Blood lipid lowering effect of butanol extract from Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang

갈근황련황금탕 부탄올 추출물의 혈중에서의 지질 개선효과

  • Received : 2013.12.03
  • Accepted : 2013.12.18
  • Published : 2013.12.31

Abstract

The Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang, an officially standardized mixture of traditional herbal medicines used in Korea and China, consists of Pueraria lobata, Scullellaria baicalensis, Coptis chinensis and Glycyrrhiza uralensis at a ratio of 6:9:3:2.4. In this study, we evaluated the effect of lowering lipid accumulation in blood by treatment of Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang in Apo E(-/-) atherosclerotic animal model. ApoE/mice fed with 1.25% cholesterol, 7.5% cocoa butter and 0.5% sodium cholate diet were orally given vehicle or Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang(10, 100 and 300 mg/kg/day) for 12 weeks. Serum levels of triglyceride(TG), total cholestrerol(TC), low-density lipoprotein(LDL) and high-density lipoprotein(HDL) were analyzed, and PPAR-${\alpha}$ and PPAR-${\gamma}$ were examined by Western blotting analysis. Galkun-Whanglyeon- Whanggum-Tang decreased serum levels of TG, TC and LDL, but not HDL in ApoE/mice. In parallel, Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang treatment showed the increased activity of PPAR-${\alpha}$ and PPAR-${\gamma}$ in hepatocytes. In summary, Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang can reduce lipid accumulation in blood, and this effect might be accompanied by the upregulation of PPAR-${\alpha}$ and PPAR-${\gamma}$ in Apo E(-/-) atherosclerotic mouse model.

Keywords

재료 및 방법

갈근황련황금탕 조제 −갈근황련황금탕은 동양의학대사전의 처방에 근거하여 청주에 소재하는 한의원에서 조제 하였다. 즉, 처방의 구성비는 갈근 2돈(7.5 g), 황련 3돈(11.25 g), 황금 8푼(3 g) 및 감초 1돈(3.75 g)로 하였으며 총 조제량은 16첩 분량갈근 120 g, 황련 180 g, 황금 48 g 및 감초 60 g으로 하였다. 조제된 탕약 3,000mL을 감압농축하여 1,000 mL로 하였고, 여기에 부탄올 1,000 mL을 가하여 추출하였다. 추출된 부탄올 분획(PCS)은 감압농축 및 동결건조과정을 거쳐 분말화하여 시료로 사용하였다.

실험 동물 − 8주령(20 g)의 Apo E 유전자를 가지고 있지 않은 Apo E knockout(-/-) 수컷 마우스를 Japan SLC, Inc.에서 공급 받아 사용하였다. 1주일 동안 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암 주기 12시간이 자동 설정된 동물 사육실에서 1주간 순화 사육하여 실험을 진행하였으며, 사료와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.

고지방 식이 사료 −고지혈증 유도를 위한 고지방 식이사료(DYET#102068; Dyets Inc., Bethelehem, PA, USA)를 이용하였다.20) 식이조성은 다음과 같다. 즉 1.25% cholesterol, 7.5% cocoa butter, 0.5% sodium cholate, 탄수화물 31.4%, 섬유질 5%, 지방 40%, 단백질 11.35% 및 수분 3%로 하였다.

고지혈증 동물 모델 −고지혈증 동물모델로는 동맥경화 모델로 사용되고 있는 Apo E(-/-)마우스 모델을 이용하였다.21) 실험군은 Apo E(-/-) 마우스를 대조군, fenofibrate 투여군과 갈근황련황금탕 부탄올 추출물 투여군(10 mg/kg, 100 mg/kg 및 300 mg/kg)으로 나누었다. 고지혈증을 유도하기 위하여 제조한 고지방 식이사료를 실험기간인 12주 동안 급여하였다. 12주 종료 후에 각 개체로 부터 간을 분리하여 생화학적 분석을 실시하였다.

혈액 분석 −중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL) 및 고밀도 지질단백(HDL)을 측정하기 위하여 혈액을 분석하였다. 채혈은 안와정맥으로 주기는 1회/2주로 하였으며, 채혈 전날 밤부터는 채혈 전 까지 식이를 중단하였다. 채취한 혈액은 원심분리(2,000×g, 4℃, 15분)하여 혈청을 분리하였고, 분리한 혈청을부터의 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL) 및 고밀도 지질단백(HDL) 측정은 혈청자동분석기(Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)을 이용하였다.

PPAR-α 및 PPAR-γ 분석 −적출한 간 조직을 lysis buffer(20 mM Tris, 1 mM Na3VO4, 1 mM phenylmethylsufonyl fluoride, 50 mM NaF)에서 30분간 용해시킨 뒤 Breadford 방법으로 단백질 정량을 시행하였다. 이중 간 조직 단백질시료 50 μg을 8% SDS PAGE gel에서 전기영동한 뒤 nitrocellulose membrane에 2시간 동안 전이 한 뒤, 5%(w/v) fat-free milk powder/TBS-T로써 하룻밤 동안 blocking을 실시하였다. Blocking 후 TBS-T로써 10분씩 3번 씻어내고 난 다음 2%(w/v) fat-free BSA/TBS-T에 희석시킨 PPAR-α 및 PPAR-γ polyclonal primary antibody를 2시간 동안 처리하였고, ECL western blotting detection reagent들을 처리하여 반응을 시킨 뒤 결과를 확인하였다. 대조 단백질로는 β-tubulin을 사용하였다.

 

결 과

혈중 지질축적억제효과 −고지방 식이를 급여하여 Apo E(-/-) 마우스 모델에서 고지혈증을 유발하였고, 갈근황련황금탕의 부탄올 추출물(PCS)을 동시에 투여하여 PCS에 의한 고지혈증에 밀접한 인자인 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL) 및 고밀도 지질단백(HDL)의 변화를 측정하였다. TG의 변화: 대조군의 TG의 변화는 실험 시작 시는 154.7 mg/dl이었으나 12주 동안 고지방 식이의 급여로 221.6 mg/dl를 나타내어 약 1.4배 정도 증가되었다. PCS를 고지방 식이와 함께 농도별로 투여한 결과, 농도 의존적으로 혈중에서 TG의 감소 효과를 나타내었다. PCS 100 mg/kg과 300 mg/kg에서는 투여 6주까지는 약간 증가하는 양상을 보였으며(PCS 100 mg/kg, 0주에서 152.8 mg/dl, 6주에서 172.4 mg/dl; PCS 300 mg/kg, 0주에서 153.2 mg/dl, 6주에서 152.2 mg/dl), 그 증가 정도는 대조군 TG증가 수치를 넘지는 못하였고, 12주에는 초기 TG 수치와 비슷한 TG 수치를 나타내어(PCS 100 mg/kg, 12주에서 166.7 mg/dl; PCS 300 mg/kg, 12주에서 144.0 mg/dl) PCS의 투여가 TG의 증가를 억제시켰다(Fig 1. A).

TC의 변화: 대조군 TC의 최대 변화는 8주에서 최초 239.2 mg/dl에서 8주에서 318.3 mg/dl로 최고 치에 달하였고 실험종료 시점인 12주에서 295.7 mg/dl로 실험 최초 보다 1.2배 증가하였다. PCS 10 mg/kg과 100 mg/kg의 투여는 대조군의 TC 증가 양상과 유사하게 8주에서 최고치(PCS 10 mg/kg에서 298.2 mg/dl, PCS 100 mg/kg에서 232.0 mg/ld)를 나타내었으나, 그 이후로 감소하여 12주에서는 각각 278.5 mg/dl와 253.4 mg/dl를 나타내어 대조군의 12주 295.7 mg/dl 보다 낮은 수치를 나타내었다.

한편 PCS 300 mg/kg의 투여는 12주 동안 전혀 증가하지 않아 TC의 억제효과가 실험기간 내내 유지 되었다(Fig 1. B).

LDL의 변화: 대조군의 LDL 수치는 고지방 식이의 급여에 따라서 12주까지 계속적으로 증가 하여, 초기 118.1 mg/dl에서 209.2 mg/dl로 1.7배 증가하였다. PCS 10 mg/kg과 100 mg/kg의 투여는 대조군의 TC 증가와 같이 계속적으로 증가 양상을 나타내었으나, 두 농도 모두 대조군 대비 낮은 수치를 나타내어, LDL의 축적 억제 효과를 나타내었다. PCS 10 mg/kg 투여군에서는 초기 117.0 mg/dl에서 12주에 167.2 mg/dl를, PCS 100 mg/kg 투여군에서는 초기 119.0 mg/dl에서 12주에 150.2 mg/dl를 나타내었다. PCS 300 mg/kg에서는 2주 및 3주에서 각각 140.9 mg/dl 및 140.4 mg/dl로 초기 보다 약간 증가하였으나, 그 이후로 감소하여 12주에서는 124.5 mg/dl를 나타내었다(Fig 1. C).

HDL의 변화: Apo E(-/-) 마우스 모델에서 HDL의 수치는 고지방 식이의 급여함에 따라서 서서히 감소하였다. 대조군의 경우는 초기 245.7 mg/dl에서 12주에서는 223.6 mg/dl를 나타내었고, PCS 10 mg/kg과 100 mg/kg 투여군은 초기에서 각각 245.0 mg/dl와 245.9 mg/dl에서 12주에서 각각 230.8 mg/dl와 245.3 mg/dl를 나타내어 대조군과 같이 초기 보다 약간 감소되는 경향이 관찰되었다. PCS 300 mg/kg의 투여군에서는 대조군과는 다르게 12주에서 감소 경향이 관찰되지 않았고 12주에서는 약간의 증가된 양상(252.6 mg/dl)을 나타내었으나 그 차이는 크지 않았다(Fig 1. D).

Fig. 1.Change of serum lipid and lipoprotein by PCS treatment in Apo E[-/-] mice. A) TG(triglyceride), B) TC(total cholesterol), C) LDS(low density lipoprotein) and D) HDL(high density lipoprotein). Data are the mean±SD (n=10)

PPAR-α 및 PPAR-γ 단백질 발현량 −고지방 식이조건에서 대조군과 PCS 처리군의 간 조직에서의 고지혈증의 개선 지표라 할 수 있는 PPAR-α와 PPAR-γ의 단백질 발현량의 변화을 측정하였다. PCS의 투여에 의해서 고지방 식이를 급여한 실험동물에서 PPAR-α와 PPAR-γ의 발현 증가가 관찰되었다. PCS 10 mg/kg에서 PPAR-α와 PPAR-γ의 각각의 발현량은 4배 및 1.5배 정도 증가하였고, PCS 100mg/kg에서 각각 6배 및 4.5배 정도 증가하였고, PCS 300 mg/kg에서 각각 7배 및 4.3배 정도 증가하였다(Fig. 2). Apo E(-/-) 고지혈증 모델에서 PCS의 투여로 인하여 간에서 PPAR-α와 PPAR-γ의 발현량을 증가 시켜 혈중의 TG, TC, LDL 및 HDL의 변화에 관여하는 것으로 사료된다.

Fig. 2.Increase of the expression of PPAR-α(A) and PPAR-γ (B) in primary hepatocytes from Apo E[-/-] mice by PCS treatment. Tubulin was used as a loading control. From left to right, lane 1: control group, lane 2~4: PCS 10, 100 and 300 mg/kg. The quantitative data represent band intensity and are given as means±SD.

 

고 찰

전통적으로 한국과 중국에서 급성장염, 역리 및 소화불량 등에 사용되어 온 한가지의 약물인 갈근황련황금탕의 부탄올 추출물(PCS)이 본 시험 모델인 고지방 식이에 의한 고지혈증 모델에서 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL)의 억제 효과를 나타내었고, 고밀도 지질단백(HDL)에는 영향을 미치지 않은 결과를 나타내어 고지혈증 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 본 시험의 결과에서 제시한 바와 같이 잘 알려져 있는 고지혈증 약물인 statins, glitazone 및 fibrate 계열의 약물에서 가지고 있는 HDL의 증가보다는 LDL의 수준을 낮추는 효과22)를 PCS에서도 동일하게 관찰할 수 있었다. AMPK 활성화제인 metformin이나 PPAR-α 활성화제인 clofibrate의 경우는 간 조직에서 지방 축적을 억제하는 효과가 있는 것으로 보고되었다.23) 이러한 약물들은 PPAR-α activator들로 mitochondira와 peroxisome에서 지방산의 β-산화를 담당하는 효소들의 유전자를 촉진시킴으로써 지방산 산화를 증대하여 고지혈증 억제 효과를 나타낸다. 본 시험에서도 PCS의 경우 동일하게 PPAR-α의 활성화 효과를 나타내었으며, 추가적으로 PPAR-γ의 활성화 효과도 나타내었다. AMPK는 대사 스트레스에 의해서 활성화되는 세포 에너지 센서로 AMPK의 기능저하는 조직의 지방축적을 증가시켜 죽상동맥경화증과 같은 심혈관 질환을 일으키며, AMPK 활성화 경로는 PPAR-α의 유전자 전사를 조절하여 지방산 산화를 증대하여 지방 축적억제 효과를 나타낸다.24) 본 시험에서는 직접적으로 AMPK의 활성화 정도는 측정하지 않았으나, PCS에 의한 PPAR-α나 PPAR-γ의 활성화는 AMPK 경로가 활성화 되었음을 간접적으로 알 수 있다.

 

결 론

본 시험의 결과로 PCS의 투여에 의해서 Apo E(-/-) 고지혈증 동물모델에서 알 수 있었던 사실은 간 조직에서 PPAR-α나 PPAR-γ의 활성화로 인하여 간에서 지방축적을 억제하며, 이러한 간 조직 내에서의 지방 축적은 혈액에서의 지방축적을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 고지혈증과 고지혈증으로 인한 심혈관 질환의 억제에 유효할 것으로 사료된다.

References

  1. 조정원 (1999) 동양의학대사전, 116. 대한교과서, 서울.
  2. Tang, S. Y., Whiteman, M., Peng, Z. F., Jenner, A., Yong, E. L. and Halliwell, B. (2004) Characterization of antioxidant and antiglycation properties and isolation of active ingredients from traditional Chinese medicines. Free Radical Biology and Medicine 36: 1575-1587. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2004.03.017
  3. Rong, H., Stevens, J. F., Deinzer, M. L., Cooman, L. D. and Keukeleire, D. D. (1998) Identification of isoflavones in the roots of Pueraria lobata. Planta Medica 64: 620-627. https://doi.org/10.1055/s-2006-957534
  4. Cherdshewasart, W. and Sutjit, W. (2008) Correlation of antioxidant activity and major isoflavonoid contents of the phytoestrogen- rich Pueraria mirifica and Pueraria lobata tubers. Phytomedicine 15: 38-43. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2007.07.058
  5. Hong, T., Jin, G. B., Cho, S. and Cyong, J. C. (2002) Evaluation of the anti-inflammatory effect of baicalein on dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Planta Medica 68: 268-271. https://doi.org/10.1055/s-2002-23143
  6. Chi, Y. S., Lim, H., Park, H. and Kim, H. P. (2003) Effects of wogonin, a plant flavone from Scutellaria radix, on skin inflammation: in vivo regulation of inflammation-associated gene expression. Biochemistry and Pharmacology 66: 1271- 1278. https://doi.org/10.1016/S0006-2952(03)00463-5
  7. Huang, W. H., Lee, A. R. and Yang, C. H. (2006) Antioxidative and anti-inflammatory activities of polyhydroxyflavonoids of Scutellaria baicalensis GEORGI. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 70: 2371-2380. https://doi.org/10.1271/bbb.50698
  8. Woo, K. J., Lim, J. H., Suh, S. I., Kwon, Y. K., Shin, S. W., Kim, S. C., Choi, Y. H., Park, J. W. and Kwon, T. K. (2006)Differential inhibitory effects of baicalein and baicalin on LPS-induced cyclooxygenase-2 expression through inhibition of C/EBPbeta DNA-binding activity. Immunobiology 211: 359-368. https://doi.org/10.1016/j.imbio.2006.02.002
  9. Ye, M., Fu, S., Pi, R. and He, F. (2009) Neuropharmacological and pharmacokinetic properties of berberine: a review of recent research. Journal of Pharmacy and Pharmacology 61: 831-837. https://doi.org/10.1211/jpp.61.07.0001
  10. Lee, J. W., Iwahashi, A., Hasegawa, S. I., Yonezawa, T., Jeon, W. B., Cha, B. Y., Nagai, K., Woo, J. T., Nagai, K. and Woo, J. T. (2012) Coptisine inhibits RANKL-induced NF-${\kappa}B$ phosphorylation in osteoclast precursors and suppresses function through the regulation of RANKL and OPG gene expression in osteoblastic cells. Journal of Natural Medicine 66: 8-16. https://doi.org/10.1007/s11418-011-0537-7
  11. Kasai, A., Hiramatsu, N., Hayakawa, K., Yao, J. and Kitamura, M. (2008) Blockade of the dioxin pathway by herbal medicine formula bupleuri minor: identification of active entities for suppression of AhR activation. Biological and Pharmaceutical Bulletin 31: 838-846. https://doi.org/10.1248/bpb.31.838
  12. Wang, C. Y., Kao, T. C., Lo, W. H. and Yen, G. C. (2011) Glycyrrhizic acid and 18b-glycyrrhetinic acid modulate the lipopolysaccharide-induced inflammatory response by the suppression of NF-${\kappa}B$ through PI3K $p110{\delta}$ and p110 inhibitions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 7726-7733. https://doi.org/10.1021/jf2013265
  13. Hwang, W. M., Bae, J. H., Kim, K. Y. and Synn, Y. C. (2005) Impacts of atherosclerotic coronary risk factors on atherosclerotic surrogates in patients with coronary artery disease. Korean Circulation Journal 35: 131-139. https://doi.org/10.4070/kcj.2005.35.2.131
  14. Yan, L. P., Chan, S. W., Chan, A. S., Chen, S. L., Ma, X. J. and Xu, H. X. (2006) Puerarin decreases serum total cholesterol and enhances thoracic aorta endothelial nitric oxide synthase expression in diet-induced hypercholesterolemic rats. Life Sciences 79: 324-330. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2006.01.016
  15. Sieveking, D. P., Woo, K. S., Fung, K. P., Lundman, P., Nakhla, S. and Celermajer, D. S. (2005) Chinese herbs Danshen and Gegen modulate key early atherogenic events in vitro. International Journal of Cardiology 105: 40-45. https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2004.10.052
  16. Peng, C. Y., Pan, S. L., Huang, Y. W., Guh, J. H., Chang, Y. L. and Teng, C. M. (2008) Baicalein attenuates intimal hyperplasia after rat carotid balloon injury through arresting cellcycle progression and inhibiting ERK, Akt, and NF-kappa B activity in vascular smooth-muscle cells. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 378: 579-588. https://doi.org/10.1007/s00210-008-0328-1
  17. Liang, K. W., Ting, C. T., Yin, S. C., Chen, Y. T., Lin, S. J., Liao, J. K. and Hsu, S. L. (2006) Berberine suppresses MEK/ ERK-dependent Egr-1 signaling pathway and inhibits vascular smooth muscle cell regrowth after in vitro mechanical injury. Biochemistry and Pharmacology 71: 806-817. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2005.12.028
  18. Wang, Q., Zhang, M., Liang, B., Shirwany, N., Zhu, Y. and Zou, M. H. (2011) Activation of AMP-activated protein kinase is required for berberine-induced reduction of atherosclerosis in mice: the role of uncoupling protein 2. PLoS One 6: e25436. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025436
  19. Kim, W. S., Lee, Y. S., Cha, S. H., Jeong, H. W., Choe, S. S., Lee, M. R., Oh, G. T., Park, H. S., Lee, K. U., Lane, M. D. and Kim, J. B. (2009) Berberine improves lipid dysregulation in obesity by controlling central and peripheral AMPK activity. American Journal of Physiological Endocrinology Metabolism 296: E812-E819. https://doi.org/10.1152/ajpendo.90710.2008
  20. Guo, Y., Zhang, C., Du, X., Nair, U. and Yoo, T. J. (2005) Morphological and functional alterations of the cochlea in apolipoprotein E gene deficient mice. Hearing Research 208: 54-67. https://doi.org/10.1016/j.heares.2005.05.010
  21. Zadelaar, S., Kleemann, R., Verschuren, L., de Vries-Van der Weij, J., van der Hoorn, J., Princen, H. M. and Kooistra, T. (2007) Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 27: 1706-1721. https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.107.142570
  22. de Vries, R., Dikkeschei, B. D., Sluiter, W. J., Dallinga-Thie, G. M., van Tol, A. and Dullaart, R. P. (2012) Statin and fibrate combination does not additionally lower plasma cholesteryl ester transfer in type 2 diabetes mellitus. Clinical Laboratory. 58: 1231-1239.
  23. Akbiyik, F., Cinar, K., Demirpence, E., Ozsullu, T., Tunca, R., Haziroglu, R., Yurdaydin, C., Uzunalimoglu, O. and Bozkaya, H. (2004) Ligand-induced expression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha and activation of fatty acid oxidation enzymes in fatty liver. European Journal of Clinical Investigation 34: 429-435. https://doi.org/10.1111/j.1365-2362.2004.01359.x
  24. Lee, W. J., Kim, M., Park, H. S., Kim, H. S., Jeon, M. J., Oh, K. S., Koh, E. H., Won, J. C., Kim, M. S., Oh, G. T., Yoon, M., Lee, K. U. and Park, J. Y. (2006) AMPK activation increases fatty acid oxidation in skeletal muscle by activating PPARalpha and PGC-1. Biochemical and Biophysical Research Communications 340: 291-295. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2005.12.011