Screening of Korean Herbal Medicines with Inhibitory Effect on Aldose Reductase (IX)

한국 약용식물 추출물의 알도즈 환원 효소 억제 효능 검색(IX)

Abstract

Aldose reductase (AR) has been demonstrated to play important role in the development of the diabetic complications such as diabetic retinopathy, diabetic neuropathy and diabetic nephropathy. To discover novel treatments for diabetic complications from natural sources, 69 Korean herbal medicines have been investigated for inhibitory activities on AR. Among them, 7 herbal medicines, Eleutherococcus sessiliflorus (stems), Artemisia japonica (whole plants), Wisteria floribunda (leaves), Eurya japonica (stems, twigs and leaves, leaves), Ampelopsis brevipedunculata (stems) exhibited a significant inhibitory activity compared with 3,3-tetramethyleneglutaric acid as positive control.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 한국산 약용식물들(Table I)은 가천대학교 김주환 교수팀에 의해 국내에서 채집되었으며, 동정을 거친 후 실험에 사용하였다. 증거표본은 한국한의학연구원 한약연구본부 한의신약연구그룹 표본실에 보관중이다.

Table I.Inhibitory effect of extracts from Korean herbal medicines on the activities of aldose reductase

Table I.IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.

추출 및 시료조제 − 분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P2O5 를 이용하여 24시간 이상 재건조한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며 최종 DMSO의 농도가 0.2%가 되도록 15% TWEEN 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급 시약을 사용하였다.

In vitro에서 알도즈 환원 효소 억제 실험 − Sprague-Dawley rat(250-280 g)의 수정체로부터 aldose reductase를 Dufrane15) 방법으로 분리하였다. 150 mM sodium phosphate buffer(pH 6.2)와 10 mM 2-mercaptoethanol을 적출한 수정체와 함께 분쇄하여 14,000 rpm에서 30분 간 원심 분리한 다음 상층액을 0.22 μm의 filter로 여과하였다. 효소의 단백질은 bovine serum albumin을 표준으로 이용하여 Bradford16) 방법으로 정량하였다. 150 mM sodium phoshate buffer(pH 6.2), 0.15 mM NADPH, 10 mM DL-glyceraldehyde와 700 μg/ml 효소 혼합액에 0.5% DMSO에 녹인 시료를 가하여 최종용액을 1 ml로 한 뒤 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이때 시료의 IC50값을 구하기 위해 0.5, 1, 2.5, 5, 10 μg/ml의 5개 농도에서 실험하였으며, 공시료는 10 mM DL-glyceraldehyde를 첨가하지 않았다. 표준액은 시료 대신 0.5% DMSO가 들어가도록 하였다. 0.15 ml의 0.5 N HCl을 첨가하여 반응을 종료시킨 뒤, 10 mM imidazole이 첨가된 6M NaOH 0.5ml을 가하여 60℃에서 15분간 반응시켜 NADPH가 NADP로 전환되는 것을 Spectrofluorometric detector로 (Ex. 360 nm, Em. 460 nm) 측정하였다. 모든 시료는 triplicate로 수행하여 IC50값으로 나타냈다. Aldose reductase inhibitor로 알려진 3,3-tetramethyleneglutaric acid17)를 양성대조군으로 택하여 효능을 비교하였다.

 

결과 및 고찰

천연물로부터 알도즈 환원효소 억제 약물을 검색하기 위해 한국산 69종의 에탄올 추출물을 이용해 효능을 검색하여 Table I과 같은 결과를 얻었다.

Table I에서 보여주는 것과 같이 양성대조군인 3,3-tetramethyleneglutaric acid의 IC50 값(1.23±0.01 μg/ml)을 기준으로 알도즈 환원 효소 억제 효능을 판단하였다. 이 중 Eleutherococcus sessiliflorus의 줄기(2.59±0.11 μg/ml), Artemisia japonica의 전초(3.45±0.37 μg/ml), Wisteria floribunda의 잎 (4.11±0.04 μg/ml), Eurya japonica의 줄기(1.71±0.15 μg/ml)와 가지와 잎(4.34±0.03 μg/ml), 잎(4.06±0.07 μg/ml), Ampelopsis brevipedunculata의 줄기(4.77±0.06 μg/ml)의 7종이 IC50< 5 μg/ml으로 효능이 가장 뛰어났다. 두릎나무과의 E. sessiliflorus의 잎은 α-glucosidase와 α-amylase 활성 저해 효과를 통한 혈당강하 효과, streptozotocin(STZ)으로 당뇨를 유도한 모델에서 혈당 감소와 혈중 콜레스테롤의 함량 감소의 효과를 보여 혈당강하 및 당뇨대사 이상으로 인한 지질대사의 개선에 효과적인 것으로 보고되었다.18) 열매로부터 분리한 페놀 화합물이 항산화 활성을 나타내며,19) 농약의 일종인 dieldrin에 의해 DNA와 세포가 손상되는 것을 억제시킨다고 보고되었다.20) 또한 HepG2 간암세포의 증식과 DNA 합성을 억제하여 항암효과가 있다고 보고되었다.21) 항염증사이토카인을 촉진시켜 항허혈 효과가 있다고 보고되었고,22) 신경병리성 통증 모델에서 E. sessiliflorus가 진통효과가 보고되었다.23) 국화과의 A. japonica에서 분리한 물질들은 항산화활성이 있다고 보고되었다.24) 콩과의 W. floribunda의 꽃은 항산화 효과가 있으며,25) 과일 껍질은 platelet-derived growth factor(PDGF)유도된 vascular smooth muscle cell(VSMC)의 생존을 억제해 폐쇄성혈관질환을 완화효과를 나타내었다.26) 또한 CD44 발현을 억제하고 GTP-RhoA 활성을 촉진시켜 B16F1 흑색종 암세포의 활성을 억제시킨 연구가 보고되었다.27) 차나무과의 E. japonica의 잎은 phenol과 flavonoid 성분을 함유하고 있으며 이러한 성분들이 항산화 효과를 나타내는 것으로 보고되었다.28) 또한 본 연구팀의 연구 결과 E. japonica의 줄기가 최종당화산물의 생성을 저해한다는 보고에 뒷받침되어 당뇨합병증의 예방에 효과가 있다고 보고되었다.29) 포도과의 A. brevipedunculata의 줄기와 뿌리는 산화스트레스를 억제하여 항산화 효과가 있다고 보고되었다.30) 또한 A. brevipedunculata의 줄기가 최종당화산물의 생성을 저해에 뛰어날 효능이 있는 것으로 본 연구팀 의 보고에 나타났다.31) 최근 reactive oxygen species(ROS)가 당뇨병의 발병 및 합병증 발생에 중요한 요인 중 하나로 여겨지고 있다.32) 폴리올 경로의 알도즈 환원 효소가 ROS를 생성에 관여하여 산화 스트레스를 유발하는데 위 9종의 추출물들이 ROS 생성을 억제한다는 연구가 많이 보고 된 것으로 보아 당뇨합병증의 예방 및 치료에 도움이 되는 것으로 사료된다. 본 연구 결과는 안전하고 우수한 알도즈 환원 효소 억제제 후보 물질 발굴을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 당뇨합병증 예방 및 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

 

결 론

69종의 한국산 약용식물 에탄올 추출물을 in vitro에서 알도즈 환원 효소 억제활성 검색하였다. 그 결과 E. sessiliflorus의 줄기, A. japonica의 전초, W. floribunda의 잎, E. japonica의 줄기, 가지와 잎, 잎, A. brevipedunculata의 줄기 7종이 IC50<5 μg/ml으로 뛰어난 알도즈 환원 효소 활성 억제 효능을 나타냈다.