Effects of Nerve Regeneration by Bogijetong-tang Treatment on Peripheral Nerves Damaged by Taxol and Crush Injury

보기제통탕이 말초신경병증 모델에서 신경 손상 회복에 미치는 영향

Abstract

Objectives : Effects of Bogijetong-tang (BJT) on peripheral nerve regeneration have been reported in a previous study on BJT but additional study on a damaged peripheral neuropathy where its damage level is physically and chemically more severe was needed. Plus, this study was conducted because there haven't been any studies for BJT on central nerve regeneration. Methods : In order to check the effect on central nerve regeneration, the study on cerebellum cells was started and the sciatic nerve was used to observe the effects on a peripheral nerve which was severely damaged both physically and chemically. Nerve recovery effects were observed by analyzing target proteins such as phospho-extracellular signal-regulated kinase, ${\beta}1$ integrin, neurofilament 200, growth-associated protein-43, cyclin-dependent kinase 1, phospho-vimentin, phospho-Smad, and caspase 3. Results : The significant changes of target protein in cerebellum neurons have been observed. The changes of index protein on the axon regeneration and the nerve recovery in the sciatic nerve have been observed and the effects on cell protection were observed, as well. Conclusions : This study confirmed that BJT made a significant influence on nerve protection and recovery of a damaged peripheral neuropathy and it also made a possibility of its regeneration in a damaged central nerve injury.

Ⅰ. 서 론

신경병성 통증은 중추신경, 말초신경계의 손상 또는 그 외의 기능이상 등의 원인으로 다양하게 발생하며, 손상 부위는 물론 손상과 무관한 부위에서도 수개월, 수년간 지속적으로 발생하는 만성 질환이다1.

말초 신경병증은 말초 신경을 침범한 질환을 통칭하는 말로, 중추 신경계 손상이 재생이 어려운 것으로 알려진 반면, 말초 신경병증은 손상 이후 축삭에서 재생이 일어나는 것으로 알려져 있다2. 대부분 감각 증상이 운동 증상보다 먼저 나타나며, 손상된 신경의 종류에 따라 증상이 다양하게 나타 난다3. 유병률은 성인의 2~8%로 나이가 들수록 증가하는 경향을 보이며, 원인은 대부분 당뇨병, 항암제로 인한 부작용, 알코올, 영양결핍, 중금속 등이 있다3. 특히 taxol 등의 항암제 부작용으로 인한 말초 신경병증은 환자들의 삶의 질 뿐만 아니라 치료 과정에 많은 영향을 주고 있지만 아직 명확한 치료법은 없는 실정이다4,5.

이러한 이유로 최근 국내 한의계에서는 말초 신경 병증에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있는데6-11, 특히 補氣除痛湯(BJT)10을 이용한 임상적 연구에서 당뇨병 및 항암제 부작용으로 발생한 말초 신경병증에 대한 효과가 보고된 바 있다10,11. 그리고 실험적 연구로 안7은 taxol 및 압좌손상으로 말초신경병증을 유발한 동물 모델에서 BJT가 비신경세포의 이주와 증식, 신경 세포 수의 증가와 구조의 회복, 슈반 세포의 증식에 효능이 있음을 보고하였으며, BJT 가감방 등6,8,9도 안7의 연구와 같이 신경세포의 증식, 슈반세포 증가 등의 효능이 보고되었다.

이에 저자는 BJT의 말초신경병증에 대한 임상적, 실험적인 효과를 바탕으로 보다 장기간 항암제에 노출됨과 동시에 압좌 손상을 주어, 신경손상을 심하게 준 조건에서 나타나는 효능을 알아보기 위해 실험을 진행하였다. 말초 신경에 미치는 영향을 알아보기 위해 좌골 신경을 2회 압좌 손상한 후 2주간 taxol 처리하여 유발된 말초 신경병증 rat 모델에 BJT를 처리하여 phospho-extracellular signal-regulated kinase(Erk)1/2, β1 integrin, neurofilament 200(NF-200), growth-associated protein-43(GAP-43), cyclin-dependent kinase 2(Cdc2), phospho-vimentin, phospho Smad, caspase 3 등의 지표 단백질 분석을 통해 신경 회복 효과를 관찰하였고, 항암제 투여시 발생할 수 있는 뇌세포 손상에 대해 탐색적 연구 목적으로 소뇌 세포를 배양하여 실험 관찰 하였다.

 

Ⅱ. 실 험

1. 재 료

1) 약 물

연구에 사용한 BJT 1첩의 내용과 용량은 다음과 같으며(Table 1), 약재는 (주)옴니허브(Korea)에서 구입하였다.

Table 1.Prescription of Bogijetong-tang (BJT).

증류수 1,000 ml에 약재를 넣고 2시간 동안 열탕 추출기에서 가열한 후, 여과하여 액을 얻었다. 감압 증류장치(rotary evaporator, Buchi B-480, Switzerland)를 이용하여 농축하고, 동결 건조기(freeze dryer, Eyela FDU-540, Japan)를 이용하여 완전히 건조 후, 냉동(-84℃) 보관하면서 생리식염수에 적당한 농도로 희석하여 사용하였다. BJT 1첩(178 g)에서 24.04g(수율 13.5%)의 추출물을 얻었다.

2) 동 물

본 연구에서는 7~8주령, 몸무게는 200~250 g된 Sprague-Dawely계열 수컷 흰쥐(SD rat)를 실험 동물로 사용하였으며 (주)대한바이오링크에서 구입하였다. 실험 동물은 실험 전 3~4일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후, 실험을 실시하였다. 고형사료(Samyang Co. Korea)와 물을 제약 없이 섭취하도록 하였고, 온도는 22~24℃, 습도는 50±10%가 유지되도록 하였으며, 조명은 밤낮 주기(12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경을 유지하였다. 본 실험은 대전대학교 동물 실험 윤리 규정을 준수하여 시행하였다.

3) 시 약

본 실험에 사용한 paclitaxel(Taxol; Sigma, USA)은 1 mg/ml의 농도로 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹여 사용 전까지 -20℃에서 보관해두었다가 사용 하였다. Neurofilament 200(Sigma, USA; NF-200), p-vimentin(MBL, Japan), cleaved caspase 3(Cell Signaling, USA), fluorescein goat anti-mouse IgG(Invitrogen, USA), rhodamine red-X goat anti-rabbit IgG(Invitrogen, USA), Hoechst 33258(Invitrogen, USA), polyclonal anti-cdc2(Santa Cruz Biotechnology, USA), phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody(Cell Signaling, USA), GAP-43(Santa Cruz Biotechnolo y, USA), goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, USA), goat anti-mouse IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, USA), p-Smad(Santa Cruz Biotechnology, USA), Smad(Santa Cruz Biotechnology, USA), β1 integrin(Santa Cruz Biotechnology, USA), β3 integrin(Santa Cruz Biotechnology, USA), active form β1 integrin(BD Bioscience, USA) 등을 사용하였다

4) 기 기

본 실험에 사용한 기기는 열탕추출기(DaeWoong, Korea), thermo bath(ALB64, HanYoung, Korea), 초음파분쇄기(model 100, Fisher Scientific, USA), 원심분리기(Micro 17TR, Hanil, Korea), 전기영동장치(80-6147-45, Amersham, USA), transfer unit (TE70, Amersham, USA), electrophoresis power supply(EPS 301, Amersham, USA), cryostat(CM 1850, LEICA, Germany), 형광현미경(Nikon DXM 1200F, Japan) 등 이다.

2. 방 법

1) 말초신경병증 모델

(1) In vivo 동물 실험

① 실험 동물 모델 확립

① normal군, ② 압좌 손상 이후 taxol(1.25 mg/kg)과 생리식염수 처리한 control군, ③ 압좌 손상 이후 taxol(1.25 mg/kg)과 BJT(400 mg/kg)를 투여한 BJT군으로 나누어 진행하였다. 압좌 손상은 양측 대퇴부 중간부위의 신경을 노출 후, forcep으로 30초간 2회의 일정한 힘(0.5~1 kg/mm2 pressure)을 가하여 손상을 유발하였고, taxol은 주사기를 이용하여 rat의 양쪽 sciatic nerve에 5 days/week, 2주동안 주입하였으며, 그 다음날부터 BJT를 7일간 1일 1회 구강 투여하였다. 각 군별 사용된 rat는 3마리였다.

② 면역형광염색

분리한 sciatic nerve는 -20℃에서 냉동시킨 후, cryostat를 이용하여 20 μm의 두께로 잘라 슬라이드에 부착시켰다. 이중 면역형광염색법(double immunofluorescence staining)을 수행하기 위해, 4% paraformaldehyde, 4% sucrose가 혼합된 인산 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 45분 동안 슬라이드를 넣어 고정하였다. 비특이적 결합을 막기 위해 blocking buffer에 담근 후, 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 1차 항체는 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유한 blocking buffer에 1:400의 비율로 혼합하여 처리한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후, PBST(PBS plus 0.1% triton X-100)로 씻어내고, 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유한 blocking buffer에 Fluorescein-goat anti-mouse(green)와 Rhodamine-goat anti-rabbit antibody(molecular probes)를 1:400으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 2차 항체 처리를 수행하였다. 이후 3회에 걸쳐 PBST로 세척을 수행하였다. Hoechst 핵 염색을 수행하는 경우 2회 PBST로 세척 후 0.25% Hoechst33258 염료를 함유한 PBST 용액으로 염색 처리한 후 다시 PBST 용액으로 세척하였다. 2차 항체는 빛에 민감하므로 반응 시간 동안 반드시 암실에서 수행하였다. 모든 조직 sample은 형광 현미경(Zeiss fluorescent microscope)을 통해 관찰하였고, 디지털 카메라로 찍은 모든 images는 Adobe Photoshop(version 5.5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭 시켜 관찰하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 images를 중복 시켜 관찰함으로써 각 단백질의 발현 위치를 관찰 하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 caspase-3(1:500, Cell Signaling, USA), Neurofilament 200(1:400, Sigma, USA), phospho-p44/42 Erk1/2(1:400, Cell Signaling, USA), anti-Cdc2(1:400, Santa Cruz Biotechnology, USA), p-vimentin(1:400, MBL, Japan), GAP43(1:400, Santa Cruz Biotechnology, USA), active form β1(1:400, BD Bioscience, USA), β1 integrin(1:400, Santa Cruz Biotechnology, USA), β3 integrin(1:400, Santa Cruz Biotechnology, USA) 과 p-Smad(1:400, Santa Cruz Biotechnology, USA)이었다.

③ Western blot 분석

분리한 sciatic nerve는 triton lysis buffer(20 mM Tris, pH 7.4, 137 mM NaCl, 25 mM β-glycerophosphate, pH 7.14, 2 mM sodium pyrophosphate, 2 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1% Triron X-100, 10% glycerol, 5 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml aprotinin, 2 μM benzamidine, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF)에 담가 초음파를 이용하여 분해하였다. 그 다음 각 sample 에 대한 단백질을 정량하였으며, 그 중 10 μg 단백질을 western blot 분석에 사용하였다. 정량한 단백질은 12% SDS-polyacrylamide gel(1.5 M Trisma base, 10% sodium dodecyl sulfate, 30% acrylamide, 10% ammonium sulfate, TEMED)상에서 전기영동 시킨 후, PVDF membrane(Pall Corporation, USA)에 전기이동 시켰다. 항체와의 비특이적 결합을 막기 위해 3% bovine serum albumin(BSA, Sigma, USA), 0.1% Tween 20을 함유하는 TBS buffer에서 membrane을 1시간 동안 상온 반응시키고 4℃에서 16시간 동안 blocking buffer상에서 반응을 진행하였다. 반응을 끝낸 membrane을 washing 한 후, 1차 항체를 blocking buffer(1×TBS buffer, 3% BSA, 0.1% Tween 20)에 정해진 비율로 희석하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음 membrane을 씻어내고 anti-rabbit IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA) 또는 anti-mouse IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)가 결합되어 있는 horseradish peroxidase를 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 30분 동안 처리하고 다시 한 번 씻어냈다. 마지막으로 membrane에 부착된 단백질을 western blotting detection system을 이용하여 측정하였으며 Kodak Scientific Imaging Film(Eastman Kodak Co., USA) 에 감광하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody(1:4,000, Cell signaling, USA), monoclonal anti-Cdc2(1:2,000, Santa Cruz Biotechnology, USA), monoclonal phospho-vimentin(1:2,000, MBL, Japan), p-Smad(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA)), active form β1 (1:1000, BD Bioscience, USA), β3(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), polyclonal β1 integrin (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, USA), GAP43(1:2000, Santa Cruz Biotechnology, USA) 등 이었다.

(2) In vitro

① 실험 세포 모델 확립

① normal군 ② taxol(0.01 μg/ml)과 식염수 처리한 control군 ③ taxol(0.01 μg/ml)과 BJT(0.3 mg/ml)처리한 BJT0.3군 ④ taxol(0.01 μg/ml) 및 BJT(0.5 mg/ml) 처리한 BJT0.5군으로 나누어 진행하였다.

② Dorsal root ganglia(DRG) 배양

본 신경조직세포 배양에 대한 일반적 방법 및 원리는 Banker와 Goslin12의 방법을 참조하였다. 유리 coverslip은 poly-L-ornithine(0.1 mg/ml, Sigma, USA)과 laminin(0.02 mg/ml, Collaborate research, USA)을 혼합하여 실온에서 pre-coating하였다. 슈반 세포와 DRG neuron을 배양하기 위해, rat의 좌골신경과 요추 4~6에서 DRG를 분리하여 ice-cold BME medium(Gibco, USA)에 넣었다. 분리한 좌 골신경과 DRG는 type XI collagenase(2,500 U/ml, Sigma, USA)를 포함한 BME를 처리하여 37℃에서 90분 동안 유지하였다. 조직을 BME으로 세척한 후 상층액을 제거하기 위해 3,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한 후, 다시 한 번 세척 후 세포를 BME에 녹여서 화염 멸균한 pasteur pipette을 16~20번 통과하여 분리시키고 상층액을 제거하기 위해 3,000 rpm에서 1분 동안 원심 분리하였다. cell은 type SII trypsin(0.5 mg/ml)을 포함한 BME로를 15분간 처리한 후 trypsin inhibitor(100 mg/ml), EDTA(1mM) and DNase I(80 mg/ml)를 포함한 BME로 5분간 처리하였다. 배양배지(5% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS, Gibco, USA), 5% horse serum, 2 mM glutamine and 1% penicillin-streptomycin을 포함한 BME)로 세척한 DRG sensory neuron(1.5x102 cells neuron)을 12 mm round coverslip 위에 plating 하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 12시간 동안 배양한 뒤 새로운 배지로 갈아주었다. DRG neuron에 taxol(0.01 μg/ml), BJT(0.3 mg/ml & 0.5 mg/ml) 또는 DMSO 용액을 처리하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

③ 면역형광염색

배양한 cerebella neuron과 DRG neuron에 대해 이중 면역형광염색법(double immunofluorescence staining)을 수행하기 위해, 4% paraformaldehyde, 4% sucrose가 혼합된 인산 완충 용액(phosphate buffered saline; PBS)에 45분 동안 고정하였다. 이후의 실험 과정은 in vivo 실험 과정과 동일하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 Neurofilament 200(1:400, Sigma, USA)와 S-100β(1:400, Santa Cruz Biotechnology, USA)이었다.

④ Neurite outgrowth 측정

NF-200으로 염색한 neuron을 i-solution 프로그램을 이용하여 neurite 길이를 측정하였다

⑤ 조직 sample의 현미경 분석면역형광조직은 Nikon 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 현미경에 부착된 디지털 카메라로 이미지를 포착하여 ACT-1 software를 이용하여 분석하였다. 중첩 이미지는 Photoshop 프로그램상의 image blend mode 를 이용하여 분석하였다.

2) Taxol 처리 소뇌 세포 모델

(1) In vitro

① 실험 세포 모델 확립

① normal군, ② taxol(0.01 μg/ml) 및 식염수 처리한 control군, ③ taxol(0.01 μg/ml) 및 BJT(0.3 mg/ml) 처리한 BJT0.3군, ④ taxol(0.01 μg/ml) 및 BJT (0.5 mg/ml) 처리한 BJT0.5군으로 나누어 진행하였다.

② 소뇌 신경 세포(cerebella neuron) 배양

소뇌의 과립 세포(granule cell)는 생후 6~8일의 rat으로부터 소뇌조직을 분리 후 즉시 세포배양을 실시하였다. 세포 배양은 D’Mellow13의 방법에 준하여 실시하였다. 세포 배양을 위하여 배양 접시는 ornithine(Sigma, USA, 15 μg/ml)과 poly-D-lysine (Collaborative Research, 50 μg/ml)으로 처리한 후 사용하였다. 신경세포는 10% heat-inactivated bovine calf serum, 25 mM KCl, 35 mM glucose, 1 mM L-lysine, 100 U/ml penicillin, 그리고 0.1 mg/ml streptomycin을 함유한 basal medium eagle(BME)에서 배양하였다. 세포는 5% CO2 37℃ 조건에서 배양하였으며 배양 개시 1일 후 비신경 세포를 제거하기 위하여 cytosine-βD arabinoside(Ara-C, Sigma, USA, 10 uM)를 처리하였다. 세포는 4일간 배양하였으며 마지막 24시간 동안 taxol(0.01 μg/ml)을 처리하였다.

③ Western blot 분석

Western blot 분석은 상기 언급된 말초신경병증 모델과 동일한 방법으로 진행하였다.

3) 통계 분석

실험 집단 간 수치 데이터는 mean+SE로 기록 하고, one-way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 비교 분석하였다. P 값이 0.05 미만인 경우로 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 통계 분석은 SPSS version 14.0 software(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다.

 

Ⅲ. 결 과

1. 말초신경병증 모델

1) DRG 감각 신경 배양신경세포의 형태적 변화분석

(1) NF-200을 통한 DRG 감각 신경의 성장에 미치는 영향

DRG 감각 신경 세포의 신경 돌기 성장을 조사 하였다. Control군에서는 normal군에 비하여 신경 돌기가 131±5.8 μm(p<0.001)로 유의성 있게 감소하였고, BJT0.3군에는 194±4.2 μm(p<0.001), BJT0.5 군에서는 171±6.1 μm(p<0.01)로 control군에 비하여 유의성 있게 증가하였다(Fig. 1A, B). 각 신경 세포로부터 신경 돌기의 가지 수는 유사하게 관찰 되었다.

Fig. 1.Pattern of neurite outgrowth of cultured DRG neurons. DRG sensory neurons were treated with taxol and BJT at 0.3 mg/ml or 0.5 mg/ml for 24 h. Cells were visualized by immunofluorescence staining for protein (blue). Mean neurite length of 3-5 different neurons per slide in each experimental group was measured. Statistical comparison among experimental groups was made by comparing average values of 4 different slides from each group.A : Representative images of immunostained cells, B : Quantification of neurite outgrowth, *** : p<0.001 (vs normal group), †† : p<0.01, ††† : p<0.001 (vs control group)Normal : non-treated groupControl : taxol (0.01 μg/ml)+salineBJT0.3 : taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.3 mg/ml)BJT0.5 : taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.5 mg/ml)

(2) NF-200, Hoechst염색을 통한 DRG 감각신경 분포에 미치는 영향

DRG 배양 시 함께 배양된 비신경 세포의 영향을 조사하기 위하여 Hoechst 33258에 의하여 세포들의 핵 분포를 동일 image상에서 조사하였다. Control 군에서는 신경돌기와 핵의 위치가 일치하지 않은 반면 BJT군에서는 핵과 DRG 감각 신경 세포의 위치, 특히 신경 돌기가 뻗어가는 방향이 적정 수준으로 일치하는 것을 관찰하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Distribution of DRG neurons and non-neuronal cells of cultured DRG tissue. Cultured DRG cells including sensory neurons and non-neuronal cells were identified by NF-200 immunostaining (green) and Hoechst nuclear staining (blue). Merged images show high levels of proximity between neurites and individual nuclei in their distributions.Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+salineBJT0.3 : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.3 mg/ml)BJT0.5 : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.5 mg/ml)

2) 좌골 신경 조직의 분석

(1) NF-200을 통한 좌골 신경 축삭의 형태적 변화에 미치는 영향

NF-200염색을 통해 축삭의 형태적 변화를 분석 하였다. Control군에서는 손상 부위 및 원위부에서 NF-200 염색이 약하게 나타난 반면, BJT군에서는 NF-200 염색이 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 3).

Fig. 3.Immunofluorescence staining analysis of NF-200 protein signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. NF-200 protein signals were detected in the nerves sections (in green).Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(2) Hoechst염색을 통한 좌골 신경의 손상부위 비신경 세포수에 미치는 영향

좌골 신경 손상 부위에서 염색되는 핵의 수치적 변화를 Hoechst 33258 면역형광분석 통하여 관찰하였다. Control군에서는 normal군에 비하여 근위부는 207±22.5 cells/0.5 mm2, 손상 부위는 183±13.6 cells /0.5 mm2, 원위부는 191±21.8 cells/0.5 mm2로 유의성있게 증가하였고, BJT군에서도 normal군에 비하여 근위부는 229±17.6 cells/0.5 mm2, 손상 부위는 263±15.4cells/0.5 mm2, 원위부는 287±23.5 cells/0.5 mm2로 모두 유의성(p<0.01) 있게 증가하였다. BJT군은control 군보다 손상 부위는 263±15.4 cells/0.5 mm2(p<0.01), 원위부는 287±23.5 cells/0.5 mm2(p<0.05)로 유의성 있게 증가하였다(Fig. 4A, B).

Fig. 4.Hoechst nuclear staining of sciatic nerve sections. Longitudinal nerve sections were used for Hoechst nuclear staining, and individual nuclei were detected (in blue). A : Representative images in nerve sections for individual experimental groups, B : Quantitative comparison of the number of nuclei among individual experimental groupsMean neurite length of 3-5 different neurons per slide in each experimental group was measured. Statistical comparison among experimental groups was made by comparing average values of 4 different slides from each group, error bar : SEM. ** : p<0.01 (vs normal group), † : p<0.05, †† : p<0.01 (vs control group)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(3) GAP-43를 통한 좌골 신경 세포에 미치는 영향

GAP-43 단백질의 생성을 분석하였다. Normal군에서는 GAP-43는 전혀 탐지되지 않았으나 control군에서는 단백질 신호가 낮은 수준으로 관찰되었다. BJT군에서는 control군에 비해 손상 근위부를 비롯하여 손상부위 및 손상 원위부에서 GAP-43 단백질 신호를 관찰할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5.Immunofluorescence staining analysis of GAP-43 protein signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. GAP-43 protein signals were detected in the nerves sections (in red). In experimental groups treated with taxol plus saline or BJT, proximal, injury, distal areas of the nerve were analyzed separately.Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(4) Cdc2 kinase 생성에 미치는 영향

Cdc2 kinase 단백질의 생성 변화를 3마리의 rat 를 이용하여 각각 western blot 분석하였다. Normal군에서는 Cdc2 단백질은 전혀 탐지되지 않았고, control군에서는 적정 수준의 Cdc2 밴드를 나타내었으며, BJT군에서는 각각 3.96, 5.12, 6.32로 control군에 비하여 Cdc2 밴드가 유의성(p<0.01)있게 증가하였다(Fig. 6).

Fig. 6.Western blot analysis of Cdc2 in protein samples from the sciatic nerves. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. Cdc2 protein was identified as a single band at 34 kDa. A : Western blot image, B : Quantitation of individual band, †† : p<0.01 (vs control group)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)

(5) Cdc2 분포에 미치는 영향

Cdc2 단백질의 분포를 조사하기 위하여 좌골 신경 조직에 대한 면역형광염색 실험을 실시하였다. Normal군에서는 전혀 관찰되지 않았고 control군에서는 손상 근위부에서 섬유상 형태로 관찰되었다(Fig. 7A). BJT군에서는 손상 근위부와 손상 부위에서 증가하는 것으로 관찰되었고 손상 원위부에서 특정 부위에 강한 단백질 신호를 나타내었다. 좌골 신경의 횡단 조직에 대해 이중 면역형광염색을 실시한 결과, 슈반 세포의 지표 단백질인 S100β 신호와 완벽하게 중첩되었다(Fig. 7B). 반면 Cdc2단백질 신호는 신경 세포에서 생성되는 NF-200 단 백질에 대한 면역형광 이미지와 전혀 중첩되지 않았다(Fig. 7C).

Fig. 7.Immunofluorescence staining analysis of Cdc2 protein signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. Cdc2 protein signals were detected in the nerves sections (in red). In experimental groups treated with taxol plus saline or BJT, proximal, injury, distal areas of the nerve were analyzed separately.A : Representative fluorescence staining images, B : Double immunofluorescence staining of Cdc2 and S100β protein signals, C : Double immunofluorescence staining of Cdc2 and NF-200 protein signals Transverse nerve sections from the injured sciatic nerves were used to examine colocalization of two proteins.Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(6) phospho-vimentin을 통한 Cdc2 kinase의 활성도에 미치는 영향

Cdc2의 기질 단백질중 하나인 vimentin의 인산화 수준을 조사하였다. 3마리의 rat를 이용하여 각각의 좌골 신경의 western blot 분석 결과, normal군에서는 전혀 관찰되지 않았고, control군에서는 적정수준의phospho-vimentin이 생성되었다(Fig. 8A, B). BJT군에서는 각각 4.01, 6.41, 6.19로 control군에 비해 phospho-vimentin이 유의성(p<0.001) 있게 증가하였다.

FIG. 8.Western blot analysis of phospho-vimentin in protein samples from the sciatic nerves. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. phospho-vimentin was identified as a single band at 57 kDa.A : Western blot image, B : Quantitation of individual band, ††† : p<0.001 (vs control group)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)

(7) Phospho-vimentin을 통한 좌골 신경 세포에 미치는 영향

Phospho-vimentin 단백질을 면역형광분석을 통해 좌골 신경에서 분석하였다. Normal군에서는 phospho-vimentin 신호가 탐지되지 않았고 control군에서는 손상 부위 특히, 손상 근위부 조직상에서 관찰되었다. BJT군에서는 phospho-vimentin 단백질 신호가 손상 주변 부위에 고르게 관찰되었는데, 특히 손상 근위부와 원위부에서 조직 내부에 고르게 존재하는 것으로 확인되었다(Fig. 9).

Fig. 9.Immunofluorescence staining analysis of phospho-viment in signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. Phospho-vimentin signals were detected in the nerves sections (in green). Phospho-vimentin signals were analyzed separately from proximal, injury, and distal nerve stumps.Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(8) β1 Integrin을 통한 좌골 신경 세포에 미치는 영향

Integrin 단백질 계열의 반응성을 분석하기 위하여 먼저 β1 integrin 단백질의 생성을 분석하였다. Normal군에서는 낮은 수준의 β1 integrin이 관찰되었다. Control군에서는 손상 근위부 및 원위부에서 다소 증가된 단백질 신호를 관찰되었고(Fig. 10A)BJT군에서는 control군에 비해 β1 integrin 단백질생성 수준이 뚜렷한 변화를 나타내지 않았다. β1 integrin의 조직내 분포를 분석하기 위하여 핵 염색과 중첩된 image를 분석한 결과 β1 integrin 신호는 세포핵의 밀집부위에서 강한 신호를 나타내는 것으로 확인되었다(Fig. 10B).

Fig. 10.Immunofluorescence staining analysis of β1 integrin signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. β1 integrin signals were detected in the nerves sections (in red). β1 integrin signals were analyzed separately from proximal, injury, and distal nerve stumps. A : Representative images of phospho-Smad in the sciatic nerves, B : Merged images of β1 integrin with Hoechst-stained individual nuclei (blue)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(9) Active β1 Integrin을 통한 좌골 신경 세포에 미치는 영향

Active β1 integrin의 조직상 분포를 조사하기 위하여 신경 조직에 대한 면역형광분석을 실시하였다. Normal군에서는 Active β1 integrin은 관찰되지 않았고, control군에서는 근위부 및 원위부를 포함한 신경조직에서 일정한 수준으로 생성되었다(Fig. 11A). BJT군에서는 control군에 비해 원위부에서 뚜렷한 단백질 신호를 나타내는 것으로 확인되었다. Active β1 integrin과 β1 integrin 단백질의 상대적 분포를 확인하기 위하여 두 단백질을 동일 조직상에서 분석하였다. Active β1 integrin 단백질은 β1 integrin의 단백질 생성 부위에 중첩되는 것으로 확인되었다(Fig. 11B).

Fig. 11.Immunofluorescence staining analysis of active β1 integr in signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. β1 integrin signals were detected in the nerves sections (in red). Active β1 integrin signals were analyzed separately from proximal, injury, and distal nerve stumps. A : Representative images of active β1 integrin signals in the sciatic nerves, B : Merged images of active β1 integrin with β1 integrin (red)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(10) β3 integrin, NF-200을 통한 좌골 신경 세포에 미치는 영향

신경 손상의 β3 integrin 단백질 생성 수준의 변화를 조사하였다. Normal군에서는 β3 integrin 단백질이 관찰되지 않았으며 control군에서는 신경 조직에 뚜렷한 단백질 신호를 나타내었다(Fig. 12A). BJT군에서는 β3 integrin 단백질 신호가 원위부에 집중되는 것으로 관찰되었다. β3 integrin 단백질 신호와 NF-200 단백질 신호와의 중첩 이미지를 분석한 결과 상당부분 β3 integrin 단백질과 중첩되는 것으로 관찰되었다(Fig. 12B). 반면 약간의 β3 integrin 단백질은 NF-200과 중첩되지 않았다.

Fig. 12.Immunofluorescence staining analysis of β3 integrin signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. β3 integrin signals were detected in the nerves sections (in red). β3 integrin signals were analyzed separately from proximal, injury, and distal nerve stumps. A: Representative images of β3 integrin signals in the sciatic nerves, B : Merged images of active β3 integrin with NF-200 (green)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(11) phospho-Erk1/2 Western blot 분석을 통한 비신경 세포에 미치는 영향

비신경 세포의 활성도를 조사하기 위하여 western blot 분석을 통해 phospho-Erk1/2 단백질 생성 수준을 관찰하였다(Fig. 13A, B). Normal군에서는 전혀 관찰되지 않았다. Control군에서는 약한 수준으로 관찰되었으며 BJT군에서는 control군에 비해 높은 수준으로 밴드가 관찰되었다

Fig. 13.Western blot analysis of phospho-Erk1/2 in protein samples from the sciatic nerves. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. phospho-Erk1/2 was identified as double bands at 42 and 44 kDa.Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)

(12) phospho-Erk1/2 면역형광염색을 통한 비신경 세포에 미치는 영향

조직상의 phospho-Erk1/2 단백질 생성을 면역형 광염색을 통하여 분석하였다. Normal군에서는 단백질 신호가 관찰되지 않았고 control군에서는 약한 수준으로 손상 부위 및 원위부에서 관찰되었다. BJT군에서는 손상 원위부에서 상대적으로 증가된 뚜렷한 단백질 신호가 관찰되었다(Fig. 14A). Phospho-Erk1/2의 분포를 조사하기 위하여 핵 염색 이미지와 중첩 분석한 결과, 많은 phospho-Erk1/2 단백질이 핵 주변부에 위치하는 것을 확인하였다(Fig. 14B).

Fig. 14.Immunofluorescence staining analysis of phospho-Erk1/2 signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. Phospho-vimentin signals were detected in the nerves sections (in red). Phospho-vimentin signals were analyzed separately from proximal, injury, and distal nerve stumps. A : Representative images of phospho-Erk1/2 in the sciatic nerves, B : Merged images of phospho-Erk1/2 with Hoechst-stained individual nuclei (blue)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(13) phospho-Smad를 통한 좌골 신경 세포에 미치는 영향

Phospho-Smad 단백질 생성 수준의 변화를 조사 하였다. Normal군에서는 관찰되지 않았으며 control군에서는 손상 부위에서 약한 신호와, 원위부에서 약간 더 증가된 수준의 신호를 관찰하였다(Fig. 15A). BJT군에서는 손상 부위에서 강한 단백질 신호가 유도된 것을 관찰하였다. Phospho-Smad 단백질을 Hoechst 핵 염색 이미지와 중첩시킨 결과, phospho-Smad 단백질 신호는 핵 부위에 집중되는 것을 확인하였다(Fig. 15B).

Fig. 15.Immunofluorescence staining analysis of phospho-Smad signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. Phospho-Smad signals were detected in the nerves sections (in red). Phospho-Smad signals were analyzed separately from proximal, injury, and distal nerve stumps. A : Representative images of phospho-Smad in the sciatic nerves, B : Merged images of phospho-Smad with Hoechst-stained individual nuclei (blue)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT (400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

(14) Caspase 3를 통한 좌골 신경 세포에 미치는 영향

Caspase 3 단백질 신호를 분석하였다. Normal군에서는 caspase 3가 전혀 관찰되지 않았고 control군에서는 손상 부위 및 원위부에서 상대적으로 강한caspase 3 단백질 신호를 관찰하였다(Fig. 16A). BJT군에서는 caspase 3 생성 수준이 크게 감소하여 신경 조직에서 거의 관찰되지 않았다. Casapse 3 단백질 신호를 조직상의 핵 염색 이미지와 중첩하여 분석한 결과, caspase 3 단백질 신호가 세포핵 주변부에 집중되는 것을 확인하였다(Fig. 16B).

Fig. 16.Immunofluorescence staining analysis of Caspase 3 signals in the longitudinal sciatic nerve sections. Following nerve injury, taxol plus saline or BJT was treated as indicated in the Materials and Methods. Caspase 3 signals were detected in the nerves sections (in red). Caspase 3 signals were analyzed separately from proximal, injury, and distal nerve stumps. A : Representative images of Caspase 3 signals in the sciatic nerves, B : Merged images of Caspase 3 with Hoechst-stained nuclei (blue)Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+salineBJT : sciatic nerve injury+taxol (1.25 mg/kg)+BJT(400 mg/kg)P : proximal, I : injury, D : distal

2. Taxol 처리 소뇌 세포 모델

1) phospho-Erk1/2를 통한 소뇌 배양 세포에 미치는 영향

소뇌 배양 세포에 taxol과 BJT 처리 후 세포의 생존 및 분화적 특성의 변화를 조사하기 위해 phospho-Erk1/2 단백질 생성 수준을 조사하였다. Normal군에서 일정한 수준으로 생성되던 phospho-Erk1/2는 control군에서 크게 감소되고, BJT0.3군과 BJT0.5군 모두에서 정상 수준 정도로 대조군에 비하여 발현이 증가되었다(Fig. 17).

Fig. 17.Western blot analysis of phospho-Erk1/2 in protein samples of cultured cerebellar neurons. Cultured cells were treated with reagents indicated in the Figure. Phospho-Erk1/2 protein is identified as two bands at 42 and 44 kDa. Western blotting for actin protein was performed as an internal loading control. BJT (0.3) and BJT (0.5) indicate BJT treatments with concentrations of 0.3 mg/ml and 0.5 mg/ml.Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+salineBJT0.3 : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.3 mg/ml)BJT0.5 : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.5 mg/ml)

2) β1 integrin을 통한 소뇌 배양 세포에 미치는 영향

소뇌 배양 세포에서 β1 integrin의 생성 수준의 변화를 조사하였다. Normal군에서는 일정 수준의β1 integrin이 검출되었고, control군에서는 normal 군에 비해 감소되었다. BJT0.3, BJT0.5군에서는 모두에서 대조군에 비하여 발현이 증가되었다(Fig. 18).

Fig. 18.Western blot analysis of β1 integrin in protein samples of cultured cerebellar neurons. Cultured cells were treated with reagents indicated in the Figure. β1 integrin protein is identified as a single band at 57 kDa. Western blotting for actin protein was performed as an internal loading control. BJT (0.3) and BJT (0.5) indicate BJT treatments at 0.3 mg/ml and 0.5 mg/ml.Normal : non-treated groupControl : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+salineBJT0.3 : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.3 mg/ml)BJT0.5 : sciatic nerve injury+taxol (0.01 μg/ml)+BJT (0.5 mg/ml)

 

Ⅳ. 고 찰

말초 신경병증은 신경근, 뒤뿌리절, 상완 신경총, 요천추 신경총, 뇌신경(1.2뇌신경 제외) 및 운동, 감각 자율신경을 침범하는 모든 질환을 총칭하는 것으로3 축삭, 수초, 세포체, 지지체 조직, 신경에 혈액을 공급하는 영양 혈관 등의 이상으로 인해 초래될 수 있으며 wallerian 퇴화, 분절성 퇴화, 원위축삭퇴화의 3가지 기본적인 병리 현상으로 구분 한다14. 말초 신경병증을 유발하는 원인으로는 대사성 질환, 감염성 질환, 면역 매개성 질환, 유전성질환, 독성물질로 인한 질환 등이 있다3.

말초 신경병증의 치료는 일반적으로 기저 질환 뿐 만아니라 통증 및 감각 이상을 조절하기 위한 치료가 동반된다. 흔히 통증 치료를 위해 삼환계 항우울제를 우선 적용하며, 추가적으로 tramadol등의 진통제나 gabapentin, carbamazepine, clonazepine등의 항경련제를 증상에 맞춰서 사용한다. 이외에도 국소 마취제, 마약성 진통제도 사용하는데3 치료율이 낮고 부작용이 흔하게 발생하는 것으로 알려져 주의를 요한다15.

항암제 사용으로 인한 말초 신경병증은 환자의 나이, 항암제의 용량, 강도, 축적 용량, 치료 기간, 다른 약물 투여 등에 따라 빈도가 다양하지만 투여 받는 환자의 30~40%에서 말초 신경병증이 발생하는 것으로 알려져 있다16. 또한 항암제로 인한 경우 일반적으로 치료 초기, 항암 1~3주기 내에 시작되며 치료 3개월째에 증상이 가장 극심해지는 경향을 보인다17. 이처럼 높은 유병률과 다양한 증상으로 말초 신경병증이 발생한 경우 항암제의 용량을 줄이거나 치료 기간이 길어지거나 혹은 항암치료를 중단하는 경우까지 발생하는 등 환자의 치료에 부정적인 결과를 초래한다18.

특히 항암제중 말초 신경병증을 잘 유발시키는 taxol은 주목 나무껍질에서 추출한 항암 물질로 난소암, 유방암, 폐암, 위암 등에 효과가 있다고 보고 되어 널리 쓰이고 있다19. Taxol은 신경 세포의 성장과 유지의 중요한 인자인 미세소관(micro tubules)을 비정상적으로 형성하여 신경 세포의 사멸을 일으켜 말초 신경병증을 유발하는 것으로 주로 굵은 감각 신경을 침범하여 신경 손상을 유발한다3,19. 감각이 둔해지거나 저린 느낌 등의 감각 실조와 심할 경우 보행 장애등의 조화 운동 불능 상태를 유발하며3, 복용 환자의 50~90%까지 말초 신경병증을 유발한다고 알려질 만큼 부작용이 큰 물질이기도 하다20.

한의학적으로 말초 신경병증은 痺證과 麻木, 痿證의 범주로 볼 수 있다. 痺證은 임상에서 대게 점차 악화되거나 반복 발작하는 특징을 갖는 질환으로 筋肉과 關節이 濡養을 받지 못하여 발생한다. 麻木은 不仁또는 麻木不仁이라고 하며 보통 麻와 木이 동시에 발생하는 경우가 많다. 痿證은 근맥이 이완되어 수족이 痿軟無力한 것을 말하는데, 주로 하지의 수의 운동 및 보행 장애가 나타나므로 ‘痿躄’이라고도 한다21.

반면 중추 신경 손상은 말초 신경병증과 다르게 재생이 되지 않으며 손상 반응의 대부분이 비가역적이어서 사실상 증상의 회복이 어렵고 결국 기능 상실로 이어지는 것으로 알려져 있다2,22. 이는 중추 신경계 손상 후에 신경 괴사가 나타나고 교세포의 증식을 특징으로 하는 반흔이 형성되는데 이 반흔을 구성하는 성상교세포가 신경 세포 축삭의 재생을 억제하는 물질을 생성하여 신경 재생에 물리적, 분자학적인 장벽으로 작용한다22,23. 한의계에서는 이 등24-28의 연구를 통해 개별 한약재가 중추 신경에 미치는 영향에 대한 연구가 진행되어 한약재가 유의한 효과를 보일 수 있음이 보고되었으나, 임상적으로 주로 쓰이는 복합 처방에 대한 임상 연구나 실험적인 연구는 많이 부족한 실정이다.

그간 말초 신경병증에 대한 BJT 및 BJT 가미방에 대한 연구는 김10, 조 등11의 당뇨병성 및 항암제로 유발된 말초 신경병증에 대한 임상 연구와 김 등6-9의 좌골신경 압좌 손상 및 단기간 taxol 처리로 유발된 말초신경병증 rat의 실험적 연구가 보고되었으나, 신경 손상 정도에 따른 BJT의 효능에 대한 연구는 보고된 바 없었기에 물리적 화학적으로 강한 자극에 손상된 실험 모델에 대한 추가적 인 연구가 필요한 상황이다.

본 연구에서 사용한 BJT는 당뇨병10이나 항암제11로 유발된 말초 신경병증에 사용하여 임상적으로 유의한 효능이 보고된 처방이다. 또한 김 등6-9의 BJT 및 BJT 가미방의 실험적 연구에 의해 p-Erk1/2, Cdc2, p-vimentin, β1 integrin 등의 신경 재생에 대한 지표 단백질을 활성화시키고 caspase 3의 발현을 감소시켜 신경세포 재생 및 보호 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다.

이에 저자는 BJT가 물리적 화학적으로 보다 강한 자극에 의해 유도된 말초 신경 손상의 재생에 미치는 효과를 알아보기 위해 rat의 좌골 신경을 2 회 압좌 손상 후, 2주간 taxol 처리하여 신경 손상을 유도하였다. 또한 항암제 투여시 발생할 수 있는 뇌세포 손상에 대한 BJT 효과를 알아보기 위해 탐색적인 연구로 소뇌 세포를 배양하여 taxol 처리 및 BJT 처리 후 phospho-Erk1/2, β1 integrin을 관찰하였다. 축삭의 재생과 신경 돌기 성장을 관찰하기 위해 NF-200을 관찰하였고 세포의 신호 전달을 알아보기 위해 β1 integrin을 관찰하였다. 또한 슈반 세포의 증식과 이동을 살펴보기 위해 phospho-Erk1/2, Cdc2, phospho-vimentin을 관찰하였고. 세포 자멸을 관찰하기 위해 caspase 3를 관찰하였다. 그 결과, 상기 지표 단백질의 변화를 관찰하여 BJT가 신경 회복에 유의한 영향을 주는 결과를 도출하였다.

말초 신경병증에 미치는 영향을 조사하기 위해 DRG 감각 신경 세포를 배양하고 좌골 신경을 관찰하였다. 먼저 손상된 신경 세포의 성장에 대한 반응을 조사하기 위하여 DRG 감각 신경 세포를 배양 후, 신경 돌기의 성장을 조사하였다(Fig. 1, 2). 이는 taxol이 신경 세포를 손상시켜 성장을 저해시킨 것이며, BJT 투여로 신경 세포가 성장했고 특히 새로운 신경 가지의 생성 유도 보다는 기존의 신경 가지의 크기를 성장시키는 것으로 생각된다.

또한 Fig. 1의 실험 배양시 함께 배양된 비신경 세포의 영향을 조사하기 위하여 Hoechst염색으로 세포들의 핵 분포를 동일 image 상에서 조사하였는데, 이는 신경 세포의 재생에 있어서 비신경 세포들의 역할이 크며 곧 BJT가 비신경 세포의 대부분을 차지하고 있는 슈반 세포의 증식에 영향을 주는 것으로 해석된다. 이는 안7의 연구와 같은 효과를 보여 보다 더 강한 자극에 손상된 말초 신경 병증 모델에서도 BJT가 동일한 효과를 나타냄을 알 수 있다.

좌골 신경 손상 부위 조직에 NF-200을 염색하여 축삭의 형태적 특성을 분석하였다(Fig. 3). Taxol 처리로 신경 세포가 손상된 것을 의미하며 원위부의 세포까지도 하행성으로 같이 손상되는 것을 의미한다. 또한 BJT군에서 손상 부위 및 원위부에서 강한 신호를 나타내는 것은 BJT가 축삭의 손상 부위 및 하단부로의 세포 재생을 촉진하는 것으로 해석된다.

축삭 재생 반응성의 변화를 관찰하는 방법으로서 좌골 신경 손상 부위에서 염색되는 핵의 수치적 변화를 관찰하였다(Fig. 4). 이를 Fig. 3의 실험과 함께 분석해 볼 때, 압좌 손상 이후 taxol처리로 인해 신경 줄기가 파괴되어 보상 효과로 슈반 세포들이 손상 부위 주변으로 이동하는 생리적인 반응으로29,30 해석되며, BJT 처리 후 추가적으로 더핵의 수가 증가한 결과는 BJT가 손상부위 및 원위 부에서의 슈반 세포 재생 및 핵의 발현을 촉진시킨 것으로 해석된다. 이러한 결과는 안7의 연구에서 보고된 BJT의 효과와 동일한 결과를 보였다.

손상 신경의 분자적 반응성을 분석하기 위하여 GAP-43 단백질의 생성을 분석하였다(Fig. 5). BJT군에서 근위부에서 강한 신호가 관찰되고 원위부로 갈수록 신호가 약해지는 것은 신경 손상 이후 BJT 처리로 손상 부위에서 신호를 역방향으로 전달하여 GAP-43을 생성하고, GAP-43의 이동 경로에 따라 정방향으로 이동하는 것으로 해석되며, GAP-43은 인산화되어 growth cone의 길이 성장에 관여하여 신경 재생 과정에 영향을 주는 것으로 생각된다.

축삭 재생 관련 인자의 활성화 변화를 분석하기 위하여 Cdc2 kinase 단백질을 western blot 분석을 하였다. 또한 신경 조직에서의 Cdc2 단백질의 분포를 관찰하기 위하여 좌골 신경 조직에 대한 면역형광염색 실험을 실시하였다(Fig. 6, 7).

Western blot 분석 상 normal군에서는 Cdc2 단백질은 관찰되지 않았으나, control군에서는 적정 수준의 Cdc2가 관찰되었으며 BJT군에서는 각각 3.96, 5.12, 6.32로 control군에 비해 Cdc2의 발현이 유의성 있게 증가하는 것으로 관찰되었다(p<0.01). 면역형광염색 상 normal군에서는 Cdc2 단백질 신호가 관찰되지 않았으며 control군에서는 손상 근위부에서 섬유상 형태로 관찰되었다. BJT군에서는 Cdc2 단백질 발현 수준은 손상 근위부와 손상 부위에서 증가하는 것으로 관찰되었으며 손상 원위부 특정부위에서 강한 단백질 신호를 나타내었다. 좌골 신경의 횡단 조직에 대해 이중 면역형광염색을 실시한 결과, 슈반세포의 지표 단백질인 S100β 신호와 완벽하게 중첩되는 것으로 확인되었다(Fig.7B). 반면 Cdc2 단백질 신호는 신경 세포에서 생성되는 NF-200 단백질에 대한 면역형광이미지와 전혀 중첩되지 않았다(Fig. 7C). 이는 Cdc2가 슈반 세포에서만 발현이 되는 것을 확인할 수 있으며, Cdc2가 세포 분열 과정에 작용하며 슈반 세포의 증식을 촉진하는 역할로 미루어 보아, BJT가 신경세포를 감싸는 슈반 세포의 재생을 유도하여 Cdc2를 발현시키고 신경 세포 재생에 양성적 영향을 주는 것으로 해석된다.

Cdc2 kinase의 활성도를 조사하기 위하여 Cdc2의 기질 단백질 중 하나인 vimentin의 인산화 수준을 조사하였다(Fig. 8, 9). estern blot 분석 결과, normal군에서는 관찰되지 않았으며 control군에서는 적정 수준의 phospho-vimentin이 생성되었다(Fig.8A, B). BJT군에서는 phospho-vimentin은 전 부위에서 뚜렷하게 관찰되었다. 좌골 신경에서의 phospho-vimentin 신호를 면역형광염색을 통해 관찰한 결과 normal군에서는 탐지되지 않았으며 control군에서는 손상 부위, 특히 손상 근위부 조직에서 관찰되었다(Fig. 9). BJT군에서는 각각 4.01, 6.41, 6.19로 control군에 비해 phospho-vimentin이 유의성 있게 증가하였고(p<0.001), 특히 손상 근위부와 원위부에서 조직 내부에서 고르게 존재하는 것으로 확인되었다. 이는 안7의 연구에서도 보고된 내용으로 본 연구의 Fig. 6, 7의 실험과 연관 지어 생각해 볼때, BJT에 의해 손상 신경의 원위부에서 슈반 세포의 재생이 일어나 Cdc2가 발현되며 이로 인해phospho-vimentin을 활성화 시키는 것으로 생각된다.

신경 손상에 따른 integrin 단백질 계열의 반응성을 분석하기 위하여 β1 integrin, Active β1 integrin, β3 integrin 단백질을 분석하였다(Fig. 10,11, 12). 먼저 β1 integrin 단백질의 경우 normal군에서는 낮은 수준으로 관찰되었다. control군에서는 손상 근위부 및 원위부에서 다소 증가된 단백질 신호가 관찰되었고 BJT군에서는 control군에 비해 β1 integrin 단백질 생성수준이 뚜렷한 변화를 나타내지 않았다. 조직 내 분포를 확인하기 위해 중첩된 image를 분석한 결과, Fig. 10B에 나타난 바와 같이 β1 integrin 신호는 세포핵의 밀집 부위에서 강한 신호를 나타내는 것으로 확인되었다. Active β1 integrin의 조직상 분포를 조사하기 위하여 신경 조직에 대한 면역형광분석을 실시하였다. Normal군에서는 Active β1 integrin이 관찰되지 않았으며, control군에서는 근위부 및 원위부를 포함한 신경조직에서 일정한 수준으로 생성되는 것으로 확인되었다(Fig. 11A). BJT군에서는 생성이 증가되어 나타났으며, 특히 원위부에서 뚜렷한 단백질 신호를 나타내는 것으로 확인되었다.

Active β1 integrin과 β1 integrin 단백질의 상대적 분포를 확인하기 위하여 두 단백질에 대한 동일 조직상에서 분석하였다. Fig. 11B에 나타난 바와 같이 active β1 integrin 단백질은 β1 integrin의 단백질 생성 부위에 모두 중첩되는 것으로 확인되었다. 이는 Cdc2에서부터 시작되는 신호가 phospho-vimentin을 발현하고 이어 integrin을 발현시키는 일련의 과정으로 생각이 되며, active β1 integrin의 경우 BJT군에서 증가된 상태로 관찰되는 것으로 보아 BJT가 신경 손상 회복에 유의한 영향을 끼치는 것으로 보인다. 다만 Fig. 10에서 면역형광분석상 β1 integrin이 세포 핵 주변에서는 강하게 신호를 보내고 있으나 BJT 투여에 따른 특이적인 소견은 관찰되지 않았는데 이는 김6, 윤8의 연구의 보고에서 BJT 가미방을 투여한 이후의 β1 integrin의 생성변화 결과와는 다소 상반되는 결과를 나타내나 Fig. 11에서 알 수 있듯이 Active β1 integrin이 활성화 되었고 Fig. 18의 결과와 함께 분석하면 integrin의 발현이 BJT 농도에 따른 차이를 보이고 있으므로 Cdc2가 발현되어 vimentin을 인산화하고, integrin을 활성화시켜 축삭 성장을 조절하는 일련의 단계31에 BJT가 양성적 영향을 주는 것으로 해석된다. 또한 향후 BJT의 농도에 따른 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

신경 손상에 따른 β3 integrin 단백질 생성 수준의 변화를 조사하였다. β1 integrin(Fig. 10)과 마찬 가지로 normal군에서는 β3 integrin 단백질 신호는 관찰되지 않았으며, control군에서는 신경 조직에 뚜렷한 단백질 신호가 관찰되었다(Fig. 12A). BJT군에서는 β3 단백질 신호가 원위부에 집중되어 있는 것으로 관찰되었다. β3 integrin을 NF-200 단백질 신호와의 중첩 이미지를 분석한 결과, 상당 부분 β3 integrin 단백질과 중첩되는 것으로 관찰되었다(Fig. 12B). 반면 일부 β3 integrin은 NF-200과 중첩되지 않는 것으로 확인되어 일부는 슈반 세포와 같은 비신경 조직에 분포하고 있음을 보였다. 이는 β3 integrin이 신경 줄기에서 발현이 되는 것으로 해석되며 BJT가 슈반 세포의 재생(Fig. 6, 7)은 물론, 신경 축삭의 재생에도 양성적인 영향을 준 것으로 해석된다.

신경 조직상의 신경 세포 혹은 비신경 세포의 활성도를 조사하기 위하여 phospho-Erk1/2 단백질 생성 수준을 관찰하였다(Fig. 13, 14). 좌골 신경조직 단백질에 대한 western blot 분석 결과 normal군에서는 전혀 관찰되지 않았고, control군에서는 약한 수준으로 관찰되었으나 BJT군에서는 높은 수준으로 관찰되었다. 면역형광염색 결과 normal군에서는 단백질 신호는 관찰되지 않았으며 control 군에서는 약한 수준으로 손상 부위 및 원위부에서 관찰되었고 BJT군에서는 손상 원위부에서 상대적으로 증가된 뚜렷한 단백질 신호가 관찰되었다. 또phospho-Erk1/2의 세포 수준에서의 분포를 조사하기 위하여 핵 염색 이미지와 중첩 분석한 결과, 많은 phospho-Erk1/2 단백질은 핵들 주변부에 위치하고 있는 것을 확인되었는데, 이는 안7의 연구에서 보고된 효과처럼 BJT군에서 control군보다 증가된 양상을 보이는 것은 BJT가 원위부로 슈반 세포를 이동 혹은 증식을 유도하여 활성화시키는 것으로 해석된다. Control군에서 관찰되는 현상은 손상 이후의 슈반 세포의 자연적인 세포 보호 반응으로 해석된다.

Phospho-Smad 단백질 생성 수준의 변화를 조사 하였다(Fig. 15). 본 실험에서 normal군에서는 phospho-Smad 단백질은 관찰되지 않았으며 control군에서는 손상 부위에서 약한 신호와 약간 더 증가 수준의 단백질 신호를 원위부에서 관찰하였다. BJT군 에서는 control군에 비해 손상부위에서 강한 단백질 신호가 유도된 것을 관찰하였다. Phospho-Smad 단백질을 Hoechst에 의하여 확인된 핵 염색 이미지와 중첩시킨 결과, phospho-Smad 단백질 신호는 핵 부위에 집중되어 있는 것을 확인하였다. 이는 BJT가 손상 부위의 세포에 작용하여 Smad 단백질을 발현시키고 Smad는 핵 안으로 들어가 신호를 전달하는 것으로 확인되며, 핵 염색 이미지와 중첩결과 단백질 신호가 핵 부위에 집중되어 있는 사실 역시 Smad가 신호를 전달하기 위해 핵으로 들어가는 과정들을 보여주고 있어 BJT가 손상 조직의 핵으로의 신호 전달 역할을 하는 것으로 보인다.

신경 손상에 따른 세포 자멸의 반응성 변화를 분석하기 위하여 조직상의 caspase 3 단백질 신호를 분석하였다(Fig. 16). 본 연구에서 normal군에서는 caspase 3는 전혀 관찰되지 않았으며 control군에서는 손상 부위 및 원위부에서 caspase 3 단백질 신호를 관찰하였다(Fig. 16). BJT군에서는 손상신경조직에서 caspase 3 생성 수준은 크게 감소하여 신경 조직에서 거의 탐지되지 않았다. 또한 caspase 3 를 조직상 핵 염색 이미지와 중첩하여 분석한 결과, caspase 3 단백질 신호는 세포핵 주변부에서 집중적으로 관찰되었다. Control군에서 caspase 3가 증가하고 핵 염색 이미지와 중첩하여 분석한 결과 핵 주변에 집중적으로 분포하는 것은 taxol처리에 의해 세포가 손상되어 apoptosis 과정을 진행시키고 있음을 의미하며 BJT군에서 caspase 3가 줄어든 것은 BJT가 apoptosis 과정을 억제하여 세포 손상을 막는 효과가 있는 것으로 생각된다. 이는 안7의 연구와 동일한 세포 보호 효과를 나타내는 결과로 해석된다.

다음으로 배양된 소뇌 세포의 taxol과 BJT 처리에 따른 변화를 조사하기 위해 phospho-Erk1/2와 β1 integrin 단백질 생성 수준을 조사하였다(Fig.17, 18). Erk1/2는 세포 외부 자극을 전달하여 세포 내 반응을 일으키는데 중요한 역할을 하는 단백질이다. 본 연구에서 normal군에서는 일정한 수준으로 관찰되던 phospho-Erk1/2가 control군에서는 감소하였다. 이는 taxol 처리로 인해 신경 세포의 증식이 저해된 것을 의미한다. BJT0.3군과 BJT0.5군에서는 normal군 수준으로 증가하는 양상을 나타내었는데, 특히 BJT0.5군에서 더욱 증가하는 양상을 보였다. 이는 BJT의 투여가 phospho-Erk1/2의 발현을 증가시키는 것으로 해석되며 농도 의존적인 경향을 보이는 것으로 관찰된다. Normal군에서도 phospho-Erk1/2가 강하게 관찰되는 것은 phospho-Erk1/2가 생체 조직의 활성도를 반영한다는 측면에서 볼 때7, 정상 조직내에 존재하던 phospho-Erk1/2 가 탐지된 것으로 생각된다.

β1 integrin의 경우, control군에서는 normal군과 비교하여 상당 수준 감소하는 것으로 관찰되었다. 이 역시 taxol의 신경 독성으로 인해 신경 세포가 손상된 것으로 관찰된다. BJT0.3군과 BJT0.5군에서는 normal군 수준으로 회복하였다. 이는 BJT가 손상된 신경 세포에 대한 보호 효과가 있는 것으로 보이며 Fig. 17과 함께 볼 때 향후 BJT 농도에 따른 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.

이상의 실험으로 BJT는 압좌 손상 후 taxol 처리한 신경 조직에서 신경 세포의 재생에 양성적 영향을 주어, 지표 단백질 발현을 유도하여 신경 재생을 촉진시키는 것으로 생각된다. 특히 BJT 및 BJT 가미방에 대한 실험적 연구를 수행한 김 등6-9의 보고와 비교해 볼 때, 물리적 화학적으로 보다 강한 자극을 주어 유도된 말초 신경병증 모델에서도 BJT가 유의하게 효과를 나타내는 것으로 해석된다. 본 실험에서 지표 단백질의 발현은 관찰하였으나 임상적으로 관찰되는 증상의 개선은 평가 하지 못하였고 항암제와의 상호작용 여부 및 암에 미치는 영향에 대한 연구는 진행되지 못하였다. 따라서 향후 암 모델에서 항암제로 유발된 말초 신경병증 실험 모델의 통각검사, 감각신경 및 운동신경의 신경 전도 검사 등의 임상 증상을 평가하고, 암의 증식에 미치는 영향, 항암제와의 상관관계, 복합 처방된 항암제로 유발된 말초신경병증에 대한 효능 등에 대하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

 

V. 결 론

압좌 손상이후 항암제 투여로 유발된 말초 신경병증 동물 모델과 소뇌 배양 세포에 보기제통탕을 투여한 결과 DRG 감각신경의 신경 돌기, 손상된 좌골신경의 신경 돌기와 슈반 세포를 증가시켰다. 또한, 손상된 좌골 신경에서 GAP-43과 Cdc2 단백질생성 촉진, Integrin 생성 촉진, phospho-vimentin와 phospho-Smad 활성화, Caspase 3의 생성 감소 등이 관찰되었고, 비신경 세포에서 phospho-Erk1/2를 활성화 시켰다. 소뇌 배양 세포에서는 phospho-Erk1/2와 β1 integrin를 활성화가 관찰되었다.

이상의 결과로 BJT가 말초 신경병증 모델과 소뇌 배양세포에 미치는 영향을 확인하였으며 향후 BJT의 기전 및 효능에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.