The Protective Effects of Protocatechuic Acid from Momordica charantia against Oxidative Stress in Neuronal Cells

여주 활성 물질 Protocatechuic Acid의 신경세포의 산화적 스트레스에 대한 개선 효과

Abstract

Protocatechuic acid is an active phenolic acid compound from Momordica charantia. In this study, we investigated the protective effect of protocatechuic acid against oxidative stress under cellular system using C6 glial cell. The oxidative stress was induced by hydrogen peroxide ($H_2O_2$) and amyloid beta 25-35 ($A{\beta}_{25-35}$), and they caused the decrease of cell viability and overproduction of reactive oxygen species (ROS). However, the treatment of protocatechuic acid significantly elevated the decreased cell viability and inhibited the overproduction of ROS by $H_2O_2$. In addition, protocatechuic acid significantly recovered the cellular damage induced by $A{\beta}_{25-35}$. In particular, protocatechuic acid at the concentration $10{\mu}g/mL$ decreased the elevated ROS level to normal level. These results indicate that protocatechuic acid may have neuroprotective effect through attenuating oxidative stress.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용한 여주(Momordica charantia)는 함양(Hamyang, Korea)에서 구입하여 음건한 후 사용하였다. 실험에 사용된 protocatechuic acid는 여주의 주요성분중의 하나이며,10) Sigma(Sigma St. Louis, MO, USA)사 에서 추가 구입하여 실험에 사용하였다.

추출 −여주 100 g을 메탄올로 추출하여 메탄올 추출물로 만들어 실험에 사용 하였다.

세포 종류 및 시약 −실험에 사용한 C6 glial cell은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, South Korea)에서 분양 받았으며 배양을 위한 100 units/mL의 penicillin streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM) 배지(Welgene, Daegu, South Korea)를 사용하였다. 산화적 스트레스를 유발 시키기 위한 H2O2는 Junsei(Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan)사 제품을, Aβ25-35는 Sigma사 제품을 사용하였다. 세포생존율과 ROS 생성률 측정을 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO)와 2'7'-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)는 Sigma사 제품을 구입하였다.

세포배양 − C6 glial cell은 100 units/mL의 penicillin streptomycin과 10% FBS가 첨가된 DMEM배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 2~3일에 한번 배지를 교환하면서 배양하여 세포증식이 최대에 도달하였을 때 phosphate buffered saline으로 세척한 후 0.05% trypsin과 0.02% EDTA 혼합액을 이용하여 세포를 분리한 후 원심분리하여 세포를 집적시킨 다음 세포에 배지를 넣고 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 계대배양 하며 사용하였다.

Cell Viability 측정 −세포가 flask에 80-90%의 confluence 상태가 되면 5×104 cells/mL로 seeding하여 세포를 부착시킨 후 산화적 스트레스를 유발하기 위해 H2O2(100 μM)와 Aβ25-35(25 μM)를 첨가하여 배양한 뒤 시료를 처리하여 24시간 후 5 mg/mL의 MTT solution을 각 well에 주입하여 37℃에서 4시간 재배양 한 후 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.24)

ROS 생성률 측정 −세포가 confluence 상태가 되면 black 96 well plate를 이용하여 5×104 cells/mL로 seeding하여 2시간 동안 37에서 배양하였다. 세포 부착이 잘 이루어 지면 H2O2(100 μM)를 및 Aβ25-35 (25 μM)를 처리하여 24시간 배양하여 산화적 스트레스를 유발 시킨 후 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 뒤 80 μM의 DCF-DA용액을 각 well에 주입하여 37℃에서 30분 동안 재배양 한 후 FLUOstar OPTIMA(BMG labtech, Ortenberg, Germany)에서 excitation-480 nm, emission-535 nm로 측정하였다.25)

통계 분석 −각 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, SAS 4.3을 이용하여 실험 결과로부터 ANOVA(analysis of variance)를 구한 후 Dancan's multiple test(P<0.05)를 이용하여 각 군의 평균간의 유의성을 검정하였다

 

결과 및 고찰

H2O2는 산소를 이용하는 생체의 대사 산물로 biological membrane를 자유롭게 통과하며 모든 세포의 조직에 apoptosis와 necrosis를 일으켜 세포 손상을 가져오는 산화제이다.26) 또한 H2O2는 구리나 철 이온 등과 Fenton반응에 의해 hydroxyl radical로 전환되어 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상, 지질과산화, 혈뇌장벽의 파괴 등을 일으키는 생체 독성 물질이다.27,28) 특히, 이런 산화적 스트레스는 신경세포의 사멸을 일으켜 신경퇴행성 질환의 원인이 된다. 따라서 H2O2는 in vitro에서 산화적 스트레스에 의한 신경퇴행성질환의 원인을 연구하기 위한 중요한 물질이다.29)

H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경 세포보호효과를 알아보기 위해 C6 glial cell을 이용하여 MTT assay를 시행하였다. 세포생존율 측정 결과, 정상군의 세포생존율을 100%로 보았을 때 H2O2를 처리한 control군의 경우 65.50%로 감소하여 산화적 스트레스에 의한 손상을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 여주 활성물질인 protocatechuic acid를 농도별(5, 10, 50 μg/mL)로 처리하였을 때 control군에 비해 유의적으로 세포생존율이 증가하였으며, 특히 10 μg/mL의 농도에서 80%이상의 높은 생존율을 보여 H2O2에 의한 세포 손상에 대한 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경 세포보호효과를 알아보기 위해 C6 glial cell을 이용하여 MTT assay를 시행하였다. 세포생존율 측정 결과, 정상군의 세포생존율을 100%로 보았을 때 H2O2를 처리한 control군의 경우 65.50%로 감소하여 산화적 스트레스에 의한 손상을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 여주 활성물질인 protocatechuic acid를 농도별(5, 10, 50 μg/mL)로 처리하였을 때 control군에 비해 유의적으로 세포생존율이 증가하였으며, 특히 10 μg/mL의 농도에서 80%이상의 높은 생존율을 보여 H2O2에 의한 세포 손상에 대한 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Fig. 1.Effect of protocatechuic acid on cell viability of C6 glial cell treated with H2O2. Values mean ± SD. a-cMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

오랜 전부터 ROS 검출에 사용되어지고 있는 DCF-DA는 세포막을 자유롭게 통과 할 수 있고 esterase에 의해 acetate group이 제거되어 세포 내에서 DCFH가 된다. 이 DCFH는 H2O2와 같은 ROS에 의해 산화되어 강한 형광성을 가지는 DCF가 되는 원리를30) 바탕으로 H2O2를 처리하여 C6 glial cell에서의 활성산소종 억제효과에 대해 알아보았다. ROS의 경우 정상적인 세포의 활동에 의해서 자연적으로 생성됨으로1) 시간이 지남에 따라 모든 군에서 ROS 생성량은 증가하지만 산화적 스트레스를 유도한 control군의 경우 초기에 생성된 ROS자체가 많은 것을 알 수 있다(Fig. 2A). 실험 종료 시간 60분을 기준으로 control군의 ROS 생성량을 100%로 보았을 때 protocatechuic acid을 처리한 군은 control군에 비해 ROS 생성량이 감소한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2B). 따라서 protocatechuic acid는 H2O2에 의한 세포 산화에 대한 세포 보호 효과와 활성산소종의 생성을 억제하거나 제거함으로써 신경세포에 사멸에 대한 보호 효과를 가지는 것으로 생각된다.

Amyloid beta(Aβ)는 40-42개의 아미노산 peptide로 정상적인 인체에서 소량씩 만들어지나 빠르게 분해되어 쌓이지 않지만 AD환자의 경우 Aβ의 비정상적인 과생성으로 인해 amyloid plaque가 형성되어 뇌 속에 축적되어 있다. 이 plaque들은 뇌세포에 세포독성을 가지고 있어 결국에는 뇌세포 사멸에 의한 AD를 유발하게 된다.31) 특히 Aβ25-35는 산화적 스트레스 매개성 뇌손상으로 인한 hippocampal 변화를 유발하고 신경세포사를 유발시키는 독성 물질로 알려져 있으며32) Aβ를 in vitro상에서 신경세포에 처리하였을 때 신경세포사를 유도하며 세포사를 일으키는 기전이 AD환자에게 나타나는 유형과 유사하다는 보고들이 있다.33,34) 또한 PC12 cell에 Aβ25-35(25 μM)를 처리하였을 때 세포생존율이 감소되었고 ROS의 양은 증가하였으며, PARP의 cleavage를 일으키고 Bax/Bcl-XL의 비율을 증가시켜 세포 사멸을 유도한 것을 확인한 결과가 있다.35) 따라서 C6 glial cell에 Aβ25-35(25 μM)를 처리하여 산화적 손상에 대한 protocatechuic acid의 신경세포 보호 효과에 대해 알아보았다. Aβ25-35를 처리하여 세포사멸을 유도한 control군은 normal군 100%에 비해 50.13%로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 protocatechuic acid를 농도별로 처리한 결과 모든 농도에서 control군 보다 유의적으로 높은 세포생존율을 보였으며, 특히 농도 10 μg/mL의 농도에서 65.73%의 가장 높은 세포생존율을 보였다(Fig. 3). 또한 DCF-DA assay를 통한 ROS 생성억제 및 제거율을 측정한 결과 유의적으로 우수한 ROS생성 억제율을 보였다. 특히, protocatechuic acid 10 μg/mL의 농도에서 normal군 수준으로 감소됨을 확인하였다(Fig. 4). 따라서 protocatechuic acid는 Aβ25-35에 의해 유도된 산화적 스트레스와 ROS에 대한 신경세포 보호 효과를 나타내어 신경세포 사멸에 영향을 미치는 인자들로부터 신경세포를 보호하는 작용이 있을 것으로 사료된다.

Fig. 2.Effect of protocatechuic acid on level of ROS in C6 glial cell treated with H2O2 (A: Time course of change in intensity of ROS fluorescence with the protocatechuic acid, B: The production of ROS treated with the protocatechuic acid). Values mean ± SD. a-eMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

Fig. 3.Effect of protocatechuic acid on cell viability of C6 glial cell treated with Aβ25-35. Values mean ± SD. a-dMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

Fig. 4.Effect of protocatechuic acid on level of ROS in C6 glial cell treated with Aβ25-35 (A: Time course of change in intensity of ROS fluorescence with the protocatechuic acid, B: The production of ROS treated with the protocatechuic acid). Values mean ± SD. a-dMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

 

결 론

본 연구에서는 C6 glial cell을 이용하여 여주(Momordica charantia)의 활성물질인 protocatechuic acid의 산화적 스트레스에 의한 신경세포 보호효과에 대해 알아보았다. 산화적 스트레스를 유발하기 위해 H2O2를 처리한 결과 protocatechuic acid는 모든 농도에서 유의적으로 세포생존율을 증가시켰으며, ROS생성을 억제시키는 것을 알 수 있었다. 또한 AD의 원인물질로 알려져 있는 Aβ25-35를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였을 때 유의적으로 세포생존율의 증가와 ROS 생성을 억제함을확인 할 수 있었다. 이는 여주의 phenolic acid 구성물질인 protocatechuic acid가 신경세포 손상에 강력한 영향을 미치는 H2O2와 Aβ25-35로부터의 산화적 스트레스를 개선함으로써 신경세포 손상에 대한 보호효과가 있음을 보여준다.