Phellinus linteus의 균사체 액상배양에서 단백다당체(β-D-glucan)의 생산성 향상을 위한 균주 개량과 배양형태 조절의 중요성

Importance of Strain Improvement and Control of Fungal cells Morphology for Enhanced Production of Protein-bound Polysaccharides(β-D-glucan) in Suspended Cultures of Phellinus linteus Mycelia

본 연구에서는 Phellinus linteus 균사체의 액상배양을 통한 면역증강 생리활성 효능의 단백다당체 생산공정을 개발하기 위한 시도로서, 우선 생산균체의 원형질체 형성을 통한 고생산성 균주를 개발하고자 하였으며, 발효기 액상배양 시 최적 배양형태의 유도를 통해 균사체와 단백다당체의 생산성을 극대화하고자 하였다. 본 연구실에서 채취한 생산 균주를 ITS rDNA sequencing 방법과 blast search 방법에 의해 조사한 결과 다양한 Phellinus linteus 종들과 99.67% 이상의 유사성 확인되어, 이 균주를 Phellinus linteus라고 최종적으로 동정할 수 있었다. 이 동정된 균주로부터 균주 개량을 시도하기 위해 Phellinus linteus 균사체로부터 대량의 원형질체 형성 및 재생에 의한 단일 콜로니 획득 방법을 개발함으로써 균주를 신속하게 개량할 수 있었다. Sorbitol을 이용한 banding filtration 방법을 이용하여 원형질체를 회수한 결과 $10^5{\sim}10^6\;protoplasts/ml$를 얻을 수 있었으며, 원형질체 재생률은 $10^{-2}{\sim}10^{-3}$로 나타났다. 균주개량을 위해 원형질체 재생배지와 고체배양배지에서 고성장성 및 고안정성을 보이는 균주들을 지속적으로 대량 선별하여, 액상 생산배양을 수행하였다. 그 결과 균사체량은 13~15 g/L로 대부분 비슷하게 자랐으며, 조단백다당체의 함량 또한 5.8~6.4%로 거의 비슷하게 분포하는 것으로 나타났는데, 이로부터 고체배양배지에서 빠른 성장속도를 보여주는 균주들이 대부분 액상 생산배양에서도 고생산성 및 고안정성을 보여주는 것을 확인할 수 있었다. 한편 Phellinus linteus 균사체의 경우 조단백다당체의 함량이 세포 무게당 거의 일정한 양을 함유하고 있는 것으로 확인되었으므로, 조단백다당체의 생산성을 증가시키기 위해서는 최종 생산배양에서의 균체량 증가가 가장 중요한 것으로 판단되어, 균사형성 고등균류의 균사체 배양 시 균체량 증가에 가장 중요한 요인 중의 하나인 생산균주의 배양형태적 특성에 대해 집중적으로 조사하였다. 균주개량 실험을 통해 고생산성 균주로 최종 결정된 AR147 균주를 이용해서 다양한 배양조건에서 발효조 배양을 수행한 결과, 최종 생산발효조로의 접종원이 고농도의 균사모양인 경우에 생산균주의 배양형태가 매우 작은 compact한 펠렛 모양(대부분 직경 0.5 mm 이하)을 유지하는, 이상적인 균사체 액상배양 공정이 이루어지는 것으로 확인되었다. 즉 생산 발효조배양에서 직경 0.5 mm 이하의 compact한 펠렛 모양의 배양형태가 유도되었을 경우, lag phase 시간의 획기적 감소와 1.5배 이상의 높은 세포비성장속도로 인해, 최종 균사체생산성이 다른 배양형태를 유도한 경우에 비해 약 3.3배 더 높은 주목할 만한 배양결과를 얻을 수 있었다. 이로부터 균사 형성 Phellinus linteus의 산업용 발효조 배양 시, 각 배양단계에서의 생산균체의 배양형태가 최종 균체생산성, 궁극적으로는 최종 단백다당체의 생산성에 심각한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

Strain improvement and morphology investigation in bioreactor cultures were undertaken in suspended cultures of Phellinus linteus mycelia for mass production of protein-bound polysaccharides(soluble ${\beta}$-D-glucan), a powerful immuno-stimulating agent. Phellineus sp. screened for this research was identified as Phellinus linteues through ITS rDNA sequencing method and blast search, demonstrating 99.7% similarity to other Phellinus linteus strains. Intensive strain improvement program was carried out by obtaining large amounts of protoplasts for the isolation of single cell colonies. Rapid and large screening of high-yielding producers was possible because large numbers of protoplasts ($1{\times}10^5{\sim}10^6\;protoplasts/ml$) formed using the banding filtration method with the cell wall-disrupting enzymes could be regenerated in relatively high regeneration frequency($10^{-2}{\sim}10^{-3}$) in the newly developed regeneration medium. It was demonstrated that the strains showing high performances in the protoplast regeneration and solid growth medium were able to produce 5.8~6.4%(w/w) of ${\beta}$-D-glucan and 13~15 g/L of biomass in stable manners in suspended shake-flask cultures of P. linteus mycelia. In addition, cell mass increase was observed to be the most important in order to enhance ${\beta}$-D-glucan productivity during the course of strain improvement program, since the amount of ${\beta}$-D-glucan extracted from the cell wall of P. linteus mycelia was almost constant on the unit biomass basis. Therefore we fully investigated the fungal cell morphology, generally known as one of the key factors affecting cell growth extent in the bioreactor cultures of mycelial fungal cells. It was found that, in order to obtain as high cell mass as possible in the final production bioreactor cultures, the producing cells should be proliferated in condensed filamentous forms in the growth cultures, and optimum amounts of these filamentous cells should be transferred as active inoculums to the production bioreactor. In this case, ideal morphologies consisting of compacted pellets less than 0.5mm in diameter were successfully induced in the production cultures, resulting in shorter period of lag phase, 1.5 fold higher specific cell growth rate and 3.3 fold increase in the final biomass production as compared to the parallel bioreactor cultures of different morphological forms. It was concluded that not only the high-yielding but also the good morphological characteristics led to the significantly higher biomass production and ${\beta}$-D-glucan productivity in the final production cultures.