Blood lipid lowering effect of butanol extract from Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang

갈근황련황금탕 부탄올 추출물의 혈중에서의 지질 개선효과

Abstract

The Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang, an officially standardized mixture of traditional herbal medicines used in Korea and China, consists of Pueraria lobata, Scullellaria baicalensis, Coptis chinensis and Glycyrrhiza uralensis at a ratio of 6:9:3:2.4. In this study, we evaluated the effect of lowering lipid accumulation in blood by treatment of Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang in Apo E(-/-) atherosclerotic animal model. ApoE/mice fed with 1.25% cholesterol, 7.5% cocoa butter and 0.5% sodium cholate diet were orally given vehicle or Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang(10, 100 and 300 mg/kg/day) for 12 weeks. Serum levels of triglyceride(TG), total cholestrerol(TC), low-density lipoprotein(LDL) and high-density lipoprotein(HDL) were analyzed, and PPAR-${\alpha}$ and PPAR-${\gamma}$ were examined by Western blotting analysis. Galkun-Whanglyeon- Whanggum-Tang decreased serum levels of TG, TC and LDL, but not HDL in ApoE/mice. In parallel, Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang treatment showed the increased activity of PPAR-${\alpha}$ and PPAR-${\gamma}$ in hepatocytes. In summary, Galkun-Whanglyeon-Whanggum-Tang can reduce lipid accumulation in blood, and this effect might be accompanied by the upregulation of PPAR-${\alpha}$ and PPAR-${\gamma}$ in Apo E(-/-) atherosclerotic mouse model.

재료 및 방법

갈근황련황금탕 조제 −갈근황련황금탕은 동양의학대사전의 처방에 근거하여 청주에 소재하는 한의원에서 조제 하였다. 즉, 처방의 구성비는 갈근 2돈(7.5 g), 황련 3돈(11.25 g), 황금 8푼(3 g) 및 감초 1돈(3.75 g)로 하였으며 총 조제량은 16첩 분량갈근 120 g, 황련 180 g, 황금 48 g 및 감초 60 g으로 하였다. 조제된 탕약 3,000mL을 감압농축하여 1,000 mL로 하였고, 여기에 부탄올 1,000 mL을 가하여 추출하였다. 추출된 부탄올 분획(PCS)은 감압농축 및 동결건조과정을 거쳐 분말화하여 시료로 사용하였다.

실험 동물 − 8주령(20 g)의 Apo E 유전자를 가지고 있지 않은 Apo E knockout(-/-) 수컷 마우스를 Japan SLC, Inc.에서 공급 받아 사용하였다. 1주일 동안 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암 주기 12시간이 자동 설정된 동물 사육실에서 1주간 순화 사육하여 실험을 진행하였으며, 사료와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.

고지방 식이 사료 −고지혈증 유도를 위한 고지방 식이사료(DYET#102068; Dyets Inc., Bethelehem, PA, USA)를 이용하였다.20) 식이조성은 다음과 같다. 즉 1.25% cholesterol, 7.5% cocoa butter, 0.5% sodium cholate, 탄수화물 31.4%, 섬유질 5%, 지방 40%, 단백질 11.35% 및 수분 3%로 하였다.

고지혈증 동물 모델 −고지혈증 동물모델로는 동맥경화 모델로 사용되고 있는 Apo E(-/-)마우스 모델을 이용하였다.21) 실험군은 Apo E(-/-) 마우스를 대조군, fenofibrate 투여군과 갈근황련황금탕 부탄올 추출물 투여군(10 mg/kg, 100 mg/kg 및 300 mg/kg)으로 나누었다. 고지혈증을 유도하기 위하여 제조한 고지방 식이사료를 실험기간인 12주 동안 급여하였다. 12주 종료 후에 각 개체로 부터 간을 분리하여 생화학적 분석을 실시하였다.

혈액 분석 −중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL) 및 고밀도 지질단백(HDL)을 측정하기 위하여 혈액을 분석하였다. 채혈은 안와정맥으로 주기는 1회/2주로 하였으며, 채혈 전날 밤부터는 채혈 전 까지 식이를 중단하였다. 채취한 혈액은 원심분리(2,000×g, 4℃, 15분)하여 혈청을 분리하였고, 분리한 혈청을부터의 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL) 및 고밀도 지질단백(HDL) 측정은 혈청자동분석기(Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)을 이용하였다.

PPAR-α 및 PPAR-γ 분석 −적출한 간 조직을 lysis buffer(20 mM Tris, 1 mM Na3VO4, 1 mM phenylmethylsufonyl fluoride, 50 mM NaF)에서 30분간 용해시킨 뒤 Breadford 방법으로 단백질 정량을 시행하였다. 이중 간 조직 단백질시료 50 μg을 8% SDS PAGE gel에서 전기영동한 뒤 nitrocellulose membrane에 2시간 동안 전이 한 뒤, 5%(w/v) fat-free milk powder/TBS-T로써 하룻밤 동안 blocking을 실시하였다. Blocking 후 TBS-T로써 10분씩 3번 씻어내고 난 다음 2%(w/v) fat-free BSA/TBS-T에 희석시킨 PPAR-α 및 PPAR-γ polyclonal primary antibody를 2시간 동안 처리하였고, ECL western blotting detection reagent들을 처리하여 반응을 시킨 뒤 결과를 확인하였다. 대조 단백질로는 β-tubulin을 사용하였다.

 

결 과

혈중 지질축적억제효과 −고지방 식이를 급여하여 Apo E(-/-) 마우스 모델에서 고지혈증을 유발하였고, 갈근황련황금탕의 부탄올 추출물(PCS)을 동시에 투여하여 PCS에 의한 고지혈증에 밀접한 인자인 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL) 및 고밀도 지질단백(HDL)의 변화를 측정하였다. TG의 변화: 대조군의 TG의 변화는 실험 시작 시는 154.7 mg/dl이었으나 12주 동안 고지방 식이의 급여로 221.6 mg/dl를 나타내어 약 1.4배 정도 증가되었다. PCS를 고지방 식이와 함께 농도별로 투여한 결과, 농도 의존적으로 혈중에서 TG의 감소 효과를 나타내었다. PCS 100 mg/kg과 300 mg/kg에서는 투여 6주까지는 약간 증가하는 양상을 보였으며(PCS 100 mg/kg, 0주에서 152.8 mg/dl, 6주에서 172.4 mg/dl; PCS 300 mg/kg, 0주에서 153.2 mg/dl, 6주에서 152.2 mg/dl), 그 증가 정도는 대조군 TG증가 수치를 넘지는 못하였고, 12주에는 초기 TG 수치와 비슷한 TG 수치를 나타내어(PCS 100 mg/kg, 12주에서 166.7 mg/dl; PCS 300 mg/kg, 12주에서 144.0 mg/dl) PCS의 투여가 TG의 증가를 억제시켰다(Fig 1. A).

TC의 변화: 대조군 TC의 최대 변화는 8주에서 최초 239.2 mg/dl에서 8주에서 318.3 mg/dl로 최고 치에 달하였고 실험종료 시점인 12주에서 295.7 mg/dl로 실험 최초 보다 1.2배 증가하였다. PCS 10 mg/kg과 100 mg/kg의 투여는 대조군의 TC 증가 양상과 유사하게 8주에서 최고치(PCS 10 mg/kg에서 298.2 mg/dl, PCS 100 mg/kg에서 232.0 mg/ld)를 나타내었으나, 그 이후로 감소하여 12주에서는 각각 278.5 mg/dl와 253.4 mg/dl를 나타내어 대조군의 12주 295.7 mg/dl 보다 낮은 수치를 나타내었다.

한편 PCS 300 mg/kg의 투여는 12주 동안 전혀 증가하지 않아 TC의 억제효과가 실험기간 내내 유지 되었다(Fig 1. B).

LDL의 변화: 대조군의 LDL 수치는 고지방 식이의 급여에 따라서 12주까지 계속적으로 증가 하여, 초기 118.1 mg/dl에서 209.2 mg/dl로 1.7배 증가하였다. PCS 10 mg/kg과 100 mg/kg의 투여는 대조군의 TC 증가와 같이 계속적으로 증가 양상을 나타내었으나, 두 농도 모두 대조군 대비 낮은 수치를 나타내어, LDL의 축적 억제 효과를 나타내었다. PCS 10 mg/kg 투여군에서는 초기 117.0 mg/dl에서 12주에 167.2 mg/dl를, PCS 100 mg/kg 투여군에서는 초기 119.0 mg/dl에서 12주에 150.2 mg/dl를 나타내었다. PCS 300 mg/kg에서는 2주 및 3주에서 각각 140.9 mg/dl 및 140.4 mg/dl로 초기 보다 약간 증가하였으나, 그 이후로 감소하여 12주에서는 124.5 mg/dl를 나타내었다(Fig 1. C).

HDL의 변화: Apo E(-/-) 마우스 모델에서 HDL의 수치는 고지방 식이의 급여함에 따라서 서서히 감소하였다. 대조군의 경우는 초기 245.7 mg/dl에서 12주에서는 223.6 mg/dl를 나타내었고, PCS 10 mg/kg과 100 mg/kg 투여군은 초기에서 각각 245.0 mg/dl와 245.9 mg/dl에서 12주에서 각각 230.8 mg/dl와 245.3 mg/dl를 나타내어 대조군과 같이 초기 보다 약간 감소되는 경향이 관찰되었다. PCS 300 mg/kg의 투여군에서는 대조군과는 다르게 12주에서 감소 경향이 관찰되지 않았고 12주에서는 약간의 증가된 양상(252.6 mg/dl)을 나타내었으나 그 차이는 크지 않았다(Fig 1. D).

Fig. 1.Change of serum lipid and lipoprotein by PCS treatment in Apo E[-/-] mice. A) TG(triglyceride), B) TC(total cholesterol), C) LDS(low density lipoprotein) and D) HDL(high density lipoprotein). Data are the mean±SD (n=10)

PPAR-α 및 PPAR-γ 단백질 발현량 −고지방 식이조건에서 대조군과 PCS 처리군의 간 조직에서의 고지혈증의 개선 지표라 할 수 있는 PPAR-α와 PPAR-γ의 단백질 발현량의 변화을 측정하였다. PCS의 투여에 의해서 고지방 식이를 급여한 실험동물에서 PPAR-α와 PPAR-γ의 발현 증가가 관찰되었다. PCS 10 mg/kg에서 PPAR-α와 PPAR-γ의 각각의 발현량은 4배 및 1.5배 정도 증가하였고, PCS 100mg/kg에서 각각 6배 및 4.5배 정도 증가하였고, PCS 300 mg/kg에서 각각 7배 및 4.3배 정도 증가하였다(Fig. 2). Apo E(-/-) 고지혈증 모델에서 PCS의 투여로 인하여 간에서 PPAR-α와 PPAR-γ의 발현량을 증가 시켜 혈중의 TG, TC, LDL 및 HDL의 변화에 관여하는 것으로 사료된다.

Fig. 2.Increase of the expression of PPAR-α(A) and PPAR-γ (B) in primary hepatocytes from Apo E[-/-] mice by PCS treatment. Tubulin was used as a loading control. From left to right, lane 1: control group, lane 2~4: PCS 10, 100 and 300 mg/kg. The quantitative data represent band intensity and are given as means±SD.

 

고 찰

전통적으로 한국과 중국에서 급성장염, 역리 및 소화불량 등에 사용되어 온 한가지의 약물인 갈근황련황금탕의 부탄올 추출물(PCS)이 본 시험 모델인 고지방 식이에 의한 고지혈증 모델에서 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백(LDL)의 억제 효과를 나타내었고, 고밀도 지질단백(HDL)에는 영향을 미치지 않은 결과를 나타내어 고지혈증 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 본 시험의 결과에서 제시한 바와 같이 잘 알려져 있는 고지혈증 약물인 statins, glitazone 및 fibrate 계열의 약물에서 가지고 있는 HDL의 증가보다는 LDL의 수준을 낮추는 효과22)를 PCS에서도 동일하게 관찰할 수 있었다. AMPK 활성화제인 metformin이나 PPAR-α 활성화제인 clofibrate의 경우는 간 조직에서 지방 축적을 억제하는 효과가 있는 것으로 보고되었다.23) 이러한 약물들은 PPAR-α activator들로 mitochondira와 peroxisome에서 지방산의 β-산화를 담당하는 효소들의 유전자를 촉진시킴으로써 지방산 산화를 증대하여 고지혈증 억제 효과를 나타낸다. 본 시험에서도 PCS의 경우 동일하게 PPAR-α의 활성화 효과를 나타내었으며, 추가적으로 PPAR-γ의 활성화 효과도 나타내었다. AMPK는 대사 스트레스에 의해서 활성화되는 세포 에너지 센서로 AMPK의 기능저하는 조직의 지방축적을 증가시켜 죽상동맥경화증과 같은 심혈관 질환을 일으키며, AMPK 활성화 경로는 PPAR-α의 유전자 전사를 조절하여 지방산 산화를 증대하여 지방 축적억제 효과를 나타낸다.24) 본 시험에서는 직접적으로 AMPK의 활성화 정도는 측정하지 않았으나, PCS에 의한 PPAR-α나 PPAR-γ의 활성화는 AMPK 경로가 활성화 되었음을 간접적으로 알 수 있다.

 

결 론

본 시험의 결과로 PCS의 투여에 의해서 Apo E(-/-) 고지혈증 동물모델에서 알 수 있었던 사실은 간 조직에서 PPAR-α나 PPAR-γ의 활성화로 인하여 간에서 지방축적을 억제하며, 이러한 간 조직 내에서의 지방 축적은 혈액에서의 지방축적을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 고지혈증과 고지혈증으로 인한 심혈관 질환의 억제에 유효할 것으로 사료된다.