Analysis of the Bacterial Community in Ojingeo-jeotgal and Selection of Bacillus Species Inhibiting the Growth of Food Pathogens

오징어젓갈 Bacteria 군집분석 및 식중독균 생육저해 Bacillus 균주 선발

Abstract

Jeotgal is a generic term given to the high-salt-fermented seafood of Korea. This study aimed at developing an overview of the bacterial community present in Ojingeo-jeotgal, a highly consumed type of jeotgal, which is made with squid. Bacteria were isolated and purified from two samples on six different kinds of media and identified by 16S rRNA gene sequence analysis. Among the 121 total isolates, the most dominant genus was Bacillus, followed by coagulase-negative staphylococci (CNS) and lactic acid bacteria (LAB). CNS were detected in both samples, but LAB were observed in only a single sample. Six strains of Bacillus species inhibiting the growth of food pathogens, Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus, were selected from the 121 isolates. These were found to inhibit the growth of both pathogens in addition to displaying proteolytic activities on media containing 6% NaCl and 2% skim milk.

오징어젓갈의 안전성 확보 및 품질 균일화를 목적으로 사용할 종균 후보 선발을 위하여 오징어젓갈 우점 bacteria를 도출하고, 이들 중 황색포도상구균과 장염비브리오균에 대한 생육저해활성 보유 균주를 선발하였다. 6종의 배지를 이용하여 2종류의 오징어젓갈 시료로부터 순수 분리한 121 균주를 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통하여 동정한 결과, Bacillus 속, coagulase-negative staphylococci (CNS), 유산균의 순으로 우점하는 것으로 나타났다. CNS는 두 시료 모두에서 검출되었고, 유산균은 시료에 따라 분리되는 종(species)이 다르게 나타났다. 121 균주로부터 선발된 황색포도상구균과 장염비브리오균의 생육을 모두 저해하는 6종의 Bacillus 균주는 NaCl이 6% 첨가된 배지에서 단백질분해활성을 나타내었다.

배양법에 의한 오징어젓갈 bacteria 군집분석

Bacteria 분리를 위한 오징어젓갈은 2011년 9월 수원시 소재 재래시장과 대형마트에서 각각 1종씩 구입하였다. 시료 60 g에 동량의 멸균수를 혼합하여 균질화 한 후, 멸균한 거즈로 걸러 분리한 여액을 bacteria 분리 및 NaCl 농도, pH, 당도 측정에 사용하였다. NaCl 농도는 식품공전에 따라 측정하였고, pH는 pH meter로, 당도는 refractometer (Atago, Japan)로 측정하였다. 두 시료의 pH, NaCl 농도, 당도에는 큰 차이가 없었고, NaCl 농도는 평균 6.7% 정도로 상당한 저염화가 달성된 것으로 보인다(Table 1).

Table 1.The pH, NaCl concentration, sugar concentration of Ojingeo-jeotgal samples from a traditional market (A) and a super market (B) in Suwon, Korea.

각 시료 여액을 생리식염수로 bacteria의 분리가 가능한 농도로 연속 희석한 다음, 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 이상 배양하면서 colony의 형성 및 다양성을 관찰하였다. 다양한 bacteria의 분리를 위하여 nutrient agar(Difco, USA), marine agar (MBcell, Korea), MRS agar(Difco)와 이들 배지에 NaCl의 최종 농도가 5% (w/v)가 되도록 첨가한 총 6종의 배지를 사용하였고, 단백질분해활성의 확인을 위하여 skim milk (Difco)를 2% (w/v) 첨가하였다. 각 배지에서 생육한 생균수는 105-106 CFU/ml 수준으로 기존의 젓갈에서 보고된 일반세균의 측정치와 크게 다르지 않았다. 각 배지에서 생장한 bacteria는 크기, 모양, 색깔 및 skim milk 분해에 따른 투명환(clear zone) 생성 여부에 따라 각 배지당 10개 정도의 colony를 선발한 다음, 동일한 배지를 이용하여 순수 분리하였다.

순수 분리한 bacteria는 16S ribosomal RNA gene (16S rDNA) 염기서열분석에 의해 계통발생학적으로 동정하였다. 분리된 bacteria의 16S rRNA 유전자 증폭은 DNeasy tissue kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 추출한 DNA를 PCR 하거나 colony PCR을 이용하여 수행하였다. PCR 증폭에 사용된 primer는 다양한 미생물의 증폭에 사용되는 eubacterial universal primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC A-3')와 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용하였다[14]. PCR 반응은 T3000 Thermocycler (Biometra, Germany)를 사용하였고, 50 μl PCR 반응계에는 template DNA 또는 소량의 colony, 100 mM dNTP, 1U Taq polymerase(Roche, Germany), 10 pmol의 primer를 첨가하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 예비가열 후, 95℃에서 1분간 변성, 57℃에서 1분 annealing, 72℃에서 1분 중합반응의 과정을 30회 반복하였고, 마지막에 72℃에서 5분간 처리한 후 반응을 중단시켰다. 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit (SolGent, Korea)을 사용하여 정제한 후, 수탁업체(SolGent)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 EzTaxon server 2.1 [5]에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 nucleotide blast search를 통해 계통발생학적 분석을 수행하였다. Database에 등록된 표준균주(type strain)와 가장 높은 상동성을 나타내는 분류군(taxonomic unit)을 해당 bacteria로 동정하였다.

순수 분리한 총 121 균주의 동정 결과, 각 배지로부터 분리된 bacteria의 다양성은 속(genus) 수준에서는 큰 차이가 나타나지 않았지만, 종(species) 수준에서는 시료 B의 다양성이 높은 것으로 나타났다(Table 2). 유산균은 MRS agar 및 NaCl을 첨가한 MRS agar에서만 검출되었지만, Bacillus 속은 모든 배지에서 고르게 검출되었으며, 염 첨가에 따른 영향이 크게 나타나지 않았다. Staphylococcus 속의 검출은 nutrient agar와 marine agar에서 높게 나타났고, 염을 첨가한 배지가 검출에 유리한 것으로 나타났다.

Table 2.Abbreviations: N, nutrient agar; M, marine agar; R, MRS agar.aThe final concentrations of NaCl are indicated and 0% means NaCl was not added to the medium.

Bacillus 속이 두 시료 모두에서 우점으로 검출되었고, 기존의 연구에서 보고되었던 Staphylococcus, Micrococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas 속 중에서 Staphylococcus 속 만이 본 연구에서 검출되었다[10]. Bacteria 분리에 사용한 배지, 배양 조건 및 시료의 차이에서 그 원인을 찾을 수 있지만, 고전적 동정법을 적용한 기존 연구에서 분리균주들을 비교한 특성이 제한적이었다는 점을 고려하면, 최근에 적용되고 있는 계통발생학적 동정 결과와는 차이가 나타날 가능성이 크다. 재래시장에서 구입한 시료 A에서 는 Weissella 속이 Bacillus 속의 뒤를 이었지만, 대형마트에서 구입한 시료 B에 존재하는 bacteria의 우점은 Staphylococcus 속이 뒤를 이었다. 유산균은 Carnobacterium, Leuconostoc, Pediococcus, Weissella 속이 검출되었고, 시료에 따라 검출되는 종과 속이 다르게 나타났으며, 시료 B보다 A에서 높은 빈도로 검출되었다. 시료 A로부터 각각 11 균주와 4 균주가 분리된 Weissella 속과 Leuconostoc 속은 시료 B로부터는 Weissella hellenica 1 균주만이 분리되어, 시료에 따라 유산균과 Staphylococcus 속의 비중이 달라질 수 있는 가능성이 제시되었다. Probiotics 및 식품용 종균 개발을 목적으로 젓갈 유래 Lactococcus, Lactobacillus 속 유산균 분리가 보고 되었고[11, 17, 21], 유산균의 우점을 보고한 bacteria 군집분석 결과도 있지만[23], 고염 조건에서 생육이 어렵다는 점을 고려하면 발효 숙성에 적극적으로 관여하는 우점종으로 작용할 가능성은 크지 않다. 비교적 염도가 낮은 오징어젓갈에 서도 Bacillus 속에 비하면 그 비중이 크지 않은 것으로 보아 오징어젓갈뿐만 아니라 고염젓갈의 숙성에서는 큰 영향을 미치지 않고 생리적 활성이 거의 없는 상태로 존재하는 것으로 추정된다.

기존 연구[10]에서 검출된 바 있는 Staphylococcus 속은 두 시료 모두로부터 분리되었고, NaCl이 5% 첨가된 배지에서 우세하게 검출된다는 점을 고려하면, Bacillus 속 다음을 차지하는 오징어젓갈 우점 bacteria로 추정된다. 각 배지로부터 순수 분리한 Bacillus 속 및 Staphylococcus 속의 일부 균주들은 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동이 높아 계통발생학적 분류위치를 정확히 결정할 수 없어 종 수준에서의 우점종을 결정하기 힘들지만, 종 수준에서의 동정이 결정된 균주들 중에서는 B. methylotrophicus, B. subtilis, B. tequilensis가 다수 분리되었다(Table 2). Bacillus 속이 우점으로 검출 되었지만, 식품 위해 가능성이 있는 Bacillus cereus는 검출 되지 않았다. 분리된 Staphylococcus 속 중에서 S. aureus로 동정된 균주는 존재하지 않았고, 모두 coagulase-negative staphylococci (CNS)라는 범주에 속한다. CNS는 유럽의 육류 및 소시지 발효에서 높은 빈도로 검출되고, 종균으로도 식품 발효에 사용되고 있으며, 문헌 상으로 식중독 관련성이 보고된 바는 없다[20, 22].

 

황색포도상구균 및 장염비브리오균 생육저해활성 보유 균주 선발

본 연구에서 분리 동정한 121 균주로부터 젓갈에서 발생 가능성이 있는 황색포도상구균 및 장염비브리오균에 대한 생육저해활성 보유 균주의 선발을 시도하였다. 선발을 위한 지시균 S. aureus ATCC12692와 V. parahaemolyticus ATCC17802는 Korean Culture Center for Microorganisms(KCCM)로부터 구입하였고, 전배양한 지시균주를 약 105-106 CFU/ml 농도로 한천배지에 200 μl 도말하여 건조시킨 다음, 약 108 CFU/ml 농도의 실험균주를 백금이를 이용해 획선접종하여 30℃에서 24시간 배양 후 생육저지환의 생성 유무로 생육저해활성을 확인하였다. 활성측정을 위한 한천배지는 각각의 지시균 S. aureus ATCC12692와 V. parahaemolyticus ATCC17802의 생장이 우수하게 나타난 nutrient agar와 marine agar를 사용하였고, 젓갈의 염도를 고려하여 최종농도가 5%가 되도록 NaCl을 첨가하였다.

분리 균주 중, 55 균주가 S. aureus에 대하여 생육저해활성을 나타내었고, Bacillus 속 균주들이 대부분이었다(Table 3). 분리 빈도가 높지는 않지만, 분리된 모든 B. pumilus, B. safensis, B. siamensis, B. sonorensis, Weissella confusa 균주는 활성을 나타냈다. V. parahaemolyticus에 대해서는 Bacillus 속 21 균주만이 생육저해활성을 나타내었고, S. aureus 대비 활성 보유 균주의 선발 확률이 높지 않았다(Table 4). 2 종류의 식중독균에 대하여 활성을 갖는 균주는 모두 Bacillus 속으로, 6 균주가 분리되었다. 이들 균주의 식중독균 생육저해는 NaCl이 6% 첨가된 배지에서도 활성이 나타나는 것으로 보아 오징어젓갈의 숙성과정에서 식중독균의 저해가 가능한 것으로 추정된다(Fig. 1). 총 3 균주가 분리된 B. pumilus와 B. siamensis는 모두 두 식중독균에 대하여 저해활성을 나타내었지만, 분리된 개체수가 낮아 종 수준의 저해활성으로 평가하기는 힘들고, 대부분의 저해활성은 균주 특이적으로 나타났다.

Table 3.Numbers of isolates from Ojingeo-jeotgal showed the growth inhibition of Staphylococcus aureus ATCC12692 on nutrient agar supplemented 5% NaCl.

Table 4.Numbers of isolates from Ojingeo-jeotgal showed the growth inhibition of Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 on marine agar added 3% NaCl.

Fig. 1.Growth inhibition of S. aureus ATCC12692 (A) and V. parahaemolyticus ATCC17802 (B) by the isolates from Ojingeo- jeotgal at the NaCl added conditions. Nutrient agar and marine agar were used for the growths of S. aureus (A) and V. parahaemolyticus (B), respectively. Isolates: a, B. pumilus ANR7; b, B. pumilus RM010; c, B. siamensis RM502; d, B. tequilensis AM5R3; e, B. tequilensis MA504; f, B. tequilensis MS503.

젓갈 발효용 종균의 가장 중요한 기능성으로 고려되고 있는 단백질분해활성을 skim milk를 2% 첨가한 nutrient agar에서 확인해 본 결과, 6 균주 모두 단백질분해활성을 가지고 있었지만, NaCl 첨가에 따라 활성이 감소했고, colony의 모양이 NaCl의 농도에 따라 변화함을 확인하였다(Fig. 2). B. siamensis RM502 균주가 NaCl이 6% 첨가된 배지에서 가장 높은 단백질분해활성을 나타내었다. 최종적으로 선발된 6 균주의 생육저해활성과 단백질분해활성을 정량적으로 비교하지는 못했지만, 6% 염농도에서 활성을 나타내고 있어 오징어젓갈의 제조 과정에서 식중독균 생육저해 및 단백질 분해활성을 나타낼 수 있을 것으로 예상한다.

Fig. 2.Effect of NaCl on the growth and protease activity of isolates from Ojingeo-jeotgal. Nutrient agar containing 2% (w/v) skim milk was used for the detection of growth and protease activity. Isolates: a, B. pumilus ANR7; b, B. pumilus RM010; c, B. siamensis RM502; d, B. tequilensis AM5R3; e, B. tequilensis MA504; f, B. tequilensis MS503.