Microbiology and Biotechnology Letters (한국미생물·생명공학회지)

The Korean Society for Microbiology and Biotechnology (한국미생물·생명공학회)
권호 표지

Screening of the Genes Expressed in Pichia pastoris Grown in Phosphate-Limited Chemostat Culture

인산제한상태에서 발현되는 Pichia pastoris 유래 유전자 탐색

  • 홍지연 (한국생명공학연구원 산업화공정개발실) ;
  • 안정오 (한국생명공학연구원 산업화공정개발실) ;
  • 박명수 (한국생명공학연구원 산업화공정개발실) ;
  • 최순용 (한남대학교 생명공학부) ;
  • 최의성 (한국생명공학연구원 시스템미생물연구센터) ;
  • 정준기 (한국생명공학연구원 산업화공정개발실) ;
  • 이홍원 (한국생명공학연구원 산업화공정개발실)
  • Published : 2007.12.28
Download PDF
⟨ Previous Next ⟩

Abstract

The physiological responses of microorganisms to specific nutrient limitation can be regulated at the transcriptional levels. In this study, in order to develop the Pichia pastoris-derived promoter inducible by nutrient-limited condition, we constructed cDNA libraries using RT-PCR of total RNA from P. pastoris in steady-states of phosphate-limited chemostat with different dilution rates. Various genes were detected from cDNA library. Among these genes, the gene encoding putative sodium/phosphate ($Na^+$/Pi) symporter (NPS), high affinity transporter of phosphate, was detected. It was observed that expression of NPS increased in a manner specific to phosphate-limited condition through Northern blot. Therefore, it is thought that the promoter from NPS gene may have the potential as auto-inducible promoter by phosphate-limited culture condition without inducer.

P. pastoris는 대장균에 비해 정확한 접힘, 당화, 효율적인 분비기작등의 장점을 가지고 있어 재조합 단백질의 생산을 위한 균주로서 관심을 받고 있다. 또한 재조합 단백질의 효율적인 생산공정 개발을 위하여 배양공정 중 특정 시간이나 조건에서 발현될 수 있는 효율적인 유도성 프로모터의 개발도 중요 관심 분야이다. 본 연구에서는 연속배양을 이용하여 P. pastoris의 배양 중 특정 기질이 소모되었을 때 발현되는 자동 유도성 프로모터를 개발하기 위하여, 인산이 고갈되었을 때 과발현 되는 유전자들을 탐색하였다. 인산 제한 연속배양의 정상상태에서 얻어진 균체로 부터 total RNA와 mRNA를 분리하였고, 이로부터 cDN를 합성하여 인산제한조건에서 과발현되는 유전자들을 확보하였다. 그 중 빈도수가 높은 8종의 유전자 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), glucokinase, thiol-specific antioxidant protein, triosephosphate isomerase, sodium/phosphate symporter(NPS) 그리고 pyruvate decarboxylase를 선별하였고, Northern blot analysis를 수행한 결과 인산 섭취에 관련된 NPS 유전자가 인산제한조건에서 과발현 됨을 확인하였다. 본 연구실에서는 자동유도성 프로모터로서 NPS유래의 프로모터의 잠재성을 알아보기 위하여, 관련 유전자를 확보하여 외래 유전자를 이용한 발현연구를 진행 중이다.

Keywords

References

  1. Ahn, J. O, J. Y. Hong, H. W. Lee, M. S. Park, E. GLee, C. S. Kim, E. S. Choi, J. K. Jung, and H. W. Lee. 2007. Translation elongation factor l-a gene from Pichia pastoris: molecular cloning, sequence, and use of its promoter. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74: 601-608 https://doi.org/10.1007/s00253-006-0698-6
  2. Ambudkar, S. V., V. Anantharam, and P. C. Maloney. 1990. UhpT, the sugar phosphate antipoter of Escherchia coli, functions as a monomer. J. Biol. Chem. 265: 12287-12292
  3. Cregg, J. M., K. R. Madden, K. J. Barringer, G. P. Thill, and C. A. Stillman. 1989. Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris. Mol. Cell. BioI. 9: 1316-1323 https://doi.org/10.1128/MCB.9.3.1316
  4. Egli, T., M. van Dijken, W. Harder, and A. Fiechter. 1980. Methanol metabolism in yeast: regulation of the synthesis of catabolic enzymes. Arch. Microbiol. 124: 115-121 https://doi.org/10.1007/BF00427715
  5. Ellis, S. B., P. F. Brust, P. J. Koutz, A. F. Waters, M. M. Harpold, and T. R. Gingeras. 1985. Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris. Mol. Cell. BioI. 5: 1111-1121 https://doi.org/10.1128/MCB.5.5.1111
  6. J. L. Cereghino and J. M. Cregg. 2000. Heterologous protein expression in the methylophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Reviews. 24: 45-66 https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x
  7. Kim, T. H., J. K. Jung, S. S. Kwak, S. W. Nam, M. J. Chun, and Y. H. Park. 2002. Heterologous expression and secretion of sweet potato peroxidase isoenzyme Al in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett. 24: 279-286 https://doi.org/10.1023/A:1014053807643
  8. Mark, E. Schmitt, A. Timothy, A. Brown, and L. T. Bernard. 1990. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18: 3091 https://doi.org/10.1093/nar/18.10.3091
  9. Masanori, B. Y., N. Mamoru, H. Satoshi, and O. Yasuji. 1991. The PHO84 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes an inorganic phosphate transporter. Mol. Cell. Biol. 11: 3229-3238 https://doi.org/10.1128/MCB.11.6.3229
  10. Shen S., G. Sulter, T.W. Jeffries, and J.M. Cregg. 1998. A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. Gene. 216: 93-102 https://doi.org/10.1016/S0378-1119(98)00315-1
  11. Berberich T. and T. Kusano. 1997. Cycloheximide induces a subset of low temperature inducible genes in maize. Mol. Genet. Genomics. 254: 275-283 https://doi.org/10.1007/s004380050416
  12. Tina N. S. and P. Merja. 1995. Production of Trichoderma reesei cellulases on glucose-containing media. Appl. Environ. Microbiol. 61: 3650-3655
  13. Tschopp, J. F., P. F. Brust, J. M. Cregg, C. A. Stillman, C. A., and T. R. Gingeras. 1987. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. Nucleic Acids Res. 15: 3859 - 3876 https://doi.org/10.1093/nar/15.9.3859
  14. Veenhuis, M., M. V. Dijken, and W. Harder. 1983. The significance of peroxisomes in the metabolism of onecarbon compounds in yeast. Adv. Microb. Physiol. 24: 1-82 https://doi.org/10.1016/S0065-2911(08)60384-7
  15. Viktor M. B., H.W. Johannes, T. P. Jack, and D.W. Piper. Matthew. 2002. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 31: 3265
  16. Waterham, H. R., M. E. Digan, P. J. Koutz, S. V. Lair, and J. M. Cregg. 1997. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene regulation and use of its promoter. Gene. 186: 37-44 https://doi.org/10.1016/S0378-1119(96)00675-0
  17. 피키아 유래의 NPS 프로모터 및 이를 이용한 이종단백질의 제조방법, 대한민국특허, 717353