Effects of Osteoblast Differentiation via C2C12 Cell by Rice Bran Ethyl acetate Fraction

미강 에틸아세테이트 분획물의 C2C12세포를 통한 조골세포 분화 효과

Abstract

In this study, we investigated pharmacologic activity of rice bran ethyl acetate fraction (RBE), based on their osteoblast enhancing effects. It has been found that REB have a stimulatory effect on the commitment of bi-potential mesenchymal precursor C2C12 cells into osteoblasts in the presence of BMP-2. Furthermore, RBE enhanced the BMP-2-stimulated induction of ALP, an early phase biomarker of osteoblast differentiation. In addition, Western blot analysis showed RBE enhanced the BMP-2-stimulated phosphorylation of p38, but not those of ERK or JNK. These findings show RBE has the potential to enhance the BMP-2-mediated commitment of C2C12 cells into osteoblasts and their differentiation through p38 activation.

재료 및 방법

실험 재료 −본 실험에 사용된 미강은 경기도 포천의 식물나라에서 공급받아 삼육대학교 약학대학의 임동술 교수가 감별하여 사용하였고 실험실에 표본을 보관중이다. 총 시료 8 kg을 80% EtOH에 4시간씩 3회 water bath에서 중탕으로 추출하여 감압농축한 후 EtOH extract를 1,787 g수 득하였다. 이중 1,700 g의 EtOH extract에 적당량의 증류수를 넣고 동량의 n-hexane, EtOAc, 그리고 BuOH으로 순차적으로 분획하여 얻은 각 분획물 가운데 예비실험을 한 결과 가능성을 확인한 에틸아세테이트 분획물을(RBE) 조골세포 분화촉진능 측정 실험의 재료로 사용하였다. 검체는 농축된 RBE분획물을 DMSO용매에 녹여 phosphate buffered saline(PBS)용액을 사용하여 1, 3, 10, 30 그리고 100 μg/ml로 실험에 사용하였다.

조골세포의 분화 − C2C12 cell은 10%의 FBS와 100 U/ml의 penicillin, 100 μg/ml의streptomycin을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 96-well plate에서 4×103 cells/well로 분주하여 24시간 incubation 시킨 후, 세포들을 분화 배지(5% FBS, 100 ng/ml의 rhBMP-2를 포함하는 DMEM 배지)로 교체하여 세포들을 분화시켰다. 배지는 3일마다 바꿔주었다. 본 실험에서는 6일간의 세포 분화 후 실험에 사용하였다.

세포 독성 검사 − C2C12 세포들은 96 well plate에 4×103 cells/well의 농도로 분주하였다. 24시간 후, 세포들을 단계 희석된 RBE를 포함하는 DM배지에서 6일 동안 배양하였다. 세포 성장은 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Moleculer Technologies, MD)을 사용하여 3번의 실험으로 평균을 내서 측정하였다. 흡광도는 Wallac EnVision microplate reader(Perkin Elmer)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

ALP 활성 측정 −성숙한 조골세포를 시각화하여 확인하고자 조골세포 분화의 biomarker로서 ALP를 이용하였다. C2C12 세포들은 96-well plate에 4×103 cells/well의 농도로 분주한 후 24시간 동안 incubation시켰다. 그 후 배지를 5% FBS와 100 ng/ml rhBMP-2를 포함하는 DMEM배지로 바꿔 주었다. 배지는 3일마다 교체하였다. 6일이 지난 후, 세포들을 PBS을 사용하여 2번 세척 후, 3.7%의 formaldehyde로 30초 동안 세포를 고정시켰다. 그리고 탈이온수로 씻어 내린 후 직사광선을 피해 ALP kit (Sigma, LA, USA)을 사용하여 염색하였다. UMAX Power Look 1100 (UMAX, Taiwan)으로 염색된 이미지를 스캔하고, DP70 digital camera (Olympus Optical, Japan)으로 캡쳐하였다. 이미지는 DP controller가 장착된 현미경으로 현상하였다.

Western Blot 분석 − C2C12 세포를 RIPA buffer용액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Tween-20, 0.2% NP-40, 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 100 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 protease inhibitor cocktail tablet (Roche, Germany)]을 사용하여 세포를 용해하였다. 4℃, 10,000×g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 단백질 분획으로 사용하였다. 단백질은 BCA-protein assay kit (Pierce, IL, USA)를 사용하여 정량하고 30 μg의 단백질을 5×SDS sample buffer와 함께 5분간 끓이고 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동한 후, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, CA, USA) 으로 transfer하였다. 전이시킨 membrane을 5% 탈지분유로 blocking하고 희석된(1:1000) 1차 항체를 처리하였다. 사용된 항체는 p38 (Santa Cruz, CA, USA), p-p38 (Cell Signaling, MA, USA), ERK1/2 (Cell Signaling), p-ERK1/2(Cell Signaling), p-JNK (Santa Cruz), JNK (Santa Cruz)이며 4℃에서 overnight하여 반응시켰다. 2차 항체로는 horseradish peroxidase가 결합된 항체(Santa Cruz)를 희석(1:2000) 처리하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce)를 처리하여 막을 전개시킨 후 LAS-3000 luminescent image analyzer (Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan)에서 측정하였다. 상대적인 단백질 발현량은 chemiluminescence (ECL, kit, Amersham, UK) 분석기를 이용하여 분석하였다.

통계 분석 −각각의 실험은 3회 이상의 반복 수행하였으며 평균(M) ± 표준편차(SD)로 표시 하였다.

 

결 과

세포독성 효과 −예비실험 결과 조골세포 분화 촉진능의 가능성이 확인된 미강의 EtOAc fraction인 RBE의 세포독성을 평가하기 위하여 C2C12를 이용하여 CCK-8 assay 를 한 결과 전 농도에서 92% 이상의 세포가 생존한 것으로 보아 실험에 사용한 최고 농도인 100 μg/ml 농도까지는 세포독성이 없는 것으로 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1.Cytotoxicity of RBE in C2C12 cells. C2C12 Cells (4×103 cells/well) were cultured in a 96-well plate for 1 day and then the medium was replaced with DMEM containing 5% FBS and rhBMP-2 (100 ng/mL) in the presence or absence of RBE (differentiation day 0). Medium was changed every 3 days. Cell viability assay was then performed on the differentiation day 6.

ALP 활성 − ALP는 거의 모든 조직에 존재하며 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다. RBE가 MSCs (C2C12 cells)이 preosteoblast 로 분화하는데 미치는 효과는 ALP staining과 조골세포분화에 연관된 유전자의 발현수준을 측정하는 것을 통해 확인하였다. RBE는 실험에 사용한 1~100 μg/ml 농도 범위에서 유의성 있게 BMP-2로 인해 자극된 ALP유도를 증가시켰다(Fig. 2).

Fig. 2.Effect of RBE on the enhancement of ALP activity in BMP-2-stimulated C2C12 cells. RBE enhanced BMP-2-induced osteoblast differentiation in C2C12 cells. Effect of RBE on BMP-2-stimulated ALP induction. On the differentiation day 6, ALP staining and its activity assay were performed as described in “Materials and methods”.

ALP유도증가에 대한 p38 신호전달경로의 관련성 −최근 보고된 연구 결과에 따르면 PI3K의 하위 신호전달 분자인 Akt와 MAPK의 신호전달경로가 BMP-2 유전자 발현의 활성화에 중요한 역할을 한다22)는 것을 보여주고 있다. 따라서 RBE에 의한 ALP유도증가의 신호전달경로를 확인하기 위해 ALP유도증가를 억제하는 물질을 처리하고 RBE의 효과를 ALP 활성 측정을 통하여 확인하였다. RBE에 의한 ALP유도 증가효과는 p38 inhibitor에 의해 강하게 억제되는 것으로 나타났다. 하지만 PI3K나 MEK에 대한 inhibitor는 억제효과를 보이지 않았다(Fig. 3). RBE에 의한 ALP유도증가에 대한 MAPK의 신호전달경로의 관련성은 western blot 을 통해 확인하였다. rhBMP-2처리는 RBE 농도 의존적으로 p-38의 인산화수준을 증가시켰지만 JNK나 ERK에 대해서는 그렇지 못했다(Fig. 4). 이는 p38이 BMP의 하위 신호전달에 관련된 분자임을 보여주는 결과이다.

Fig. 3.Effect of RBE on MAPKs inhibitor in BMP-2-stimulated C2C12 cells. Involvement of p38 in the RBE-induced enhancement of BMP-2-stimulated ALP induction. Cells (4×103 cells/well) in a 96-well plate were treated with each inhibitor for 2 h and then BMP-2 and/or RBE were added into cells. After 3 days, cells were treated with each inhibitor for 2 h and then BMP-2 and/or RBE were added into cells. On the differentiation day 6, ALP staining and its activity assay.

Fig. 4.Effect of RBE on MAPKs activity in BMP-2-stimulated C2C12 cells. The effects of RBE on the activation of MAPK was evaluated by Western blot analysis. Cells (4×103 cells/well) were cultured in a 96-well plate for 1 day and then cells were incubated with DMEM containing 5% FBS in the presence or absence of BMP-2 and/or RBE for 15 min.

 

고 찰

골은 세포군과 그 주변의 골기질로 이루어져 있으며 골조직을 이루는 세포중의 하나인 조골세포는 골조직의 골기질을 합성, 분비하고, 기질에 Ca, Mg이온 등의 무기염을 침착시킴으로써 골조직을 석회화시키는 능력을 갖고 있는 세포이다. 조골세포의 형성과정은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에서 유래하며 초기에 전조골세포(preosteoblast)로 분화하여 뼈의 무기화에 필수적인 조골세포(osteblast)로 성숙된 후 석회화기의 과정을 거쳐 골을 형성한다.23) 활발한 대사 작용으로 석회화 과정에 중요한 역할을 하는 조골세포는 골표면에 근접해 있으며 세포질내에 과립형질내세망이 발달해 있고, 핵 주위로 골지체가 위치하며, 골지체 바깥 세포질에 사립체가 존재한다24). 또한 세포막에 당단백효소인 alkaline phophatase (ALP)를 갖고 있어서, 이 효소는 조골세포의 분화초기에 나타나는 표지인자로써 기질 성숙기에 나타나기 시작하여 기질 성숙기 후반에 최대로 발현되고 석회화 단계에서는 감소한다25). 조골세포의 활성은 protein kinase C (PKC), protein kinase A (PKA), mitogenactivated protein kinase (MAPK)의 활성과 cAMP response element-binding (CREB)를 활성화 시키며 이는 RANKL의 발현을 촉진하며, c-fos promoter을 작동시킨다. 이들의 증가는 조골세포 분화의 초기와 후기 단계에 나타나는 표지인자인 ALP 및 osteocalcin의 합성을 증가시키며, 골기질의 형성을 유도하는 bone morphogenetic protein (BMP)류인 BMP-2, BMP-4, BMP-7등을 발현시킨다.26) 특히 BMP-2를 C2C12 세포에 가하면 근육세포로의 분화는 억제되고 조골세포로 분화됨이 보고되었다22). 또한 최근 연구들은 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)의 하위 신호전달 분자인 Akt와 MAPK의 신호전달경로가 BMP-2 유전자 발현의 활성화에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주고 있다.27) 미강의 조골세포의 분화 억제에 대한 실험은 bi-potential mesenchymal 전구세포인 C2C12 cell을 사용하여 조골세포초기분화를 유도하는 인자인 BMP-2를 이용하여 조골세포 세포막에 존재하는 ALP의 발현을 확인하고 그 기전에 대하여 확인하였다. 실험의 재료는 예비실험을 통하여 미강의 EtOAc 분획층인 RBE를 실험의 재료로 사용하였다. 실험결과 RBE는 사용된 전 농도에서 세포독성 없이 BMP-2로 자극된 ALP의 유도를 증가시킴으로 조골세포의 분화를 농도 의존적으로 촉진시킴을 확인하였다(Fig. 2). 또한 p38이 BMP 의 하위 신호전달에 관련된 분자임도 확인하였다(Fig. 3, 4). 이는 골 형성능이 있는 BMP-2와 BMP-7과 같은 BMPs가 최근에 척추고정술, 골절치료, 치아조직공학 등에 임상사용을 승인받은 것을 고려할 때,27) BMP 발현과 이것의 신호전달을 촉진하는 동화작용제제가 골형성 혹은 골재생을 통해 조골세포관련 질환의 치료제로서 사용될 수 있을 것이다. 이러한 관점에서 BMP 유전자발현을 유도하는 신호전달을 활성화시킴으로 mesenchymal 전구세포의 골세포로의 분화를 촉진시키는 RBE는 골재생에 도움을 주는 소재임이 밝혀졌다. 따라서 미강은 파골세포의 골흡수를 억제하고 조골세포의 골 형성을 촉진하는 작용을 통하여 골다공증을 예방하고 치료하는데 유용한 치료제의 역할을 할 것으로 기대된다.

 

결 론

미강추출물의 에틸아세테이트 분획물의 조골세포 분화촉진 작용은 RBE가 BMP-2자극으로 인한 ALP발현을 증가시켰고 이는 p38의 활성화와 함께 상승적인 상호작용을 통해 C2C12 cell의 조골세포로의 분화를 촉진시킴을 확인할 수 있었다. 따라서 RBE분획물이 골다공 질환의 치료 또는 예방의 목적으로 사용될 수 있음을 입증하였다. 이는 또한 기존의 파골세포를 억제하여 골다공증을 예방 또는 치료할 수 있는 것과는 다른 기전으로 작용함을 확인하였고 추후 미강에틸아세테이트 분획물에서 유효 지표성분을 분리하여 조골세포 분화에 미치는 영향을 분석하는 연구를 계속할 예정이다.