Induction of G2/M Arrest and Apoptosis by the Methanol Extract of Typha orientalis in Human Colon Adenocarcinoma HT29 Cells

포황 메탄올 추출물에 의한 인체 대장암 세포주 HT29의 G2/M Arrest 및 Apoptosis 유발

Abstract

Typha orientalis, also known as bulrush or cattail, is a perennial herbaceous plant found in freshwater wetlands and has been widely used in constructed wetlands for wastewater treatment. Recent data has revealed that SH21B, a mixture composed of seven herbs including T. orientalis, exhibited an anti-adipogenic activity by the inhibition of the expression of adipogenic regulators. However, the anti-cancer effect of T. orientalis and its molecular mechanisms remain unclear. In this study, we evaluated the anti-cancer effect and its mechanism in the methanol extract of T. orientalis (METO) on human colon carcinoma HT29 cells. It was found that METO treatment showed cytotoxic activity in a dose-dependent manner, and induced G2/M cell cycle arrest and apoptosis in HT29 cells. The induction of G2/M arrest by METO was associated with the up-regulation of phospho-Cdc2 (Tyr15), an inactive form of Cdc2 and the down-regulation of Cdc25c phosphatase. METO also induced tumor suppressor p53 and cyclin-dependent kinase inhibitor p21 (WAF1/CIP1) expression. In addition, METO-induced apoptosis was characterized by the proteolytic activation of caspase-3, degradation of poly ADP ribose polymerase (PARP), and up-regulation of death receptor FAS and pro-apoptotic Bax expression. Collectively, these results indicate that the cell cycle inhibition and apoptosis induction of METO in HT29 cells allows for the possibility of its use in anti-cancer therapies.

본 연구에서는 인체 대장암세포인 HT29를 사용하여 포황 메탄올 추출물(Methanol extract of Typha orientalis, METO)의 항암 활성 및 그 분자적 기전에 관하여 분석하였다. 먼저 METO가 다양한 암세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과, 인체 대장암 세포, 폐암 세포, 간암 세포 등의 세포증식을 억제하였으며 그 중에서도 대장암 세포인 HT29에 대해 강한 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. METO에 의한 세포 증식 억제 기전을 분석하기 위하여 Flow cytometry analysis를 수행한 결과, METO 농도의존적으로 HT29 세포의 G2/M기 세포분포가 증가하고 아울러 apoptosis 유발군인 SubG1기 세포분포가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. METO에 의한 HT29 세포의 G2/M arrest는 Cdc2의 inactive form인 phospho-Cdc2의 증가에 의한 G2/M checkpoint 관련 단백질의 활성억제에 의한 것이라 사료된다. 이러한 phospho-Cdc2의 증가는 METO에 의해 발현이 증가된 Wee1 kinase와 발현이 감소된 Cdc25C phosphatase에 의해 야기된 것임을 확인하였다. 또한 METO에 의한 HT29의 apoptosis 유도에 관한 분자적 기전 분석을 위해 Western blot analysis를 수행한 결과, METO 농도가 증가할수록 종양 억제 유전자인 p53, death receptor인 FAS, Bcl-2 family 중 pro-apoptotic 단백질인 Bax 및 cytosolic cytochrome C의 발현이 증가되고, Caspase-3가 활성화되어 단편화된 Caspase-3의 증가가 관찰되었다. 또한 활성화된 Caspase-3의 기질 단백질인 PARP의 단편화가 일어나 apoptosis가 유도되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과들로부터 METO는 인체 대장암세포 HT29의 G2/M arrest 및 apoptosis 유도에 의한 항암활성을 보유함을 확인하였다.

서 론

암은 현대의학의 발달에도 불구하고 치료에 많은 어려움을 겪고 있는 질병으로, 유전적 요인 뿐 아니라 식습관 등의 생활 환경적 요인과 매우 밀접한 관계를 가진다. 또한 인구의 급격한 고령화와 식습관의 서구화 등으로 인해 10만명당 암발생률은 점점 증가하고 있으며, 서구사회에서 많은 비율을 차지하는 대장암, 유방암 등의 발생도 증가하고 있는 추세이다. 특히 대장암의 경우 암의 치료법으로 주로 외과적 절제술, 방사선치료 및 화학요법 등이 이용되고 있으나, 이들의 부작용 및 비교적 낮은 생존율 등을 고려하여 항암활성을 가지는 식품 또는 천연물 유래 소재의 중요성이 대두되고 있으며, 이들 천연물의 세포주기 조절에 의한 암세포 증식억제 및 apoptosis 유도 등 항암활성의 분자적 기전에 관한 활발한 연구가 진행되고 있다[8, 26].

세포가 외부자극 등에 의해 DNA에 손상을 입게 되면, 재 빠르게 세포주기를 지연시켜 DNA를 복구할 수 있는 시간을 벌게 된다[37]. 그러나 암세포는 유전적 변이 등에 의해 세포주기 진행의 조절 기전에서 벗어나므로 지속적으로 분열하게 된다. 세포주기 진행은 G1, S 및 G2/M기로 나뉘어 지며, 각 단계의 checkpoint에서 cyclin dependent kinase(CDKs)의 활성을 억제하며 세포주기를 조절한다[13]. 특히 cyclinB1과 complex를 이루며 G2/M기의 checkpoint로 작용하는 Cdc2(CDK1)는 Wee1 kinase에 의해 Tyr-15 잔기에 인산화가 되어 비활성 형태로 존재한다[3, 24]. 비활성 형태인 phospho-Cdc2(CDK1)는 phosphatase인 Cdc25C에 의해 탈인산화되면서 active form으로 전환되고 활성화된 Cdc2-cyclin B1 complex에 의해 mitosis 단계로 들어간다[7, 18]. 또한 Cdc2-cyclin B1 complex의 활성은 세포증식 억제 신호에 따라 발현이 증가되는 Cdk 억제제 특히 p21(WAF1/CIP1)에 의해 조절되며, p21이 Cdk에 결합함으로서 그들의 활성이 억제된다[9]. 이러한 p21의 발현은 종양억제 유전자인 p53 발현 증가에 따라 유도되는 것으로 밝혀져 있으며, 최근 연구된 바에 따르면 p21은 세포주기 조절에 의한 증식 억제 뿐 아니라 apoptosis도 유도할 수 있다[31, 36].

Apoptosis는 programmed cell death라고도 불리며, apoptosis 과정에 이상이 생겨 실패하게 되면 암과 같은 질병이 유발되므로, apoptosis 유도에 의한 암세포 제거는 수 년간 암 치료를 위한 주요 전략 중 하나로 연구되어 왔다[20, 25]. 세포가 여러 가지 요인들에 노출되었을 때 다양한 신호전달을 통해 세포가 죽음에 이르는 과정을 뜻하는 apoptosis는 세포위축, 염색질 응축, DNA 단편화 및 apoptotic body 형성 등 의 전형적인 형태학적 및 생화학적인 특징을 가지며, 세포막의 사멸수용체(death receptor)에 리간드가 결합하여 일어나는 외부적 경로 및 미토콘드리아에서 일어나는 내부적 경로의 두 가지 주요 경로를 통하여 야기된[14]. 또한 apoptosis는 pro-caspase의 분절에 의한 활성화, poly ADP-ribose polymerase (PARP)의 단편화, 세포 내 pro-apoptotic Bcl-2 family의 활성화 및 종양억제유전자 p53의 발현 증가 등에 의하여 조절되며, 이러한 다양한 apoptosis 조절 인자들은 항암제 및 암예방을 위한 주요 표적인자들로 연구되어 왔다[1, 5, 27]. 최근에는 다양한 범위의 식물 추출물 또는 식물로부터 분리한 성분물질들의 세포주기 조절 및 apoptosis 유도 효과에 의한 항암활성이 활발하게 연구되고 있다[2, 6, 15, 35].

포황(Typha orientalis)은 부들과(Typhaceae)에 속하는 부들 화분으로 연못 가장자리나 습지에서 자생하며 예로부터 지혈, 어혈 제거, 이뇨제 등으로 주로 사용되어 왔으며, 혈압 강하작용, 항균작용 등이 있는 것으로 알려져 있다[21]. 또한 본 연구실에서는 이미 포황 메탄올 추출물의 항산화 및 항염증 활성에 관하여 보고한 바 있다[17]. 그 외에 포황 열수 추출물을 식이한 랫트의 혈청에서 혈중 cholesterol 및 glucose 함량을 낮추는 효과가 있었다는 연구결과가 있어, 포황의 고지혈증 및 당뇨병 치료 효과에 대한 가능성을 시사하고 있으며[21], 포황을 포함한 7가지 약재 성분으로 구성된 SH21B가 항비만 효능을 가진다는 연구결과가 있으나[22], 포황의 항암활성에 대해서는 연구된 바가 극히 드물다. 이에 본 연구에서는 포황 메탄올 추출물의 항암 활성을 확인하기 위하여 인간 대장암 세포주인 HT29 세포를 사용하여 세포독성 효과, 세포의 형태변화, 세포주기 변화, 세포주기 및 apoptosis 관련 단백질의 발현 변화에 대하여 조사하였다.

 

재료 및 방법

시료준비

본 실험에 사용된 한약재인 포황은 중국산이며 부산광역시 소재 대한생약제품㈜에서 구입하여 사용하였다. 메탄올 추출물(Methanol extract of Typha orientalis, METO)을 얻기 위하여 포황 10 g을 분말로 파쇄하여 시료의 5-10배의 메탄올 용매를 가한 후 75℃에서 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 Whatman No.2 (Whatman international Ltd., England)에 여과 후 감압 농축기로 농축하여 1.59 g을 얻었으며, 동결건조(FDU-2100, EYELA, Japan) 하여 500 mg/ml의 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 처리 전 배지에 희석하여 사용하였다.

세포배양

실험에 사용된 인체 대장암세포 HT29, 인체 폐암세포 A549, 인체 간암세포 HepG2는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

WST assay에 의한 세포 성장억제 조사

METO가 암세포의 성장억제에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 WST (water soluble tetrazolium salt) assay를 수행하였다. 먼저 24-well plate에 3-5 × 104 cell의 HT29, A549 및 HepG2 세포를 분주하여 METO를 농도 별로 처리하고 48시간 동안 배양한 후 WST 시약(Daeillab, Korea)이 포함된 배지로 교체하였다. 30분간 반응시킨 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험을 하여 그에 대한 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.

세포 형태 변화 관찰

METO 처리에 따른 HT29 세포의 형태 변화 관찰을 위하여 6-well plate에 1 × 105 cell의 HT29 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 적정 농도의 METO를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 도립현미경을 이용하여 100배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision program을 사용하여 사진 촬영을 하였다.

Flow cytometry에 의한 세포주기 분석

METO가 HT29 세포의 세포주기에 어떤 영향을 주는 지 확인하기 위하여 HT29 세포에 METO를 농도 별로 처리한 다음 CycleTESTTM PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포주기 분석을 하였다. 6-well plate에 HT29 세포를 5 × 105 cell의 농도로 분주하여 METO를 농도 별로 24시간 처리한 다음 세포를 모아서 PBS로 세척한 후, ribonuclease A를 실온에서 10분간 처리한 다음 propidium iodide (PI) 용액을 첨가하여 4℃에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 Flow cytometry(Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 로 측정하였으며 결과는 FlowJo program을 이용하여 분석하였다.

Western blot analysis에 의한 단백질 발현 분석

METO를 처리한 HT29 세포의 세포주기 관련 단백질 및 apoptosis 관련 단백질들의 발현 양상을 확인하기 위하여 Western blot analysis를 수행하였다. 농도 별로 METO를 처리한 HT29 세포를 모아 PBS로 세척한 후, lysis buffer[20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF]를 첨가하여 4℃에서 20분간 반응시킨 다음 13,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 추출한 단백질의 농도는 Bradford법을 이용하여 정량한 다음 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하고 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 5% skim milk가 함유된 PBS-T를 사용하여 상온에서 1시간동안 blocking을 하고, 각각의 일차항체를 4℃에서 overnight 처리한 다음, horse radish peroxidase (HRP)가 부착된 이차항체를 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Western blotting luminol reagent(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. p53, Cyclin A, Cyclin B1, Cdc2, phospho-Cdc2 (Tyr15), Cdc25C, Wee1, FAS, FADD, Caspase-3, PARP, Cytochrome C 및 actin의 일차항체와 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse 등 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)에서 구입하였으며, p21, Bcl-2, Bax의 일차항체는 Cell Signaling Technology (MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

 

결과 및 고찰

METO에 의한 암세포의 증식 억제

먼저 다양한 암세포의 증식에 미치는 METO의 영향을 조사하기 위하여 인체 대장암세포 HT29, 인체 폐암세포 A549 및 인체 간암세포 HepG2에 METO를 다양한 농도로 처리하여 WST assay를 사용하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과 Fig. 1에서와 같이, METO 농도 의존적으로 세포증식이 억제되었으며, 특히 HT29 세포의 경우 최고 농도인 400 μg/ml METO를 처리하였을 때 세포 증식이 약 54% 억제되어 세포 증식이 40% 억제된 A549와 22%가 억제된 HepG2 세포보다 METO에 대한 감수성이 높은 것을 확인하였다. 따라서 이후의 실험은 HT29 세포로 수행하였다.

Fig. 1.Effects of METO on cell growth in various cancer cell lines. Human colon carcinoma HT29 cells (A), human lung carcinoma A549 cells (B) and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells (C) were treated with indicated concentration of METO for 48 h. Cytotoxic effect of METO was determined by WST assay. Results are expressed as percentage of the control ± SD of three independent experiments.

HT29 세포의 형태에 미치는 METO의 영향

METO 처리에 의한 증식 억제 효과에 따른 HT29의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 METO를 다양한 농도로 48시간 동안 처리하여 도립현미경으로 세포 형태를 관찰하였다. 그 결과 Fig. 2에서와 같이 METO 농도가 증가할수록 전체적인 세포 밀도가 감소하였으며, METO 400 μg/ml의 농도에서는 세포의 모양이 불규칙하고 바닥에 고착되어 있는 세포의 수가 감소하였다.

Fig. 2.Morphological changes by METO in HT29 cells. Cells were treated with various concentrations of METO for 48 h. Cell morphology was visualized by light microscopy. Scale bars, 200 μm.

METO에 의한 HT29의 세포주기 변화

정상적인 세포는 DNA에 손상을 입었을 때 세포주기를 조절하여 손상된 DNA의 회복 경로를 거치게 된다[28]. 그러나 암세포에서는 정상적인 세포주기 조절 기능이 제어되어 G1/S 또는 G2/M기의 비정상적인 진행에 의한 무한 증식이 일어난다[12]. 최근에는 이러한 암세포의 세포주기 조절에 의한 암세포 사멸을 유도하는 항암제의 개발이 활발하게 이루어지고 있다[32]. 따라서 본 연구에서는 METO에 의한 HT29 세포의 증식억제 현상이 세포주기 조절에 의한 것인지 확인하기 위하여 적정농도의 METO를 처리한 HT29에 PI 염색을 한 후 flow cytometry 분석을 통해 세포주기의 변화를 확인하였다. 그 결과, Fig. 3A의 histogram 결과 및 Fig. 3B의 그래프에서 보여지듯이 METO의 처리 농도가 높아질수록 G2/M기 및 SubG1기 세포군의 분포(%)가 점차 증가하였으며 반면, G1기 및 S기의 세포군의 분포는 METO 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 METO 처리에 따른 각 주기별 세포분포수는 정량화하여 Table 1에 나타내었다. Table 1에서 알 수 있듯이 대조군에서 9.22%였던 G2/M기 세포분포는 METO 농도의존적으로 증가하여 최고 농도인 400 μg/ml에서는 20%의 세포가 G2/M기에 정체되어 있음을 확인하였다. 또한 apoptosis 유발군으로 추정할 수 있는 SubG1기의 세포분포는 대조군에서 2.66%였으며 METO 400 μg/ml에서는 16%로 증가되었다. 반면, G1기와 S기의 세포분포는 각각 68.7%에서 47.3%, 18.4%에서 15.3%로 감소하였다. 따라서 이와 같은 결과는 METO에 의해 HT29 세포의 G2/M arrest 및 apoptosis가 유도됨을 시사한다.

Fig. 3.Induction of G2/M arrest and accumulation of subG1 phase in METO-treated HT29 cells. Cells were treated with indicated concentrations of METO for 24 h, stained with propidium iodide for 10 min and analyzed by flow cytometry. DNA-fluorescence histogram (A) and quantitative data of cell distribution (B) are shown.

Table 1.Cell cycle distribution of Typha orientalis extracttreated HT29 cells.

G2/M기 조절 관련 단백질의 발현 변화

세포주기 분석 결과 G2/M arrest 유발이 관찰되었으므로, 그 분자적 기전 분석을 위하여 G2/M기 조절 관련 단백질들의 발현에 미치는 METO의 영향에 관하여 조사하였다. 종양 억제 유전자로 널리 알려진 p53은 정상세포가 손상을 입었을 때 발현 증가 또는 전사 후 변형(post-transcriptional modification) 등에 의해 활성화되고, 활성화된 p53은 세포주기 억제 단백질인 p21을 비롯하여 FAS, Bax 등 다양한 apoptosis 관련 단백질의 발현을 촉진하고 caspase의 활성화를 유도하여 세포주기의 진행을 억제시키거나 apoptosis를 유발한다[29, 33]. 따라서 METO를 농도별로 처리한 HT29의 p53 및 p21의 발현 변화를 분석한 결과, Fig. 4A와 같이 p53과 p21의 발현이 METO 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 다음으로 G2/M기 조절에 관여하는 cyclin의 발현을 확인한 결과, cyclin A의 발현은 큰 변화가 관찰되지 않았으나 cyclin B1은 METO 농도가 증가할수록 그 발현량이 감소하였다(Fig. 4B). Cdk의 경우, Cdc2 (Cdk1)의 발현에는 큰 변화가 없었으나 Cdc2의 inactive form인 phospho-Cdc2 (Tyr15)의 발현량이 METO 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가함을 알 수 있었다. 또한 Cdc2의 인산화를 유도하여 Cdc2를 inactivation 시키는 Wee1 kinase의 발현은 METO 농도가 높아질수록 증가하였으며, 반면 phospho-Cdc2의 탈인산화를 일으켜 Cdc2를 activation시키는 phosphatase인 Cdc25C의 발현량은 감소하였다. 이상의 결과는 METO에 의해 Wee1 kinase의 발현이 증가되고 Cdc25C phosphatase의 발현이 감소되어 Cdc2의 인산화가 유도되고, 따라서 Cdc2의 inactive form인 phospho-Cdc2가 증가하게 됨을 시사한다[4, 18, 19]. 결과적으로 증가된 inactive form의 Cdc2는 M 기로의 진행을 불가능하게 하여 G2/M arrest가 유도된다고 사료된다[7].

Fig. 4.Modulation of the expression of tumor suppressor p53 and G2/M checkpoint proteins in METO-treated HT29 cells. Cells were exposed to various concentrations of METO for 24 h. The cells were lysed and proteins were then separated by SDS-PAGE, followed by Western blot analysis. Actin was used as an internal control. (A) Induction of tumor suppressor p53 and CDK inhibitor p21 by METO treatment. (B) Down-regulation of Cdc25C phosphatase and Cyclin B1, and up-regulation of p-Cdc2 and Wee1 kinase.

세포사멸 관련 단백질의 발현 변화

이상의 결과에서 HT29에 METO를 처리했을 때 농도의존적으로 apoptosis 유발군인 SubG1기 세포분포가 증가되었으며(Fig. 3), METO 처리에 의해 p53 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였으므로(Fig. 4A), 다음으로 apoptosis에 관련된 단백질의 발현 변화를 Western blot analysis로 확인하였다. 세포 내에서 apoptosis 관련 단백질은 death receptor family, Bcl-2 family, caspase, PARP등이 있으며 특히 Bcl-2 family는 anti-apoptotic (Bcl-2, Bcl-xL) 단백질과 proapoptotic(Bax, Bak, Bid) 단백질로 구성되어 있어 세포 내 균형을 이루고 있다. 그러나 세포 내 자극에 의해 균형이 깨어지고 pro-apoptotic 단백질의 발현이 증가될 경우, 미토콘드리아 막 전위에 변화를 유도하여 미토콘드리아 내막에서 cytochrome C가 방출된다[10, 11]. 이러한 apoptosis 유발인자들에 의해 caspase cascade가 활성화 되고 활성화된 effector caspase-3는 여러 종류의 기질 단백질들을 분해하여 apoptosis를 일으키게 된다. 여러 기질 단백질 중 PARP는 세포의 핵 내에 존재하는 효소로서 DNA 회복, 유전자 전사, 세포 주기 진행 등에 작용하며 활성화된 caspase-3에 의해 분해되어 apoptosis 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다[30]. METO를 처리한 HT29에서 이러한 apoptosis 관련 단백질들의 발현변화를 확인한 결과, Fig. 5에서와 같이 death receptor인 FAS와 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현이 METO 농도의존적으로 증가하였다. 반면 death receptor인 Fas에 결합하는 Fas associated death domain (FADD) 및 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현량은 큰 변화가 관찰되지 않았다. 또한 cytosolic cytochrome C의 양은 METO 농도의존적으로 증가하였으며, cleaved caspase-3 및 cleaved PARP 또한 METO의 농도가 높아질수록 증가하였다. 이와 같은 결과를 통해 METO가 HT29 세포의 p53 발현 및 death receptor인 FAS 발현을 유도시키고 Bcl-2 family의 변화를 유도하여 caspase-3 경로를 통하여 apoptosis를 유도하는 것을 알 수 있었다. 따라서 이상의 결과들로부터 METO가 인체 대장암세포 HT29의 G2/M arrest 유도에 의해 세포주기를 조절하여 세포 증식을 억제하고, apoptosis에 의한 세포사멸을 유도한다는 것을 확인하였다.

Fig. 5.Effects of METO on the levels of apoptosis-related protein expression in HT29 cells. Cells were harvested and lysed after incubation with the indicated doses of METO for 24 h. Proteins were subjected to Western blot analysis using antibodies against FAS, FADD, Bcl-2, Bax, Cytochrome C, Caspase-3 and PARP. Actin was used as an internal control.

최근까지의 연구 결과들로부터 항암활성을 보유하고 있다고 알려진 다양한 약재 및 천연소재들의 항암활성 기전이 밝혀지고 있으며, 특히 세포주기 조절 및 apoptosis 유도에 의한 항암활성을 보유하는 소재들에 관한 연구는 매우 활발히 진행되고 있다[4, 23]. 최근에 보고된 연구결과에 따르면 계혈등(Spatholobus suberectus)의 열수추출물에 의해 인체 유방암 세포주 MCF-7과 대장암 세포주 HT29의 G2/M arrest 및 apoptosis가 유도되고 경구투여에 의해 마우스 xenograft 모델의 종양 부피가 감소되었으며, 땅꽈리(Physalis angulata)의 메탄올 추출물 또한 유방암 세포주에서 G2/M arrest를 유도하였다[16, 34]. 이들 추출물들은 Cdc2의 인산화 증가, Cdc25C 발현감소 및 Wee1 발현증가 등 본 연구와 유사한 결과를 보였으며, 특히 계혈등 추출물의 경우 Bcl-2의 발현 감소와 Bax 및 cytosolic cytochrome C의 발현 증가 등에 따른 apoptosis를 유도하여 본 연구결과와 유사하였으나, p53의 발현증가는 관찰되지 않았다[16, 34]. 이러한 CDK/cyclin complex의 활성을 조절하는 Cdc25 분자 및 Wee1에 대한 연구결과는 많이 보고되고 있으며, 이들 분자는 항암제의 target 분자로 작용할 수 있어 신약 개발을 위한 중요한 분자 중 하나이다[7, 19]. 특히 이러한 세포주기 조절 분자를 target으로 하는 항암제는 기존의 다른 암치료제, 즉 alkylating agent, pyrimidine-purine antimetabolites, DNA topoisomerase 등에 비해 정상세포에 대한 부작용을 줄일 수 있다는 점에서 관심이 집중되고 있다[19]. 따라서 포황 추출물이 암세포의 Cdc25C 및 Wee1의 발현을 조절하여 G2/M arrest를 유도하고 나아가 apoptosis를 유발함을 확인한 본 연구결과는 포황의 또 다른 생리활성인 항암 작용의 기전을 해석하였을 뿐 아니라, 나아가 새로운 천연물 유래 항암제 후보 물질을 연구하는 데에 있어 귀중한 자료로 사용될 것이라 사료된다. 또한 이러한 기전연구를 바탕으로 실질적인 대장암 치료제로서의 사용 가능성을 확인하기 위해서는 마우스 xenograft 모델을 사용한 in vivo 실험 등, 더욱 다양한 추가 실험이 수행되어야 할 것이다.