) 증가하였으며, KDDA군은 63±1.76 U/l으로 나타나 대조군에 비하여 유의성(#p<0.05) 있게 감소하였다. 그러나 추출물 농도에 따른 KDDA와 KDDB의 차이는 보이지 않았다(Fig. 1). ALT의 활성은 대조군이 42±3.15 U/l인데 비하여 KDDA군에서는 33±3.33 U/l으로 활성도가 감소하였으나 유의성은 없었다. 추출물 농도에 따른 군들에서는 KDDB가 높게 나타났다(Fig. 2). 서양민들레의 뿌리 열수추출물을 40 mg/kg의 농도로 항원인 ovalbumin(OVA)과 혼합하여 생쥐에 2주 간격으로 2회 면역 주사한 후 면역계에 미치는 효과는 민들레 추출물 투여가 대식세포를 자극하여 cytokine의 생산을 증진시키고, IgG type의 항체 생산을 높여주었다.20) 흰민들레 열수추출물을 당뇨병모델생쥐에 20 mL/kg을 10주간 경구투여 하여 항당뇨 효과를 관찰한 결과에서 전초 열수추출물이 부위별 열수추출물 보다 췌장의 인슐린 분비세포를 활성화시킴으로써 혈당강하 효과를 나타내었다.30) 따라서 본 연구에서는 이러한 결과들을 참조하여 흰쥐에게 각각 30, 60 mg/kg의 경구투여 용량을 결정하였다.

NDEA로 간암을 유발한 흰쥐에 Terminalia arjuna Bark 에탄올 추출물을 투여한 연구에서 AST, ALT가 유의성 있게 감소하였다고 보고하였다.31) 또한 간암발생 쥐에 소엽실고사리의 효과에 대한 연구에서도 AST, ALT가 감소하였다고 보고하여32) 본 실험의 결과와 같았다. 이는 흰민들레 추출물 투여로 간 손상이 완화된 것으로 사료된다.

Fig. 1.Effects of Korean white dandelion extract on NDEAinduced AST activity in the liver of rats. Nor, fed basal diet; Con, administrated with NDEA only; KDDA and KDDB, administrated with NDEA and Korean white dandelion extract. Significant differences were compared with normal at *p<0.05. All values are mean±S.E(n=5).

Fig. 2.Effects of Korean white dandelion extract on NDEAinduced ALT activity in the liver of rats. Nor, fed basal diet; Con, administrated with NDEA only; KDDA and KDDB, administrated with NDEA and Korean white dandelion extract. Significant differences were compared with normal at *p<0.05. All values are mean±S.E(n=5).

간 효소활성도 −인간의 정상적 생리 상태는 free radical의 생성과 항산화 방어체계의 활성이 균형을 유지하지만 체내 free radical의 다량 생산 또는 항산화 방어체계의 기능감소가 일어나면 균형이 깨지고 산화적 스트레스가 증가한다.33) SOD는 체내의 대표적인 free radicaldls인 두 분자의 superoxide anion을 hydrogen peroxide와 oxygen molecule로 환원시키는 작용을 하는 효소이다.34) SOD 활성도는 정상군에 비하여 NDEA를 단독투여한 대조군이 통계적으로 유의성(*p<0.05)있게 감소되었지만, 흰민들레 열수추출물을 투여한 KDDA군과 KDDB군은 대조군에 비해 통계적으로 유의성(#p<0.05)있게 증가되었다(Table I). 흰민들레 잎의 75% 에탄올 추출물에서 SOD의 유사활성을 측정한 결과 높은 활성을 보였으며 노랑민들레와 한약재로 사용하는 약용식물인 백지, 곽향, 익모초, 소엽, 작약의 SOD 유사활성보다 높은 수준으로 나타났다고 보고하였다.35) 흰민들레와 서양민들레 추출물의 SOD 활성을 비교한 연구에서 흰민들레의 SOD의 활성이 더 높은 결과를 얻었고,21) 수은으로 유발된 간독성에 대한 흰민들레 추출물의 보호 효과에 대한 연구에서 흰민들레 투여군에서 역시 SOD 활성이 감소하였다.36) 흰민들레 에탄올 추출물과 분획물의 SOD 유사활성 측정 결과 에탄올 추출물이 가장 높은 활성을 보였다고 하였다.37) 이와 같이 NDEA 투여군에 비해 흰민들레 열수추출물 투여군들의 활성이 높았으나 KDDA, KDDB군의 SOD 활성이 정상군에 비해 다소 높게 나타나는 것은 민들레 추출물의 대사로 인해 free radical의 생성이 감소하여 유도하지 않은 것으로 사료된다.

Table I.KDDA: NDEA + Korean white dandelion extract (30 mg/kg). KDDB: NDEA + Korean white dandelion extract (60 mg/kg). SOD – Unit/mg protein. CAT – Unit/mg protein/min. Values are expressed as mean±SD of five rats in each group. Significant differences were compared with normal/control at *p<0.05/#p<0.05.

조직내에서 SOD의 효소적 반응에 의해 생산된 H2O2를 H2O와 O2로 분해하는 효소 중 하나가 catalase이다. 이것은 H2O2 증가에 따른 조직손상을 방어하는 효능이 있다고 알려져 있다.38,39) 본 실험에서 catalase의 활성을 측정한 결과 정상군에 비하여 대조군에서 유의적(*p<0.05)으로 낮게 나타났으며, KDDA군과 KDDB군은 대조군에 비하여 유의적(#p<0.05)으로 증가하였다(Table I). 0.02% NDEA로 유발된 간독성에 Elephantopus scaber 메탄올 추출물을 100, 200 mg/kg 투여한 연구에서 catalase가 79, 55%의 회복을 보였고,40) 수은 투여군보다 흰민들레 추출물 투여군에서 catalase활성이 증가하였다.36) 그러나 KDDA와 KDDB는 정상군에 비하여 활성이 증가하였는데 이러한 결과는 SOD의 작용에 의해 생성된 과산화수소를 분해하기 위해 catalase의 활성이 증가한다41)는 보고와 연관이 있을 것으로 사료된다.

Fig. 3.Histological sections on the effects of Korean white dandelion extract in the liver injury of rats induced by NDEA. A, Normal group; B, Control group administered NDEA; C, Korean white dandelion extract (30 mg/kg/day) administered group; D, Korean white dandelion extract (60 mg/kg/day) administered group. Hematoxylin-Eosin stain. Original magnification ×200.

조직학적 관찰 −간조직의 광학현미경적 관찰 결과는 정상군의 간 조직은 뚜렷한 둥근 핵을 갖고 있었고 세포질은 거의 일정하게 eosin으로 염색되었으며, 간소엽의 구조도 잘 배열되어 있었다(Fig. 3A). NDEA를 단독투여한 대조군은 간소엽의 구조 및 핵의 형태가 불완전하고, 일부에서 세포질 공포화가 유발된 것을 관찰할 수 있었으며, 이로 인해 세포질의 염색성은 정상군과 KDDA군보다 현저히 감소되었다(Fig. 3B). 그러나 흰민들레 열수추출물을 투여한 KDDA, KDDB군들은 간소엽의 구조가 비교적 잘 유지되어 있었고, 핵 형태가 비교적 뚜렷하였다. 또한, 세포질의 염색성은 정상군과 유사하게 관찰되었으며 세포질의 공포화 현상은 관찰되지 않았다(Fig. 3C, D). 수은으로 유도된 간손상의 실험에서 수은 투여군에서 간 손상의 가장 두드러진 특징은 간세포의 팽대성 증가와 세포질 공포화 그리고 공포 형성의 유도였으나 흰민들레 추출물 투여 후 간 조직은 비교적 정상군과 유사하게 관찰되었으며,36) 0.02% NDEA로 유발된 간독성에 Elephantopus scaber 메탄올 추출물을 100, 200 mg/kg 투여한 연구에서 NDEA 투여로 간조직의 중심 정맥 지역의 많은 피해, 불규칙적인 세포판 형성, 전지역의 괴사 조직이 나타났으나 E. scaber 메탄올 추출물 투여후 균일한 세포판과 정상 간세포의 모양을 보여 간 독성의 보호효과에 대하여 보고하였다.40) NDEA와 사염화탄소를 투여한 후 인진호탕 추출액을 투여한 연구에서 본 실험의 결과와 일치하였다.42) 또한 간 손상으로 인한 간섬유화 정도를 확인한 결과 정상군 간세포에서는 교원섬유에 대한 반응성을 보이는 섬유가 관찰되지 않으나(Fig. 4A) NDEA를 단독투여한 대조군의 간세포에서는 혈관주변으로 강한 반응성을 보였고(Fig. 4B), 흰민들레 열수추출물을 투여한 KDDA, KDDB군들의 간세포에서는 약한 반응성을 보이는 교원섬유들이 관찰되어(Fig. 4C, D) 흰민들레 열수추출물이 NDEA로 인한 간섬유화를 방어해주는 효과가 있는 것으로 사료된다.

Fig. 4.Liver histological assessment by van Gieson staining. A: Normal group; B: Control group administered NDEA; C: Korean white dandelion extract (30 mg/kg/day) administered group; D: Korean white dandelion extract (60 mg/kg/day) administered group. Original magnification ×200.

위의 결과를 종합하여 볼 때 간암 유발된 쥐에 흰민들레를 투여한 결과 AST, ALT가 감소하였고, SOD와 CAT 활성도 증가하였으며 조직학적 변화도 완화되었다. 이는 흰민들레 추출물이 간암을 치료하는 효과가 있는 것으로 사료되며, 이에 따라 치료 뿐만 아니라 예방학적인 분야에 대해서도 연구가 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.

 

결 론

본 연구는 N-nitrosodiethylamine(NDEA)으로 유발된 간암에 대한 흰민들레 열수추출물의 효과를 알아보고자 하였다. 실험군은 정상군(Nor), 대조군(Con), 흰민들레 열수추출물 투여군으로 분류하였다. 정상군은 일반적인 식이를 공급하였고, 대조군은 NDEA를 투여하였고, 흰민들레 열수추출물 투여군(KDDA, KDDB)은 NDEA을 투여한 2주 후부터 8주 동안 각각 열수추출물 30, 60 mg/kg을 구강 투여하였다. 혈액 중 AST와 ALT의 수치는 흰민들레 열수추출물 투여군에서 감소하였다. 또한 superoxide dismutase(SOD)와 catalase 같은 항산화제 효소를 측정한 결과 흰민들레 열수추출액을 투여한 군에서 증가하였다. 간 조직의 광학현미경적 관찰에서는 간소엽의 구조가 비교적 잘 유지되어 있었고, 핵 형태가 비교적 뚜렷하였다. 또한, 세포질의 염색성은 정상군과 유사하게 관찰되었으며 세포질의 공포화 현상은 관찰되지 않았다.

이상의 연구 결과로 보아 흰민들레 열수추출물의 투여가 NDEA로 유발된 흰쥐의 간암을 억제 또는 지연하는 것으로 사료되며, 흰민들레에 대한 다양한 연구가 필요한 것으로 사료된다.