Effects of Cupping Therapy on Memory Impairment after Hemorrhage in Rats

뇌출혈 동물 모델에서 부항이 뇌 인지기능 회복에 미치는 효과

Abstract

Hemorrhage is a devastating type of stroke, accounts for 15-20% of all strokes. This disease can cause cognitive dysfunction with a very high mortality rate. Cupping therapy of Traditional Korean medicine has frequently been used to relieve a variety of diseases or clinical conditions, although not in the memory loss after hemorrhage. This study was designed to evaluate the effects of cupping therapy on learning and memory with Y-maze test, as well as its effects on different molecular changes in hippocampus following the induction of hemorrhage in rats. Cupping, using vacuum cupping machine, was applied at target area for 5 min daily for 7 consecutive days, commencing 1 day after brain impairment. As a result, induction of hemorrhage enhanced memory deficit, suppressed brain-derived neurotrophin factor (BDNF) in the hippocampus. Cupping treatment effectively reversed collagenase-induced cognitive impairment in SD rats which was represented by improvement of spontaneous alterations in Y-maze test. In addition, BDNF expression was enhanced after cupping therapy. The present results suggest that the therapeutic effects of cupping treatment after hemorrhage is involved in expression of BDNF.

서 론

뇌혈관질환은 우리나라 사망 원인 중 암 다음으로 많으며 그 중 대표적인 뇌졸중 (stroke)은 크게 뇌혈관이 막히는 뇌허혈(ischemic stroke), 혈관이 터지는 뇌출혈(hemorrhagic stroke) 등으로 이들의 장애가 부분적 또는 전체적으로 상당기간 이상 지속되는 것으로 사망률이 높고, 생존하더라도 의식장애와 운동장애, 인지장애 등 심각한 후유증을 수반한다1,2). 이 질환의 발병은 연령과 함께 증가되고 있으나 요즘은 식생활 및 환경의 변화, 그리고 스트레스 등으로 인해 연령에 관계없이 높은 유병율을 나타내고 있으므로 이에 대한 예방 또는 치료법에 대한 관심과 중요성이 증가되고 있다3). 특히, 뇌출혈은 서양 보다 동양에서 약 2배 정도 높은 발병률을 보이며, 전체 뇌졸중 환자의 약 10%-15%를 차지하고 있다. 이들 중 약 50%가 발병 후 1달 이내 죽음에 이르고 있으나 치료는 원칙적인 방법 뿐 아직까지 적절한 치료 방법 설정이 미비하다4,5).

부항은 침, 뜸과 더불어 동양에서 오래전부터 내려오던 한의학 치료술의 하나로 기구 속의 공기를 제거하여 국소적 부위를 음압으로 유지시킴으로서 피부혈관을 확장하고 혈액 순환을 증대시킨다6,7). 이에 따라 사기(邪氣)를 제거하고 어혈(瘀血)을 풀어줌으로써 체내의 다양한 반응을 유도한다8). 부항요법은 피부호흡 강화 및 재생력과 저항력을 높여주는 면역계통 조절, 근육 및 관절 내 침체 혈액을 제거해주고 혈액순환과 신진대사 조절뿐만 아니라 정신적 부분까지 다방면에서 치료효과가 규명되어져왔다9,10).

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)는 신경성장인자의 일종으로서 신경세포의 성장, 발달, 가소성, 생존 등에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다11,12). 특히, BDNF는 해마, 피질에서 고도로 높은 수준으로 발현이 되는데 이는 인지 기능과 밀접히 관련 있는 것으로 보고되고 있다13-15). 뿐만 아니라, 외상성 뇌 손상 후에도 해마의 신경세포 생성과 신경생리학적 기능을 향상시키는 것으로 알려져 있고, 허혈성 뇌손상 후에도 신경성장인자들의 발현이 증가된다고 알려져 있다16-19). 또한, 최근에는 뇌출혈 동물 모델에서 BDNF가 신경발생과 손상된 기능 회복에 긍정적 영향을 미친다고 보고되었다20). 따라서 본 연구에서는 뇌출혈 후 모세메디 사의 진공부항을 이용한 부항처치가 인지능력을 향상시키고, 그 분자기전을 확인하기 위하여 BDNF 발현양의 변화를 확인하는데 목적을 두고 있다.

 

재료 및 방법

1. 실험동물

실험동물은 웅성의 Sprague-Dawley계 7주령 흰쥐를 대한바이오링크 (충북, 한국)에서 구입한 후, 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 10% 내외로 유지되는 사육실에서 12:12 광주기 조건의 선형 층류실에서 한 쥐장 당 3마리를 보관했다. 환경적응 기간 동안 먹이와 물은 임의로 이용할 수 있도록 했다. 실험동물 연구는 대구한의대학교 동물 실험 윤리 위원회 지침에 입각하여 수행하였다. 승인번호는 DHU2012-011이다.

2. 실험군의 구분

뇌출혈 후 기억력 손상에 대한 부항의 효과를 알아보기 위하여 실험군을 다음과 같이 구분하였다. 마취와 두정부의 피부절개 후 두개골 천공하여 식염수를 주입한 정상대조군 (Sham)과 식염수 대신하여 해마 부위에 collagenase를 주입하여 뇌출혈을 유발시킨 대조군 (Control) 및 대조군과 같이 뇌출혈을 유발한 다음 부항을 처치한 부항처치군 (Cupping)으로 나누었다.

3. 뇌출혈의 유발

뇌출혈 유발은 zoletil (Virbac, Carros, France)과 rompun(Bayer, Pittsburgh, PA, USA) 혼합액을 복강투여하여 마취한 뒤 수술 부위를 제모하였다. 그 후 뇌정위 고정장치에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 후방으로 3.0 mm, 중앙선에서 옆으로 2.0mm 위치에 전기드릴을 사용하여 약 1 mm 직경의 두개골 천공을 만들고, 뇌정위 고정장치에 장착된 Hamilton 주사기 (26-gauge, 10 μl, Hamilton, USA)를 뇌경막으로부터 3.3 mm 깊이로 해마에 삽입하였다. 이어서 3 μl 내에 0.1 U의 bacterial collagenase type Ⅳ (C5138, Sigma-Aldrich, USA) 용액을 0.3 μl/min 속도로 10분간 주입하였다. Collagenase 용액의 주입이 끝난 후 약 5분간 기다린 후 Hamilton 주사기를 분당 1mm의 속도로 제거하고 절개부위를 봉합하였다. 뇌출혈을 유발 시키지 않는 흰쥐들은 뇌출혈유발 흰쥐와 동일한 방법으로 생리식염수를 주입하였다.

4. 부항의 처치

모세메디 사(Mosemedi, Nano Vacuum Controller-010, Korea)에서 동물용으로 개발한 직경 1 cm 부항컵을 이용하여 동물의 수술 부위인 백회혈과 풍부혈 사이에 부항을 처치하는데, 60Kpa로 50초, 30Kpa로 10초를 반복하여 총 5분 동안 적용하였다.

5. 기억 능력 측정

단기 기억 형태이며 순차적인 행동능력을 평가하기 위한 방법으로 Y 미로 실험을 실시하였다21). 측정 장비는 세 개의 가지로 구성되어 있으며 각 가지의 길이는 40 cm, 넓이는 15 cm, 높이는 30 cm이고 세 가지가 접히는 각도는 120°이다. 모든 실험장치는 검정색의 polyvinyl plastic으로 구성되어 있다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 흰쥐를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 흰쥐가 들어간 가지를 이 때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점(실제변경, actual alternation)씩 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior) 은 3가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 다음의 수학식에 의해 계산된다.

변경 행동력(%) = 실제변경(actual alternation) / 최고변경(maximum alternation) × 100 (최고변경 : 총 입장횟수 - 2)

6. 단백질 정량 분석

행동실험 후 실험동물을 단두하여 희생시킨 후 즉시 뇌를 적출하여 출혈 쪽 해마부위를 lysis buffer로 단백질을 분리하고 BCP kit를 이용하여 정량하였다. 12% polyacrylamide gel에서 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리한 후 PVDF membrane에 점착시켰다. 1차 항체(BDNF, Santa Cruz, USA; GAPDH, Thermo, USA)를 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시키고 Las 4000 mini (GE Healthcare, USA)를 사용하여 밴드를 분석하였다.

7. 통계처리

본 실험에서 얻은 자료는 SPSS (version 19) 통계프로그램을 이용하여 처리하였다. 측정된 자료는 실험군 간 비교를 위하여 일원분산분석 (one-way ANOVA)를 유의차가 있는 경우 Turkey post hoc test를 실시하였으며, 통계적 유의수준은 p<0.05의 수준으로 검증하였다.

 

결 과

1. Y 미로실험을 통한 부항의 기억력 개선 효과 측정

1) 부항 1일 처치 후 Y 미로 실험 결과

Y 미로 실험을 통하여 각기 다른 모양의 표지를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 변경 행동력(Spontaneous alteration, %)을 측정한 결과, 모든 실험군은 통계적 유의성이 없었다(Fig. 1A). 실험동물의 전반적인 행동양상 및 운동 상태를 비교 검토하기 위하여 미로의 각 가지를 방문한 총 횟수(Total entry, NO.)를 비교한 결과 역시 실험군간의 유의성 차이가 없었다(Fig. 1B).

Fig. 1.Protective effect of cupping on the learning and memory dysfunction caused by collagenase in Y-maze test. Spontaneous alterations (A) and total entry (B) during 8-min trial were measured. The results did not differ between groups.

2) 부항 3일 처치 후 Y 미로 실험 결과

부항 처치 3일 후 Y 미로 실험을 이용한 순차적인 행동 양상을 측정한 결과 부항 처치 1일과 비슷한 결과로 변경 행동력(Spontaneous alteration, %)을 측정한 결과, 모든 실험군은 통계적 유의성이 없었으며(Fig. 2A), 미로의 각 가지를 방문한 총 횟수(Total entry, NO.)를 비교한 결과 역시 실험군간의 유의성 차이가 없었다(Fig. 2B).

Fig. 2.Protective effect of cupping on the learning and memory dysfunction caused by collagenase in Y-maze test. Rats were allowed to navigate for 8 min for the measurement of spontaneous alterations. A. Spontaneous alternation behavior was measured. B. The numbers of arm entries during an 8 min session were recorded. The results are presented as the means ± S.E.M.

3) 부항 5일 처치 후 Y 미로 실험 결과

부항 처치 5일 후 Y 미로 실험을 측정한 결과, sham군은 74.39±2.62%로 나왔으며, collagenase에 의해 뇌출혈이 일어난 control군은 58.83±2.17%로 변경 행동력(Spontaneous alteration,%)이 통계적으로 유의하게 감소하였으며, collagenase에 뇌출혈을 유발한 뒤 부항을 처치한 cupping군 그룹의 경우 65.12±2.73%로 5일처치 까지 통계적으로 유의성이 없었다(Fig. 3A). 또한 미로의 각 가지를 방문한 총 횟수(Total entry, NO.)를 비교한 결과 실험군간의 유의성 차이가 없었으며 변경 행동력과의 상관관계도 찾을 수 없었다(Fig. 3B).

Fig. 3.Protective effect of cupping on the learning and memory dysfunction caused by collagenase in Y-maze test. Rats were allowed to navigate for 8 min for the measurement of spontaneous alterations. A. Effect of cupping on the collagenase-induced memory impairment which was represented by spontaneous alteration impairment. The results are presented as mean ± S.E.M. Significant difference between the groups : ***p<0.001, sham group vs. control group. B. Total number of arm entries during 8-min trial.

4) 부항 7일 처치 후 Y 미로 실험 결과

부항 처치 7일 후 마지막 Y 미로 실험을 통하여 얻은 변경행동력(Spontaneous alteration, %)은, sham군은 83.22±2.45%로 나왔으며, collagenase에 의해 뇌출혈이 일어난 control군의 경우 56.98±3.27%로 떨어졌으며, 이는 통계적으로 유의하게 기억력이 감소하는 것을 보여주었고, collagenase에 뇌출혈을 유발한 뒤 부항을 처치한 cupping군의 경우 74.34±3.58%로 현저하게 증가되어 통계적으로 유의하게 인지력 향상효과를 보여주었다(Fig. 4A). 또한 실험동물의 전반적인 행동양상 및 운동 상태를 비교 검토하기 위하여 미로의 각 가지를 방문한 총 횟수(Total entry, NO.)를 비교한 결과 실험군간의 유의성 차이가 없었으며 변경 행동력과의 상관관계도 찾을 수 없는 것을 확인 하였다.(Fig. 4B).

Fig. 4.Protective effect of cupping on the learning and memory dysfunction caused by collagenase in Y-maze test. Rats were allowed to navigate for 8 min for the measurement of spontaneous alterations. A. Effect of cupping on the collagenase-induced memory impairment which was represented by spontaneous alteration impairment. The results are presented as mean ± S.E.M. Significant difference between the groups : ***p<0.001, sham group vs. control group; ##p<0.01, control group vs. cupping group. B. Total number of arm entries during 8-min trial.

2. 단백질 발현 양 비교

부항의 효과를 평가하기 위하여 신경영양인자 중 하나인 BDNF의 발현양을 측정한 결과 콜라게나아제 주입으로 뇌출혈이 유도된 대조군에서는 감소되었지만 뇌출혈 후 부항을 처치한 부항처치군의 경우 BDNF 발현양이 현저히 증가 되는 것을 확인하였다(Fig. 5).

Fig. 5.Effect of cupping on the protein levels of BDNF. The protein expression of BDNF was examined by western blot analysis. Proteins from tissue lysates were analyzed by using BDNF-specific antibody. GAPDH levels were monitored to ensure equal amount of protein loading. The results are presented as mean ± S.E.M. Significant difference between the groups : *p<0.05, sham group vs. control group; #p<0.05, control group vs. cupping group.

 

고 찰

뇌출혈은 뇌내출혈과 뇌동맥류 파열이나 정맥성중뇌주위출혈, 동정맥기형이나 혈관질환, 종양 등으로 인해 지주막하강에 출혈이 일어나 뇌척수액에 혈액이 혼입된 상태인 지주막하출혈로 크게 나뉘는데, 지주막하출혈에 비해 더 높은 사망률 및 유병율과 심각한 장애를 수반하는 것은 물론 허혈성 뇌졸중 환자의 30% 정도가 뇌출혈 형태로 변환하게 되는 것으로 알려져 있다22-24). 이러한 뇌출혈은 심각한 신경세포의 손상을 유발하며, 여러 신호전달체계를 거쳐 뇌손상을 일으켜 인지장애, 언어장애, 운동장애 등을 발생시킨다25-29). 뇌내출혈 동물 모델의 경우 자가 혈액주입 모델과 박테리아의 콜라게나아제 주입 모델로 나눌 수 있는데, 자가 혈액 주입 모델의 경우 한 번의 수술로 큰 출혈이 일어나는 것은 뇌내출혈 환자와 같지만, 많은 뇌내출혈 환자의 경우 24시간 내에 재출혈이 일어나는 것과 달라 출혈의 진행과 이로 인한 영향에 대해서 연구하기엔 부적합하다. 한편, 콜라게나아제는 단백질 분해 효소로 세포 안에 불활성 형태로 존재하나 염증과 같은 면역반응에 의해 활성되어 뇌 조직에 함유된 혈관의 콜라겐을 분해하여 뇌조직 주위로 혈액이 새어 나오게 하는데 이 경우 계속해서 출혈이 일어나는 간단하고, 신뢰성 있는 모델로 알려져있다30).

부항은 자율신경절이 위치하는 부분을 음압으로 자극함으로서 조직이나 장부에 영향을 주고 견갑통, 급성염좌 등과 같은 근골격계 질환이나 수면장애, 뇌경색 등의 신경계 관련 질환에 효과가 있다고 알려져 있다. 그 이에 생체전위나 체온과 같은 생리반응을 조절한다고 알려져 있다31). 이러한 보고들을 종합할 때 부항이 뇌출혈에 의한 기억력 감퇴를 방지하거나 회복시키는 효능이 있을 것으로 생각되어 이에 대한 효과를 관찰하고자 하였다.

뇌내출혈을 유발하기 위하여 웅성 백서의 뇌 해마부위에 bacterial collagenase type Ⅳ를 주입한 뒤 기억력 손상 및 향상을 알아보기 위해 Y 미로 실험을 진행하였다. 수술 후 부항을 1, 3회 처치한 뒤 진행한 실험에서 변경 행동력과 각 가지에 들어간 전체 횟수 및 운동력에는 큰 차이가 없었으나 5회 처치한 뒤 진행한 실험에서는 콜라게나아제를 주입한 대조군의 경우 정상대조군 보다 감소되었지만, 부항처치군은 대조군과 비슷한 것으로 나타나 부항의 효과를 알아 볼 수 없었다. 이에 반해, 7일 동안 부항을 처치한 뒤 Y 미로 실험을 진행한 경우 정상대조군과 비교하여 대조군은 변경 행동력이 감소되었고, 부항처치군은 현저히 증가됨을 확인 할 수 있었다.

BDNF는 뇌에서 관찰되는 대표적인 신경영양인자 중 하나로서, 노화 쥐에서 감소된 BDNF가 기억력과 가장 관계있는 해마의 CA1부분에서 운동에 의해 증가시켜 신경세포 가소성 및 신경전달을 증진시킴으로서 학습, 기억 및 인지 능력을 향상시키고, 외상성 대뇌 타박 손상 후 BDNF는 발현량이 감소하였지만 운동이 BDNF의 발현을 촉진시켜 신경세포생성을 촉진시킴으로써 소뇌의 기능장애를 개선시키며, 허혈성 뇌졸중으로 감소된 BDNF가 전침자극과 운동치료를 통해 BDNF의 발현을 증가시켜 운동기능 향상에 효과적이라고 알려져 있다32-34). 이처럼 BDNF가 뇌 신경세포의 생존과 분화, 신경세포생성을 가속화시켜 뇌질환에 도움이 되는 것으로 보고되었고, 본 연구에서 콜라게나아제 주입으로 BDNF가 감소가 되었으나 부항 처치를 통해 증가됨을 관찰 할 수 있었고 이가 인지력 향상을 유도하는 것으로 사료된다. 이 연구는 콜라게나아제 주입 뇌출혈 모델로 제한하였으며, 출혈의 정도와 부위에 따른 부항처치의 효과는 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

본 연구결과를 바탕으로 향후 임상에서 뇌출혈 환자에게 인지장애 억제 및 개선 할 수 있는 적정한 부항처치의 강도 및 빈도에 대한 정보를 제공해 줄 수 있을 것으로 생각된다.

 

결 론

오래전부터 내려오고 현재 대체의학으로 각광받고 있는 부항의 기억력 개선 효과를 알아보기 위해 Collagenase 주입으로 뇌출혈 유발된 기억력 감퇴 백서 동물 모델에 부항을 처치하여 인지기능 향상 효과 및 이와 관련하여 신경영양인자 중 하나인 BDNF의 관련성을 검증하였다. 기억력 측정하는 행동실험인 Y 미로 실험을 진행한 결과 변경 행동력이 부항 5일 처치하였을 때부터 sham군에 비하여 control군이 유의하게 감소하였으나 control군 과 cupping군의 차이는 통계적 유의성이 없었다. 부항을 7일 동안 처치한 경우 sham군과 control군이 유의하게 감소하였을 뿐만 아니라 cupping군이 control군과 비교하여 유의하게 증가하여 인지기능 향상을 확인하였다. 또한, BDNF 단백질양 비교를 한 결과 sham군에 비하여 control군이 유의하게 감소하였으나 cupping군의 발현양이 control군에 비하여 유의하게 증가하였다.

이상의 결과로 뇌출혈로 인해 기억력 감소가 장기적인 부항처치가 뇌의 가스 제거를 통해 BDNF를 활성시키고, 이로 인해 인지능력을 향상시키는 것을 알 수 있고 지속적인 연구를 통해 뇌출혈로 인한 기억력 손상의 예방 및 치료제로 활용될 수 있음을 시사한다.